一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺的制作方法与工艺

本发明属于农副产品精深加工的技术领域，特别涉及一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺。

背景技术：
草菇是世界上重要的栽培食用菌，其总产量在世界四大栽培食用菌中居第三位，我国草菇年产量3万多吨，占全世界总产量的70％～80％，居世界之首。草菇是食用菌中最不易保鲜贮藏的菇类，采后的后熟作用非常强烈，且采收期的气温较高，又不能在较低温度下贮藏，这些因素制约了新鲜草菇的流通和大规模生产。人体内的自由基会引起生物细胞氧化性损伤，进而诱发癌症、衰老、心血管疾病等慢性病。鉴于传统合成的抗氧化剂(BHT、BHA)存在毒性和不安全性，而在人们长期食用的食品中，天然抗氧化剂成分的毒性远远低于人工合成的抗氧化剂，因此，近年来从自然界寻求天然抗氧化剂的研究日益受到重视。对草菇中的抗氧化活性成分已有一些报道。李乐等研究证明草菇的甲醇和水的粗提物具有自由基清除和抑制大鼠红细胞溶血的作用。孙延芳等采用微波辅助提取对草菇的多酚含量及抗氧化活性进行研究，结果表明草菇多酚均具有很强的抗氧化能力。Cheung等采用3种不同方法测定了草菇的甲醇提取物和水提取物的抗氧化活性，发现水提取物中总酚含量高于甲醇提取物，其抗氧化活性也高于甲醇提取物。赵俊霞等用不同有机溶剂对草菇培养液及菌丝体中的代谢成分进行分离提取，代谢提取物均有较高的DPPH·清除率，即较高的抗氧化活性，其有效成分含有粗三萜和黄酮类物质。多糖是食用菌中重要的药理成分之一。近年研究表明，多糖除了具有抗衰老、抗病毒、抗癌、免疫调节等功能作用外，还具有抗氧化作用。草菇多糖抗氧化活性的研究目前还未见报道。抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺，加强草菇开发出系列的深加工产品，改变单一的产品结构，延伸产业链，满足不同的消费群体，扩大市场的需求。

技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是提供了一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺。技术方案：本发明提供的一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺，该工艺包括草菇预处理、粉碎、酶法提取及酶灭活、离心、超滤法分离、浓缩、干燥得到抗氧化草菇多糖，其中，通过采用纤维素酶提取和多次超滤分离获得了多糖样品液。一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺，该工艺包括以下步骤：1)草菇预处理：通过干制得到烘干后的草菇，然后进行脱脂得到脱脂草菇；2)粉碎：将步骤1)中脱脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶灭活：通过在草菇粉粒中加入纤维素酶酶解后再升温灭活得到物料；4)离心：将步骤3)中物料降温至20-40℃，离心，转速为3000-4000r/min，离心时间5-10min，弃沉淀，取清液备用；5)超滤法分离：通过超滤分离方法得到截流液为分子量大于100KD和分子量为5-10KD的多糖样品液；6)浓缩：在步骤5)所述的截流液中分别缓缓加入95％乙醇，加入乙醇过程中不断搅拌，混合液中乙醇质量浓度控制在70％-80％，静置沉淀6-24小时后，虹吸上清液至原体积1/5-1/10，下部液体进行离心分离，转速为3500-4000r/min，离心时间10-15min；7)干燥：在步骤6)所述的沉淀，50-70℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷冻干燥机冻干，含水量低于4％，即得草菇多糖。其中，上述步骤3)酶法提取及酶灭活具体步骤为：草菇粉粒中加入20-30倍草菇重量的水，然后加入0.3％-0.35％纤维素酶，料温保持50℃-55℃，搅拌，维持温度90-120min后，将物料升温至90-100℃，维持5-10min灭活后将得到的物料备用。纤维素酶法提取草菇多糖对·OH和DPPH·有较强的清除作用及还原能力，均高于热水提取法提取的草菇多糖。其中，上述步骤5)超滤法分离具体步骤为：将截留分子量为5KD的膜组件组装于超滤设备，在25℃，入口压力2～5kg/m2，出入口压差不要超过1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖样品液；透过液得到分子量小于5KD的多糖溶液，将分子量大于5KD的多糖溶液经截留分子量为10KD的超滤膜处理，透过液为分子量5-10KD的多糖样品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，将分子量大于10KD的多糖溶液经截留分子量为100KD的超滤膜处理，截流液为分子量大于100KD的多糖样品液。其中，上述草菇预处理步骤如下：1a)干制：选择未开伞的草菇，洗净、去杂、切片，105℃灭酶10min，60-70℃烘干；1b)脱脂：在步骤1a)干制草菇中加入6-10倍体积95％乙醇溶液，浸泡24-48h脱脂，过滤，浸提2-3次，风干。有益效果：相比与现有技术，本发明具有以下优点：1)本发明设计的酶法提取草菇多糖提取效率高、抗氧化活性强。纤维素酶提草菇多糖得率为21.38％，高于热水提多糖15.00％。纤维素酶提草菇多糖对·OH、·、和DPPH·自由基有较强的清除作用及还原能力，均高于热水提取法提取的草菇多糖。在质量浓度0.1～5mg/mL范围内，纤维素酶提草菇多糖对·OH、·、DPPH·自由基最大清除率分别为100％、98.32％、82.74％。纤维素酶提多糖具有较强的还原能力，反映出其抗氧化能力较强。2)本发明设计的超滤法膜分离草菇多糖工艺设备投入少，工艺路线简单，易于操作，适合大规模化生产。采用超滤法分离草菇多糖可以增强抗·OH和DPPH·能力。超滤法获得(MW＞100KD)与(MW5-10kD)草菇多糖对·OH和DPPH·清除活性均高于(MW＞5KD)未分级草菇多糖，对·OH清除活性分别为68.02％、48.41％，对DPPH·清除活性分别为95.50％、95.54％。附图说明图1本发明提取草菇多糖对·OH的清除活性比较；图2本发明提取草菇多糖对·的清除活性比较；图3本发明提取草菇多糖对DPPH·的清除活性比较；图4本发明提取草菇多糖还原力的比较；图5不同截留分子量草菇多糖对·OH的清除活性比较；图6不同截留分子量草菇多糖对DPPH·的清除活性比较；图7纤维素酶提取草菇多糖超滤法分段分离工艺。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺，该工艺包括以下步骤：1)草菇预处理：通过干制得到烘干后的草菇，然后进行脱脂得到脱脂草菇；2)粉碎：将步骤1)中脱脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶灭活：草菇粉粒中加入25倍草菇重量的水，然后加入0.3％纤维素酶，料温保持50℃，搅拌，维持温度120min后，将物料升温至90℃，维持10min灭活后将得到的物料备用；4)离心：将步骤3)中物料降温至20℃，离心，转速为3000r/min，离心时间10min，弃沉淀，取清液备用；5)超滤法分离：将截留分子量为5KD的膜组件组装于超滤设备，在25℃，入口压力2～5kg/m2，出入口压差不要超过1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖样品液；透过液得到分子量小于5KD的多糖溶液，将分子量大于5KD的多糖溶液经截留分子量为10KD的超滤膜处理，透过液为分子量5-10KD的多糖样品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，将分子量大于10KD的多糖溶液经截留分子量为100KD的超滤膜处理，截流液为分子量大于100KD的多糖样品液；6)浓缩：在步骤5)所述的截流液中分别缓缓加入95％乙醇，加入乙醇过程中不断搅拌，混合液中乙醇质量浓度控制在70％，静置沉淀6小时后，虹吸上清液至原体积1/5，下部液体进行离心分离，转速为3500r/min，离心时间15min；7)干燥：在步骤6)所述的沉淀，50℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷冻干燥机冻干，含水量低于4％，即得草菇多糖。本实施例进行的超滤法分离多糖以及以VC(抗坏血酸)做阳性对照的抗氧化活性的测定结果参见图5、6。由图5可以看出，在质量浓度为2.5mg/mL时，不同截留分子量草菇多糖的清除·OH能力差异显著。(MW＞100KD)草菇多糖对·OH清除活性最高为68.02％；其次为(MW5-10kD)草菇多糖，清除率为48.41％；(MW10-30KD)草菇多糖最小，清除率为10.81％。分级后(MW＞100KD)与(MW5-10kD)草菇多糖对·OH清除活性均高于未分级(MW＞5kD)草菇多糖。由图6可以看出，在质量浓度为2.5mg/mL时，不同截留分子量草菇多糖的清除DPPH·能力均较高。(MW5-10kD)草菇多糖对DPPH·清除活性最高为95.54％；其次为(MW＞100KD)草菇多糖，清除率为95.50％；(MW10-30KD)草菇多糖最小，清除率为88.09％。分级后(MW5-10kD)与(MW＞100KD)对DPPH·清除活性均高于未分级(＞5kD)草菇多糖。在人体内，VC作为生物体内对自由基伤害产生的相应保护系统成员之一，是高效抗氧化剂。因此，抗氧化活性的测定以VC做阳性对照。实施例2一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺，该工艺包括以下步骤：1)草菇预处理：通过干制得到烘干后的草菇，然后进行脱脂得到脱脂草菇；2)粉碎：将步骤1)中脱脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶灭活：草菇粉粒中加入30倍草菇重量的水，然后加入0.35％纤维素酶，料温保持55℃，搅拌，维持温度90min后，将物料升温至100℃，维持5min灭活后将得到的物料备用；4)离心：将步骤3)中物料降温至40℃，离心，转速为4000r/min，离心时间5min，弃沉淀，取清液备用；5)超滤法分离：将截留分子量为5KD的膜组件组装于超滤设备，在25℃，入口压力2～5kg/m2，出入口压差不要超过1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖样品液；透过液得到分子量小于5KD的多糖溶液，将分子量大于5KD的多糖溶液经截留分子量为10KD的超滤膜处理，透过液为分子量5-10KD的多糖样品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，将分子量大于10KD的多糖溶液经截留分子量为100KD的超滤膜处理，截流液为分子量大于100KD的多糖样品液；6)浓缩：在步骤5)所述的截流液中分别缓缓加入95％乙醇，加入乙醇过程中不断搅拌，混合液中乙醇质量浓度控制在80％，静置沉淀24小时后，虹吸上清液至原体积1/5-1/10，下部液体进行离心分离，转速为4000r/min，离心时间10min；7)干燥：在步骤6)所述的沉淀，50-70℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷冻干燥机冻干，含水量低于4％，即得草菇多糖。实施例3一种抗氧化草菇多糖高效提取分离工艺，该工艺包括以下步骤：1)草菇预处理：通过干制得到烘干后的草菇，然后进行脱脂得到脱脂草菇；2)粉碎：将步骤1)中脱脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶灭活：草菇粉粒中加入27倍草菇重量的水，然后加入0.33％纤维素酶，料温保持53℃，搅拌，维持温度100min后，将物料升温至95℃，维持8min灭活后将得到的物料备用；4)离心：将步骤3)中物料降温至30℃，离心，转速为3500r/min，离心时间7min，弃沉淀，取清液备用；5)超滤法分离：将截留分子量为5KD的膜组件组装于超滤设备，在25℃，入口压力2～5kg/m2，出入口压差不要超过1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖样品液；透过液得到分子量小于5KD的多糖溶液，将分子量大于5KD的多糖溶液经截留分子量为10KD的超滤膜处理，透过液为分子量5-10KD的多糖样品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，将分子量大于10KD的多糖溶液经截留分子量为100KD的超滤膜处理，截流液为分子量大于100KD的多糖样品液；6)浓缩：在步骤5)所述的截流液中分别缓缓加入95％乙醇，加入乙醇过程中不断搅拌，混合液中乙醇质量浓度控制在75％，静置沉淀6-24小时后，虹吸上清液至原体积1/5-1/10，下部液体进行离心分离，转速为3800r/min，离心时间13min；7)干燥：在步骤6)所述的沉淀，50-70℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷冻干燥机冻干，含水量低于4％，即得草菇多糖。实验例：1热水提取草菇多糖方法通过干制得到烘干后的草菇，然后进行脱脂得到脱脂草菇；将脱脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；取草菇粉加入20倍草菇重量的水，沸水提取1h，过滤。按此步骤共提取2次，合并提取液。2草菇多糖的浓缩干燥将草菇提取液60℃减压浓缩至原体积的1/5，4000rpm离心10min，去除沉淀。浓缩液中缓缓加入95％乙醇，加入乙醇过程中不断搅拌，混合液中乙醇质量浓度控制在70％，静置沉淀12小时后，虹吸上清液至原体积1/5，下部液体进行离心分离，转速为3500r/min，离心时间10min。沉淀物用蒸馏水溶解，溶解液透析(分子截留量为5kDa)，冷冻干燥，得热水提草菇多糖。热水提草菇多糖得率为15.02％。3抗氧化活性的测定3.1·OH清除活性的测定分别吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL样液1.0mL，依次加入2mmol/LFeSO4溶液3.0mL，1mmol/LH2O2溶液3.0mL，静置10min。再加入6moL/L水杨酸溶液3mL，37℃水浴30min，在510nm处测定吸光度，以VC(抗坏血酸)做阳性对照。清除率计算公式：清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。式中：Ai为不同多糖浓度下的吸收度；Aj为用蒸馏水代替水杨酸时测得的不同多糖浓度本底吸光度；A0用水代替多糖样品时测得空白对照吸光度。每个浓度平行做3次，求清除率的平均值。该纤维素酶提多糖样液采用的是实施例1中的方法提取的。参见图1。表1草菇多糖清除·OH活性在质量浓度0.1～5mg/mL范围内，热水提取草菇多糖对·OH最大清除率为62.49％。3.2·清除活性测定取浓度50mmol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5mL，分别加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL样液1.0mL，25℃水浴20min，立即加入25℃预热过的25mmol/L邻苯三酚溶液0.4mL，25℃水浴5min，加入8mmol/LHCl1mL终止反应，在320nm处测定吸光度，以VC(抗坏血酸)做阳性对照。清除率计算公式：清除率(％)＝(1-Ai/A0)×100％。式中：Ai为不同多糖浓度下的吸收度；A0为用水代替多糖样品时测得空白对照吸光度。每个浓度平行做3次，求清除率的平均值。该纤维素酶提多糖样液采用的是实施例2中的方法提取的。参见图2。表2草菇多糖清除·活性在质量浓度0.1～5mg/mL范围内，热水提取草菇多糖对·OH无清除活性。3.3DPPH·清除活性测定分别吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL样液与0.2mmol/LDPPH溶液各4.0mL，加入具塞试管中摇匀，黑暗条件下37℃放置30min，3000r/min离心10min，取上清液在517nm处测吸光度，以VC(抗坏血酸)做阳性对照。清除率计算公式：清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。式中：Ai为多糖浓度下的吸收度；Aj为用无水乙醇代替DPPH溶液时测得的不同多糖浓度本底吸光度；A0为用水代替多糖样品时测得空白对照吸光度。每个浓度平行做3次，求清除率的平均值。该纤维素酶提多糖样液采用的是实施例3中的方法提取的。参见图3。表3草菇多糖清除DPPH·活性在质量浓度0.1～5mg/mL范围内，热水提取草菇多糖对DPPH·最大清除率为82.71％。3.4还原力测定分别吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL样液2.5mL，依次加0.2moL/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)、1％K3Fe(CN)6溶液各2.5mL，混匀后50℃水浴20min。加入10％TCA溶液2.5mL终止反应，3000r/min离心10min。取上清液5.0mL，分别加入蒸馏水5.0mL、0.1％FeCl31.0mL，静置10min，在700nm处测定吸光度，每个浓度平行做3次，以EDTA做阳性对照。该纤维素酶提多糖样液采用的是实施例1中的方法提取的。参见图4。表4草菇多糖还原力测定比较草菇多糖具有一定的还原力，在质量浓度0.1～5mg/mL范围内，2种不同方法提取草菇多糖随着质量浓度增加而还原力增加，且具有明显的量效关系。草菇多糖的还原能力与其抗氧化活性之间有着明显的相关性，还原能力的高低可以间接反映抗氧化能力的强弱。