一种组织细胞培养装置的制作方法

本发明涉及组织细胞培养装置，特别是一种利于细胞在培养环境下，能够在三维空间自由正常生长的组织细胞培养装置。

背景技术：

组织细胞培养是一种在药物开发、细胞生物学、毒理学、生物工程以及组织工程领域中非常有用并且被广泛使用的技术。组织细胞培养装置一般包括培养容器（如培养瓶、培养皿、培养罐等），培养时，培养容器中加培养基，培养基可以是液态（即培养液）或固态，当细胞为悬浮型细胞时，一般只需培养基，但当细胞为贴附型细胞时，若培养容器中只有培养基，细胞就只能贴容器壁培养，在常规的细胞培养中，在培养容器中加入了细胞培养平板，如2，4，6，24，96孔细胞培养板，细胞培养在细胞培养平板上进行，但细胞在容器壁或培养平板上培养与细胞在体内的生长方式并不相仿，在真实的活体内，组织细胞均在三维空间环境中生长，因此在目前二维平面的细胞培养板培养细胞时，受平面生长环境的限制，细胞的活性、形貌和生长状态等与体内环境下相比有很大改变，且细胞易暴露于培养液流体剪切力下，会对细胞造成损伤，因此，进行三维细胞培养具有重要的意义，三维细胞培养比二维培养能更接近地模拟体内的情况，具有比二维培养的显著优势，特别是对动物细胞更有意义，因为大多数动物细胞贴壁生长。

为进行三维细胞培养，研究人员设计了一些装置：

CN101245313A公开了“三维细胞培养插入件、其制造方法、成套用具及用途”。它介绍了一种三维细胞培养插入件，它由非降解性的无细胞毒性的聚合物材料制成，该插入件具有确定的和规则的三维多孔结构，并且其由单个多孔片层构件构成或由多个多孔片层构件固定在一起，该种多孔的三维结构使细胞可以同时贴附于该三维结构的外表面和内表面，其100%联通的多孔的结构能够允许营养物和代谢产物容易地进行交换，有利于细胞的培养。

CN102864119B公开了“用于细胞培养的载体及其制备方法”。它介绍了用三维多孔石墨烯支架作为细胞载体放入培养池中进行细胞培养，多孔石墨烯支架含有金属泡沫，模拟细胞的体内生长环境，实现了细胞的三维培养，有利于维持细胞的生长状态和活性，促进细胞生长。

仔细分析上述现有技术，它们存在的不足之处在于：当培养的细胞逐渐增多时，会阻塞孔隙形成生理死腔或者是营养物质富集区，致使营养物或新陈代谢物难以流动，并阻碍细胞的迁移生长，也会使细胞在培养体内生长分布不均匀，生长状况欠佳。

技术实现要素：

本发明目的是为了克服现有技术中的不足，而提供一种有利于细胞在三维空间自由正常生长的组织细胞培养装置。

发明人认为如果提供一种细胞培养装置，即使在细胞生长繁殖过程中，随着细胞数量逐渐增多致使细胞培养体的孔隙变小或堵塞，仍具备满足营养液或新陈代谢物在多孔的培养体内自由迁移的结构特点，以保证细胞的正常生长条件，则能克服现有技术的不足。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种组织细胞培养装置，包括组织细胞培养体，其特征在于：作为该组织细胞培养体的多孔材料是以材料孔径大小进行分级的孔腔及围绕形成各级孔腔的腔壁构成，且围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置下级小孔腔；同级孔腔均相互贯通，且各级孔腔相互间也彼此贯通。将多孔材料孔腔进行分级，且在围绕形成上级大孔腔的腔壁上设置下级小孔腔，使得细胞生长繁殖过程中，即使细胞数量逐渐增多使得培养体孔隙变小，该组织细胞培养体仍能使营养液在组织细胞培养体内流动，并能使细胞在组织细胞培养体内自由迁移，以利于细胞在三维空间自由正常生长。

进一步地，上述多孔材料中，围绕构成上级大孔腔的腔壁是由下级小孔腔均布填充构成，以密布充满为佳。

上述组织细胞培养装置中，作为组织细胞培养体的多孔材料以材料孔径大小进行分级的孔腔至少分为两级以上。当该多孔材料的孔腔分为三级时，围绕构成上一级大孔腔的腔壁上设置有下一级小孔腔；或者是围绕构成最大一级孔腔的腔壁上设置有下级两级小孔腔。以此类推，分为更多级的多孔材料的孔腔，其每上级孔腔的腔壁上设置有下一级的小孔腔，或者围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置有下级的各级小孔腔或者围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置有任意组合的各级小孔腔。

发明人还认为，当多孔材料的孔腔分为三级时，其中围绕构成上一级孔腔的腔壁是由下一级小孔腔均布填充为佳。这样的孔腔分级不仅利于细胞生长，而且也便于制备。

上述组织细胞培养装置中，较小级孔腔中，至少最小级孔腔的孔径要小于培养细胞的平均直径，剩余的其他级孔腔的孔径至少要大于培养细胞的平均直径。

上述组织细胞培养装置中，所述其他级孔腔中的较大级孔腔的孔径至少为培养细胞平均直径的两倍以上。

上述组织细胞培养装置中，最小级孔腔的孔径小于培养细胞的平均直径，最大级孔腔的孔径至少为培养细胞平均直径的两倍以上为佳。

上述组织细胞培养装置中所提及的组织细胞培养体特别适用作为医用植入体的应用。

该组织细胞培养装置还包括放置组织细胞培养体的培养皿，所述组织细胞培养体固定于所述培养皿中。

上述组织细胞培养装置中，所述组织细胞培养体制成板块结构为佳。

上述组织细胞培养装置中，呈板块结构的组织细胞培养体的板厚不大于所述多孔材料最大一级孔腔的平均孔径的20倍。

上述组织细胞培养装置中，所述培养皿固定于振动工作台上。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了有利于细胞三维空间自由正常生长的组织细胞培养装置，将多孔材料作为组织细胞培养体，特别是该多孔材料以材料孔径大小进行分级的孔腔及围绕形成孔腔的腔壁进行合理设计，同级孔腔均相互贯通且各级孔腔相互间也彼此贯通，给细胞创造了适宜的三维自由正常生长的空间，小孔腔用于营养液或新陈代谢物的传输、流动，腔壁上的互为贯通的孔腔可保证营养液或新陈代谢物流动通过，构成满足细胞生长的微循环体系，大孔腔用于细胞贴壁寄居，细胞能在大孔腔及大孔腔之间的三维空间自由穿行，特别是当孔分成三级时，最小级孔腔用于营养液或新陈代谢物的传输、流动，中间级孔腔用于细胞寄居，最大级孔用于细胞迁移、穿行。本发明提供的培养体在细胞培养过程中不易形成生理死腔或浓度死腔，不会出现细胞生长障碍区或者是营养物质富集区，即使细胞增多，孔腔变小或堵塞也不阻碍营养液或新陈代谢物在细胞培养体内的任意浸润或称渗透，从而保障细胞的顺利正常生长，更加符合细胞的生长规律。

2、本发明所述的组织细胞培养装置，对多孔材料的孔腔进行分级设置，而且合理设计各级孔腔的级数及孔腔的大小，以满足各类组织细胞的各种生长环境条件。特别是较小级的孔腔孔径小于培养细胞的平均直径，更利于充满构成营养液或新陈代谢物的传输、流动，其他级孔腔的孔径至少大于培养细胞的平均直径进一步保证了细胞寄居的需求，较大级孔腔的孔径至少为培养细胞平均直径的两倍以上则进一步在满足细胞寄居的需求下使细胞能顺利地自由迁移、穿行，并保障细胞顺利进入培养体内，在培养体内迁移生长；而较小级孔腔孔径小于培养细胞的平均直径，由于孔径小还会产生毛细力，能促进培养液、新陈代谢物的浸润流动，并能将细胞吸入细胞培养体内，并促进其在组织细胞培养体中的迁移，而由于毛细力的存在还会提高细胞的生长速度。

3、细胞培养体采用板块结构便于贴壁细胞长入内部，避免细胞在表面阻塞，也便于细胞取出，便于培养液穿过细胞培养体。

4、将本发明提供的组织细胞培养体置于培养皿，对培养条件通过振动工作台提供一种外部振动源，可以进行垂直、水平、沿垂直轴转动的振动，以及三种振动中至少两个的复合振动，可促使培养皿中的培养液的流动，使其中的组织细胞的浓度、及各种成分分布均匀。

附图说明

下面将结合附图与实施例对本发明作进一步阐述。

图1为本发明组织细胞培养装置示意图；

图2为图1 A-A截面图（去掉培养皿盖8）；

图3为组织细胞培养体结构示意图，3-1为主视图，3-2为左视图，3-3为俯视图；

图4为图3局部B放大图；

图5为图4 C-C截面图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作说明，实施方式以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施方式。

在图1、图2中，1为培养皿，2为组织细胞培养体，3为固定组织细胞培养体的固定块，它通过焊接固定在培养皿1内，4为振动工作台，5为固定块3开的凹槽，用于使组织细胞培养体2放入固定，6为固定组织细胞培养体2的压块，7为螺钉，8为培养皿盖。组织细胞培养体2放入固定块3的凹槽5中，通过压块6、螺钉7使组织细胞培养体2固定于固定块3上，从而在培养皿1中固定，培养皿1可通过常用的压板、螺栓固定方式使培养皿1固定在振动工作台4上，培养皿盖8盖在培养皿1上。

如图3、图4、图5所示，其中，9为组织细胞培养体2的最大一级孔腔， 10为该孔腔的腔壁，该孔腔是三维贯通的。从图4可知，孔腔9的腔壁10由更小的孔腔11（下一级孔）及围绕孔腔11的腔壁12构成，结合图4对腔壁10的放大图、图5 C-C截面图可知，孔腔11也是三维贯通的，且两级孔腔彼此也三维贯通。

进一步类推，可以形成三级以上的多级孔结构的组织细胞培养体。

培养细胞时，将细胞置于组织细胞培养体2上，然后将培养液加入培养皿1中，将培养皿盖8盖在培养皿1上，启动振动工作台4，使培养皿1振动。培养完成后，将组织细胞培养体2上的细胞取出。

以下详细给出本发明的实施例：

实施例1：

参见附图，一种组织细胞培养装置，它包括组织细胞培养体2，细胞培养体2固定于培养皿1中，培养皿1固定在振动工作台4上。该组织细胞培养体2为一多孔钽材料；该多孔钽材料是以材料孔径大小进行分级的孔腔及围绕形成各级孔腔的腔壁构成，且围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置下级小孔腔；同级孔腔均相互贯通且各级孔腔相互间也彼此贯通。

具体在本例，该多孔钽材料，它具有两级孔腔，均匀分布、相互贯通的上级大孔腔的腔壁由均匀分布、相互贯通的下级小孔腔填充构成，且两级孔腔相互间也彼此贯通。上级大孔腔的孔径为160µm～460µm，下级小孔腔孔径为200nm～500nm；组织细胞培养体2为一板块体材，其厚度为5.5mm，为上级大孔腔的平均孔径的17倍。

本例培养平滑肌组织细胞，培养时，将平滑肌组织细胞置于组织细胞培养体2上，在培养皿1内加入含有12%血清的MEM，将其温度控制在35℃～37℃，将培养皿盖5盖在培养皿1上，其他具体操作与常规细胞培养技术相同。启动振动工作台4，使培养皿1振动，振动采用垂直振动方式，工作频率为80Hz。培养3天，然后将组织细胞培养体2上的细胞取出观察，结果表明，培养的细胞胞体丰满，生长状态良好。

本例中，该种多孔材料是按以下方法制得的：

（1）材料准备

采用1-10µm的钽粉作为原料，粒径为300nm-600nm的尿素作为最小一级孔造孔剂，并用300nm-600nm的淀粉作为粘合剂，按照钽粉：尿素：淀粉：蒸馏水按体积比1：1.5：1：7配制成浆料。

将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充入棱直径为260µm-560µm的聚酯泡沫中，形成坯体并干燥，然后破碎制成粒径为260µm-560µm的含有钽粉原料、造孔剂与聚酯泡沫的混合颗粒。

（2）将混合颗粒、粒径为260µm-560µm的甲基纤维素按体积比2：1均匀混合放入密闭模具压制成致密坯体。

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照钽材工艺进行常规后续处理得到具有二级孔的多孔钽。

实施例2：

本实施例的组织细胞培养装置的细胞培养体2采用多孔二氧化硅材料，具有三级孔腔，均匀分布、相互贯通的第一级大孔腔的腔壁由相互贯通的第二级、第三级孔腔填充构成，且各级孔腔相互间也彼此贯通。第一级大孔腔孔径为1000µm～1500µm，第二级孔腔孔径为70µm～90µm，第三级孔腔的孔径为400nm～700nm，组织细胞培养体2的厚度为24mm，为第一级大孔腔的平均孔径的19倍，培养液为含有20%小牛血清的EAGLE，培养细胞为上皮组织细胞。其他同实施例1。

振动工作台采用沿垂直轴转动的振动方式，工作频率为70Hz。培养结果表明，细胞胞体丰满，生长状态良好。

本例中，该种多孔材料是按以下方法制得的：

（1）材料准备

采用1-10µm的二氧化硅粉作为原料，粒径为500nm～800nm的尿素作为最小一级（第三级）孔造孔剂，用粒径为100µm～150µm的乙基纤维素作为第二级孔造孔剂，并用500nm～800nm的淀粉作为粘合剂，按照二氧化硅粉：尿素：乙基纤维素：淀粉：蒸馏水按体积比1：1.5：1：1：12配制成浆料。

（2）采用孔径为1100µm～1700µm的聚酯泡沫，将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充其中，形成坯体并干燥，然后真空烧结得到具有三级孔的多孔二氧化硅。

实施例3：

本实施例的组织细胞培养装置的组织细胞培养体2采用多孔铌材料，具有三级孔腔，其中，均匀分布、相互贯通的最大一级孔腔（以下称第一级孔腔）的腔壁由均匀分布、相互贯通的中间一级孔腔（以下称第二级孔腔）填充构成，第二级孔腔的腔壁由均匀分布、相互贯通的最小一级孔腔（以下称第三级孔腔）填充构成；且各级孔腔相互间也彼此贯通。第一级孔腔孔径为140µm～600µm，第二级孔腔孔径为50µm～90µm，第三级孔腔孔径为300nm～600nm，组织细胞培养体2的厚度为7mm，为第一级孔腔的平均孔径的18倍，培养液为含有18%血清的BME，培养细胞为成骨组织细胞，其他同实施例1。

培养条件是振动工作台采用水平振动、沿垂直轴转动的振动方式交替进行，工作频率分别为65Hz 、60Hz。培养结果表明，细胞生长状态良好。

本例中，该种多孔材料是按以下方法制得的：

（1）材料准备

采用粒径为1-10µm的铌粉为原料，粒径为400nm-700nm 的甲基纤维素做为最小一级孔造孔剂，用粒径为400nm-700nm的聚苯乙烯作为粘合剂，按照铌粉：甲基纤维素：聚苯乙烯：蒸馏水按体积比1：2：1：7.5配制成浆料。

采用棱直径为60µm～100µm、孔径为200µm～400µm的聚酯泡沫，将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充其中，形成坯体并干燥，然后破碎制成粒径为60µm～100µm的含有铌粉原料、造孔剂与聚酯泡沫的混合颗粒。

（2）将混合颗粒、粒径为60µm～100µm的乙基纤维素按体积比2：1均匀混合后均匀地灌入棱直径为250µm -750µm、孔径为400µm-600µm的三维贯通的聚酯泡沫中，然后将聚酯泡沫放入密闭模具压制成致密坯体。

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照铌材工艺进行常规后续热处理得到具有三级孔的多孔铌。

实施例4：

本实施例的组织细胞培养装置的组织细胞培养体2采用多孔钛材料，具有四级孔腔，其中，均匀分布、相互贯通的最大一级孔腔（即第一级孔腔）的腔壁由均匀分布、相互贯通的第二级孔腔填充构成，第二级孔腔的腔壁由均匀分布、相互贯通的第三级、第四级孔腔填充构成；且各级孔腔相互间也彼此贯通。第一级孔腔孔径为700µm～1200µm，第二级孔腔孔径为200µm～300µm，第三级孔腔孔径为400nm～700nm，第四级孔腔孔径为10nm～100nm，组织细胞培养体2的厚度为17mm，为第一级孔腔的平均孔径的16倍，培养液为含有10%的胎牛血清和双抗的高糖DMEM，培养细胞为HUVEC细胞，其他同实施例1。

培养条件是振动工作台采用水平振动、垂直振动方式交替进行，各振动2分钟，工作频率分别为50Hz 、70Hz。培养结果表明，细胞生长状态良好。

本例中，该种多孔材料是按以下方法制得的：

采用1-10µm的钛粉作为原料，粒径为5nm～120nm的尿素作为最小一级（第四级）孔腔造孔剂，用粒径为500nm～800nm的乙基纤维素作为第三级孔腔造孔剂，并用5nm～120nm的淀粉作为粘合剂，按照钛粉：尿素：乙基纤维素：淀粉：蒸馏水按体积比1：1.5：1：1：12配制成浆料。

采用棱直径为300µm～400µm、孔径为400µm～600µm的聚酯泡沫，将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充其中，形成坯体并干燥，然后破碎得到粒径为300µm～400µm的含有钛粉原料、造孔剂与聚酯泡沫的混合颗粒。

（2）将混合颗粒、粒径为300µm～400µm的甲基纤维素按体积比2：1均匀混合后均匀地灌入棱直径为800µm～1300µm、孔径为1500µm-2000µm的三维贯通的聚酯泡沫中，然后将聚酯泡沫放入密闭模具压制成致密坯体。

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照钛材工艺进行常规后续热处理得到具有四级孔的多孔钛。

实施例5：

本实施例的组织细胞培养装置的组织细胞培养体2采用多孔CoNiCrMo合金材料，具有五级孔腔，其中，均匀分布、相互贯通的最大一级孔腔（即第一级孔腔）的腔壁由均匀分布、相互贯通的第二级、第三级孔腔填充构成，第二级、第三级孔腔的腔壁由均匀分布、相互贯通的第四级、第五级孔腔填充构成；且各级孔腔相互间也彼此贯通。第一级孔腔孔径为800µm～1300µm，第二级孔腔孔径为100µm～200µm，第三级孔腔孔径为30µm～70µm，第四级孔腔孔径为500nm～700nm，第五级孔腔孔径为50nm～200nm，组织细胞培养体2的厚度为20mm，为第一级孔腔的平均孔径的18倍，培养液为含有10%的胎牛血清和双抗的高糖DMEM，培养细胞为HUVEC细胞，其他同实施例1。

培养条件是振动工作台采用水平振动方式，工作频率为70Hz。培养结果表明，细胞生长状态良好。

本例中，该种多孔材料是按以下方法制得的：

采用1-10µm的CoNiCrMo合金粉作为原料，粒径为60nm～300nm的尿素作为最小一级（第五级）孔腔造孔剂，用粒径为600nm～800nm的乙基纤维素作为第四级孔腔造孔剂，并用60nm～300nm的淀粉作为粘合剂，按照CoNiCrMo合金粉：尿素：乙基纤维素：淀粉：蒸馏水按体积比1：1.5：1：1：12配制成浆料。

采用棱直径为40µm～80µm、孔径为400µm～600µm的聚酯泡沫，将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充其中，形成坯体并干燥，然后破碎制成粒径为40µm～80µm的含有CoNiCrMo合金粉原料、造孔剂与聚酯泡沫的混合颗粒。

（2）将混合颗粒、粒径为200µm～300µm的甲基纤维素按体积比1：1均匀混合后均匀地灌入棱直径为900µm～1400µm、孔径为1500µm-2000µm的三维贯通的聚酯泡沫中，然后将聚酯泡沫放入密闭模具压制成致密坯体。

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照CoNiCrMo合金工艺进行常规后续热处理得到具有五级孔的多孔CoNiCrMo合金。