本发明涉及一种制备生物柴油的方法，特别是通过改进液体脂肪酶的种类和添加方式等工艺条件，提高液体酶催化制备生物柴油效率的方法。
背景技术：
面对日益严重的环境污染和能源危机，生物柴油作为一种新型无污染可再生能源，受到了广泛的关注和研究。生物柴油是指由动植物油脂与醇类（甲醇或乙醇等）经酯化或转酯化反应得到的脂肪酸单烷基酯，最典型的是脂肪酸甲酯（FAME）。与传统的石化能源相比，生物柴油具有硫及芳烃含量低、闪点高、十六烷值高、具有良好的润滑性等诸多优点。
目前，工业上生产生物柴油的方法主要是化学法生产，即利用酸、碱催化剂在高温高压条件催化反应合成脂肪酸短链酯。化学法虽然反应速度快、反应产率高，但也存在许多难以克服的弊端，如：对油脂原料中游离脂肪酸和水的含量要求苛刻，甲醇用量大，高温高压能耗高、副反应多，产物品质不高且分离困难，而且酸碱对设备腐蚀严重，此外还会产生大量废水。
利用生物酶合成生物柴油的方法具有反应条件温和、无污染物产生、具有广泛的油脂原料适用性以及产物品质高等诸多优点。目前酶法生产生物柴油主要使用商品固定化酶Novozyme 435，Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM等作催化剂，这是因为固定化脂肪酶可以重复使用，在一定程度上降低酶的使用成本。即使这样，由于固定化脂肪酶的非常昂贵，这就要求固定化脂肪酶必须能够重复使用上百批次，这显然大大增加了生产过程中的风险。
游离脂肪酶的价格与固定化酶相比，价格非常低廉，使用液体酶生产生物柴油，成本优势非常明显。
中国发明专利申请CN101103118A公开了一种用于生产脂肪酸烷基酯的方法，其中将包含甘油三酯和醇的溶液与第一脂解酶和第二脂解酶接触，其中所述第一脂解酶对游离脂肪酸的活性相对高于对甘油三酯的活性，并且所述第二脂解酶对甘油三酯的活性相对高于对游离脂肪酸的活性。根据该申请，所述第一脂解酶可以是源自南极假丝酵母（Candida antarctica）的脂肪酶B (CALB)，而所述第二脂解酶可以是源自疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶变体（TLL）和源自特异腐质霉（Humicola insolens）的角质酶变体之一。根据该申请，使用两种脂解酶的组合使甘油三酯或甘油三酯和游离脂肪酸的组合物向脂肪酸烷基酯转化的转化百分率提高到10%-20%之间。
中国发明专利申请CN103429747A公开了一种用于产生脂肪酸烃基酯的工艺，其包括：形成包含脂肪酸原料、醇、水、和甘油的两相反应物混合物，以及使所述反应物混合物与一种或多种脂肪分解酶接触。根据该申请的公开，在液体酶催化制备生物柴油反应时，将部分的水替换为甘油，酯交换反应可以更高速率进行和/或进行至更高百分数的脂肪酸烃基酯和更低百分数的游离脂肪酸。
中国发明专利CN101812485B公开了一种利用游离酶催化合成脂肪酸低碳醇酯的工艺。该申请采用环糊精等糖类作为添加剂与游离脂肪酶混合后用于制备生物柴油，15-30小时反应转化率达到80%-96%。反应后游离酶通过沉降回收，可重复使用5-8次。
尽管在使用游离脂肪酶的生物柴油生产方面取得了一定的进展，然而，液体酶的稳定性较差，甲醇等短链醇对液体酶具有较强的失活作用，同时反应的转化率较低，甘油酯和游离脂肪酸难以完全转化为脂肪酸甲酯，导致现有技术的方法还不能完全满足产业化需要。
本领域还需要一种提高液体酶催化制备生物柴油效率的方法。
技术实现要素：
本发明人在研究液体酶工艺中意外发现，一定组成的中间态反应物对于液体脂肪酶之间的协同催化具有很好的促进作用，从而得到了提高液体酶催化制备生物柴油效率的方法。在此基础上，完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种制备生物柴油的方法，其包括以下步骤：
（1）提供包含油脂的原料；
（2）将步骤1）所得的原料与第一脂肪酶接触，形成包含中间态反应物的中间产物；
（3）将第二脂肪酶添加到将步骤2）所得的中间产物中，由此制备生物柴油。
在一个实施方案中，所述原料包含按重量计大于10%，优选30%-70%的油脂。
在一个实施方案中，所述原料包含TAG 10~99%、DAG和MAG合计0.01~10%。
在一个实施方案中，所述原料可以包含选自餐饮业废弃物的油脂，以及来自工业副产物或工业废物的油脂或脂肪酸。具体地，所述原料可以选自例如废餐饮用油、酸化油、中性油、脂肪酸、油脂脱臭馏出物及其组合，但不限于此。
在一个实施方案中，所述第一脂肪酶是来自于疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的脂肪酶（TLL）。
在一个具体实施方案中，所述第二脂肪酶是来自于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶（RML），或南极假丝酵母（Candida antarctica）的脂肪酶B（CALB）。
在一个实施方案中，所述步骤（2）在30℃~50℃，优选35℃~45℃下进行。
在一个实施方案中，所述步骤（2）进行0.5h~8h。
在一个实施方案中，所述中间产物包含脂肪酸单烷基酯，甘油三酯，甘油二酯，甘油一酯和甘油。
在一个实施方案中，所述中间产物包含脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯，甘油三酯，甘油二酯，甘油一酯和甘油。
在一个实施方案中，所述中间产物包含按重量计3%~70%的甘油二酯，1%~30%的甘油一酯，和0.01%~10%的甘油。
在一个实施方案中，所述中间产物包含按重量计5.0-15.0%的甘油三酯，5.0%~40.0%的甘油二酯，2.0%~20.0%的甘油一酯，和0.01%~0.5%的甘油。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二脂肪酶是游离的脂肪酶。
在一个实施方案中，在步骤（2）中基于所述原料的重量，添加1%-30%的水和/或1%-10%的低级醇底物。
在一个实施方案中，在步骤（3）中基于所述原料的重量，添加10%-40%的低级醇底物。
在一个实施方案中，通过分批或连续流的方式进行添加水和/或低级醇底物。
在一个实施方案中，所述低级醇底物是具有1-5个碳原子的醇，优选甲醇或乙醇或其组合。
本发明的另一个目的在于使用本发明的中间产物制备生物柴油的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备生物柴油的方法，其包括：
(1) 提供中间产物；
(2) 将脂肪酶添加到所述的中间产物中，由此制备生物柴油。
在一个具体实施方案中，所述脂肪酶包括第一脂肪酶和第二脂肪酶，所述第一脂肪酶是来自于疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的脂肪酶（TLL），所述第二脂肪酶是来自于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶（RML），南极假丝酵母（Candida antarctica）的脂肪酶B（CALB）或其组合。
在一个具体实施方案中，在步骤（2）中基于所提供的中间产物的重量，添加10%-40%的低级醇底物。
在一个实施方案中，通过分批或连续流的方式进行添加水和/或低级醇底物。
在一个实施方案中，低级醇底物是具有1-5个碳原子的醇，优选甲醇或乙醇或其组合。
本发明的另一个目的还在于通过本发明的任一方法制备的生物柴油。
本发明还提供了通过所述方法获得的生物柴油及其用途。本发明的具体实施方案详述在下文中。
油脂
在本发明中使用的“油脂”是指来自于植物、动物、微生物、合成或回收的油和脂肪，其主要由甘油酯构成，包括甘油三酯（TAG）、甘油二酯（DAG）、和/或甘油一酯（MAG）。
特别地，用于本发明的油脂的脂肪酸组成以棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸为主。特别地，用于本发明的油脂的碘值可以在40~150g I2/100g的范围。特别地，用于本发明的油脂的皂化值可以在150~220mg KOH/g的范围。
本发明对于油脂的来源没有特别的限制。然而，出于环境友好以及成本考虑，在本发明中优选使用来自餐饮业废弃物的油脂或脂肪酸，例如地沟油、废餐饮用油、煎炸废油等，以及来自工业副产物或工业废物的油脂或脂肪酸，例如酸化油、中性油、油脂脱臭馏出物、脂肪酸等，及上述一种或多种的组合物。
所述包含油脂的原料可以包含一种或多种来源的油脂。基于所述原料的总重量，油脂（即包括TAG、DAG、MAG在内的甘油酯）的质量百分数不低于10%，优选30%~70%。
脂肪酶
在本发明中使用的“脂肪酶”是指催化脂肪（脂质）水解的一类酶，根据国际生物化学会酶学委员会的分类为EC 3.1.1.3。
根据本发明的方法，首先将油脂原料与第一脂肪酶接触，形成包含中间态反应物的中间产物；随后添加第二脂肪酶，由此制备生物柴油。
可用于本发明的第一脂肪酶的实例包括，但不限于来自于疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的脂肪酶（TLL）。所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶及其变体描述于例如WO 00/60063。在本发明中可以使用TLL的天然酶产物或重组酶，优选为表达于毕赤酵母中的重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶也可商购自例如Sigma (Catlog No. L0777)。
可用于本发明的第二脂肪酶的实例包括，但不限于来自于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶（RML），或南极假丝酵母（Candida antarctica）的脂肪酶B（CALB）。所述米黑根毛霉脂肪酶及其变体描述于例如CN103849636A。所述南极假丝酵母脂肪酶及其变体描述于例如CN200910039860.5。在本发明中可以使用RML或CALB的天然酶产物或重组酶，优选为表达于毕赤酵母中的重组米黑根毛霉脂肪酶。这些脂肪酶可商购自例如Sigma (Catlog No. L4277；Catlog No. 52583)。
在本发明中，所述第一和第二脂肪酶优选作为液体中的游离酶使用。所述第一和/或第二脂肪酶可以作为冻干粉末添加到反应系统中。可选地，所述第一和/或第二脂肪酶是固定化的，例如固定在易于回收的微粒上。对脂肪酶进行冻干或固定化的方法是本领域中已知的，例如，可参见CN200580000548.0和CN201110170701.6。
中间态反应物
本发明人发现经过第一脂肪酶催化油脂反应而产生的中间态反应物能够对于脂肪酶之间的协同催化产生很好的促进作用。
所述中间态反应物包含脂肪酸单烷基酯，甘油三酯，甘油二酯，甘油一酯和甘油，优选地所述中间态反应物包含脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯，甘油三酯，甘油二酯，甘油一酯和甘油。更优选地，所述中间态反应物包含按中间态反应物总重量计：3%~70%的甘油二酯，1%~30%的甘油一酯，和0.01%~10%的甘油。例如，所述中间态反应物可以包含按中间态反应物总重量计：5.0-15.0%的甘油三酯，5.0%~40.0%的甘油二酯，2.0%~20.0%的甘油一酯，和0.01%~0.5%的甘油。
制备工艺
使用脂肪酶催化油脂反应的条件是本领域中已知的。在本发明中，第一脂肪酶催化油脂反应的适合的反应温度为30℃~50℃，优选35℃~45℃，适合的反应时间为0.5h~8h，更优选2h~6h。
为了酶促反应的顺利进行，可向包含油脂的原料中添加水和/或低级醇底物。基于所述原料的总质量，适合的水添加量为1%-30%。基于所述原料的总质量，适合的低级醇的添加量为1%-10%。添加水和低级醇底物的方式是本领域中已知的。例如，可以采用分批或连续添加的方式进行添加。
在获得所述中间态反应物后，可加入第二脂肪酶进行后续的反应。
在添加第二脂肪酶后，随反应的进行可进一步添加低级醇底物。在此步骤中，基于所述原料的总质量，适合的低级醇添加量为10%-40%。可以采用分批或连续流的方式进行添加低级醇底物。
所述低级醇底物是指具有1-5个碳原子的醇，优选甲醇或乙醇或其组合。
本发明是将第一种液体脂肪酶与油脂原料形成中间态反应物的基础上，再加入第二种液体脂肪酶协同催化。本发明方法与现有方法单一液体酶催化工艺以及两种液体酶的混合使用或分开串联使用的工艺相比，在减少酶用量的同时，可显著降低反应产物中甘三酯、甘二酯、单甘脂和游离脂肪酸的残留量，大大提高生物柴油的产率。
具体实施方式
以下具体实施方式用于进一步说明本发明而不是限制本发明的范围。
下述实施例中使用的TLL液体酶、RML液体酶和CALB液体酶分别通过以下方式获得：可以是商品化脂肪酶Lipozyme®TL 100L，Palatase® 20000L和Lipozyme®CALBL；也可以是以现有公开的文献专利方法得到，如WO 00/60063，CN103849636A和CN200910039860.5。
下述实施例中，使用的油脂来源如下：
酸化油：益海（连云港）油化工业有限公司提供，组成成分为TAG 23.9%、DAG 8.8%、MAG 2.7%、FFA 57.2%，碘值116gI2/100g，皂化值175mgKOH/g。
煎炸废油：煎炸薯片20批次后的棕榈液油（煎炸条件：500g棕榈液油加热至180℃，每次使用20g土豆片煎炸4min），组成成分为TAG 88.2%、DAG 3.6%、MAG 1.8%、FFA 4%，碘值52gI2/100g，皂化值184mgKOH/g。
油脂脱臭馏出物（PFAD）：WILMAR BIOENERGI INDONESIA提供，组成成分为TAG 4.9%、DAG 2.1%、MAG 0.8%、FFA 92%，碘值47gI2/100g，皂化值198mgKOH/g。
地沟油：购自上海绿铭环保科技股份有限公司，组成成分为TAG 46.8%、DAG 8.6%、MAG 1.9%、FFA 40%，碘值126gI2/100g，皂化值180mgKOH/g。
脂肪酸甲酯（FAME），甘油三酯（TAG），甘油二酯（DAG），甘油一酯（MAG）和游离脂肪酸（FFA）含量的测定方法采用文献（Batch production of FAEE-biodiesel using a liquid lipase formulation）中的HPLC方法。
甘油含量的测定方法参照文献Determination of free and total glycerin in pure biodiesel (B100) by GC in compliance with EN 14105中的方法。
碘值的测定方法是按照动植物油脂碘值测定的国家标准GB/T 5532-2008中的方法进行的。
皂化值的测定方法是按照动植物油脂皂化值测定的国家标准GB/T 5534-2008中的方法进行的。
实施例1
取200g酸化油加入到反应瓶中，预热至35℃，并加入1g TLL液体酶（蛋白含量20mg/mL），30g水和200ppm NaOH溶液，以250rpm的速率进行机械搅拌。在35℃下反应3小时，期间将8mL甲醇在3h内分7次加入反应瓶中。然后将1g RML液体酶（蛋白含量6mg/mL）加入，62mL甲醇在20h内连续流加，继续反应1h。反应结束后，静置分层取上层甲酯相75℃下旋蒸进一步除水后，用于测定分析。测试结果如表1所示。
比较实施例1-1
实验条件与实施例1相同，除了两个步骤中添加的脂肪酶都为TLL液体酶，测定结果如表1所示。
比较实施例1-2
实验条件与实施例1相同，除了两个步骤中添加的脂肪酶都为RML液体酶，测定结果如表1所示。
比较实施例1-3
实验条件与实施例1相同，除了TLL液体酶和RML液体酶在反应开始时同时加入到反应器中与原料接触，测定结果如表1所示。
比较实施例1-4
将油脂原料先与TLL液体酶进行接触后，静置分离出上层油相和水相（酶蛋白位于水相），将分离出的油相再与RML液体酶进行接触，其他反应参数与实施例1相同，测定结果如表1所示。
表1：实施例和对比例的反应产物的测定分析结果(按产物重量计%)
从以上结果可见，通过本发明的方法大大提高了生物柴油（即脂肪酸甲酯FAME）的产量，甚至比在反应开始同时加入两种酶的情况还要高出50%以上(88.4% vs. 52.4%)，同时显著降低了终产物中甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯，特别是游离脂肪酸的残留量。
实施例2
取80g煎炸废油和120g预先熔化的PFAD混合均匀（TAG 46.1%、DAG 2.4%、MAG 1.1%、FFA 48.2%，碘值48.6gI2/100g，皂化值193mgKOH/g），加入到反应瓶中，预热至40℃，并加入1g TLL酶液（蛋白含量20mg/mL），20g水，以250rpm的速率进行机械搅拌。在40℃下反应2小时，期间将5mL甲醇在2h内分5次加入反应瓶中，取样测定。然后将1.2g RML酶液（蛋白含量6mg/mL）加入，65mL甲醇在18h内连续流加，继续反应1h。反应结束后，静置分层取上层甲酯相75℃下旋蒸进一步除水后，用于测定分析，测试结果如表2所示。
表2：测定分析结果(按重量计%)
实施例3
取200g地沟油加入到反应瓶中，预热至30℃，并加入0.8g TL酶液（蛋白含量20mg/mL），10g水，以250rpm的速率进行机械搅拌。将25mL甲醇在6h内分13次加入反应瓶中。然后将0.8g RM酶液（蛋白含量6mg/mL）加入，45mL甲醇在12h内连续流加，继续反应2h。反应结束后，静置分层取上层甲酯相75℃旋蒸进一步除水后，用于测定分析。
表3：测定分析结果(按重量计%)
实施例4
取100g地沟油和预先熔化的100g PFAD混合均匀（TAG 25.1%、DAG 5.4%、MAG 1.4%、FFA 66.2%，碘值90gI2/100g，皂化值191mgKOH/g），加入到反应瓶中，预热至45℃，并加入1g TL酶液（蛋白含量20mg/mL），10g水，以250rpm的速率进行机械搅拌。将10mL甲醇在2h内分5次加入反应瓶中。然后将1g RM酶液（蛋白含量6mg/mL）加入，60mL甲醇在20h内连续流加，继续反应2h。反应结束后，静置分层取上层甲酯相75℃旋蒸进一步除水后，用于测定分析。
表4：测定分析结果(按重量计%)
实施例5
取50g地沟油、50g酸化油和100g煎炸废油混合均匀（TAG 61.8%、DAG 6.2%、MAG 2.1%、FFA 26.3%，碘值81gI2/100g，皂化值160mgKOH/g），加入到反应瓶中，预热至35℃，并加入2g TL酶液（蛋白含量20mg/mL），30g水和700ppm NaOH溶液，以250rpm的速率进行机械搅拌。将25mL乙醇在4h内分9次加入反应瓶中。然后将1g RM酶液（蛋白含量6mg/mL）加入，78mL乙醇在18h内连续流加，继续反应2h。反应结束后，静置分层取上层乙酯相75℃旋蒸进一步除水后，用于测定分析。
表5：测定分析结果(按重量计%)
实施例6
取80g煎炸废油和120g预先熔化的PFAD混合均匀（TAG 46.1%、DAG 2.4%、MAG 1.1%、FFA 48.2%，碘值48.6gI2/100g，皂化值193mgKOH/g），加入到反应瓶中，预热至40℃，并加入1g TL酶液（蛋白含量20mg/mL），20g水，以250rpm的速率进行机械搅拌。将5mL甲醇在2h内分5次加入反应瓶中，取样测定。然后将1g CALB酶液（蛋白含量12mg/mL）加入，65mL甲醇在18h内连续流加，继续反应1h。反应结束后，静置分层取上层甲酯相75℃旋蒸进一步除水后，用于测定分析。
表6：测定分析结果(按重量计%)