一种鉴别杂菌中幽门螺杆菌的分子检测方法与流程

背景技术：

幽门螺杆菌(HP)现有的检测方法，包括快速尿素酶试验(RUT)、细菌培养、¹³C-尿素呼气试验(¹³C-UBT)、血清学(幽门螺杆菌抗体HP IgG)检查、HP病理组织学检测等方法，其中准确度以细菌培养最高，敏感度以RUT最高。而PCR法无论在方法的灵敏度还是准确度上都是以上几种方法无法企及的。荧光PCR法相较于普通PCR法更加方便快速。荧光PCR扩增时在加入一对引物的时再混入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

MGB探针又是在 MGB探针技术基础上进一步改良而成的。探针的3′端带有小沟结合物(MGB)分子。探针与靶点结合后，MGB分子结合DNA内形成的小沟，提高了探针的熔解温度值，从而增强了探针的结合能力。 MGB探针的长度可以大大短于PCR引物。由于MGB基团的存在，这些探针可以较TaqMan探针更短，同时能够达到较高的熔解温度。与引物相比， MGB探针能在更高的温度下，与靶点更特异性地结合。由于MGB探针具有更高的特异性，能增加检测的准确性。因此其被推荐应用于复杂领域。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种在杂菌中鉴别出幽门螺旋杆菌的方法。本发明建立了TaqMan探针实时荧光PCR的方法。在合适的温度下，荧光探针会优先与模板结合，同时在扩增过程中具有外切活性的Taq酶将能探针分解，从而放出荧光信号，据此可以判定出样品中是否含有幽门螺旋杆菌。

本发明实现预期目的的思路：

(1)选取细菌16s rRNA基因保守区域设计一对通用引物，在同一区域再设计一对长度超出保守区的幽门螺杆菌特有的引物。

(2)在靠近上游引物的一端设计出一条含有12个碱基 MGB探针；

(3)实验体系分为两部分，两对引物分开扩增，其他成分一致。

本实验具体步骤如下：

(1)探针(Probe)：FAM-5′ACGAGCGCAACC-MGB-NFQ

(2)通用引物(Primers)CB：

F 5′TCGTCAGCTCGTGYCGTGA 3′

R 5′ATGMTGACTTGACGTCRTCCC 3′

幽门螺旋杆菌引物CB-HP：

F 5′GCTTGCCAGACCTTGAAAA 3′

R 5′ATGATGACTTGACGTCGTCCC 3′

(3)体系成分构成：

(4)选用两步法扩增，程序步骤如下：

依据上述步骤可以得到样品中是否含有细菌，并进一步鉴别是否含有幽门螺杆菌。

与现有技术相比，所述技术方法采用荧光PCR法，将特定菌株辨别的灵敏度和准确度提升的一个新的高度。若通用引物没有信号只能说明样品提取不合格，任何结果都不可信，也不能判读为幽门螺杆菌为阴性。这样设计可以有效地避免假阴性的结果出现，为特别菌种鉴别相关研究提供了更加可靠的技术保障。

附图说明

图1为通用引物CB的扩增曲线

图2为HP特异引物的扩增曲线图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

提取大肠杆菌和幽门螺杆菌的DNA提取物为阳性对照品。利用本发明中细 菌的通用引物，分别检测这两个阳性对照品，结果如图1：大肠杆菌(Ct_E.coli＝14)和幽门螺旋杆菌(Ct_HP＝15)相较于阴性对照(Ct_Negative＝31)荧光信号明确，灵敏度高，说明该对通用引物和探针设计合理，达到了预期效果。

实施例2：

为了验证引物CB HP是否能扩增出幽门螺旋杆菌特异性片段，使用实施例一中两种菌的DNA提取物，结果如图2：幽门螺旋杆菌(Ct_HP＝14)相较于阴性对照(Ct_Negative＝31)荧光信号强烈明确。大肠杆菌(Ct_E.coli＝30)与阴性对照基本相近，说明HP特异引物并不能扩增出条带，达到了引物设计初衷，取得了很好的判别幽门螺旋杆菌的效果。