磷酸酶是使其底物脱磷酸的酶；即，磷酸酶使磷酸单酯水解为磷酸根离子和具有游离羟基的分子。该作用与磷酸化酶和激酶的作用正好相反，所述磷酸化酶和激酶通过使用高能分子如ATP使磷酸基与它们的底物连接。磷酸酶可被划分为两个主要类别：依赖于半胱氨酸的磷酸酶(CDP)和金属磷酸酶。金属磷酸酶通常使2个催化必需的金属离子在它们的活性位点协作。目前对于这些金属离子的身份有一些困惑，因为鉴定它们的连续尝试得出了不同的答案。目前有证据表明这些金属可能是镁、锰、铁、锌或其任意组合。认为桥连这两个金属离子的羟基离子参与对磷酸基上的亲核攻击。磷酸酶与将磷酸基添加到蛋白上的激酶/磷酸化酶的作用相反。磷酸基的添加或去除可以使酶(例如，为通路传递信号的激酶)激活或失活或确保出现蛋白-蛋白相互作用(例如，SH3结构域)；因此磷酸酶对于许多信号转导通路而言是不可或缺的。应该注意到，磷酸添加和去除不一定对应酶的激活或抑制，并且一些酶具有用于激活或抑制功能调控的单独的磷酸化位点。例如，取决于被磷酸化的具体氨基酸残基，CDK可以被激活或失活。磷酸在信号转导中是重要的，因为所述磷酸调控与它们连接的蛋白。为了逆转调控效果，除去磷酸。这通过水解作用独立地发生，或由蛋白磷酸酶介导发生。一类磷酸酶，碱性磷酸酶(ALP或AP)(EC3.1.3.1)，是负责从许多种类型的分子，包括，例如，核苷酸、蛋白和生物碱除去磷酸基的水解酶。直到最近，才认识到碱性磷酸酶在碱性环境中最有效的，如其名字所提示的。在本领域中认为AP的一个可能的生理作用可能是它与炎性分子相互作用。首先已经假设，AP使内毒素脱磷酸并且由此降低了对这些高炎性分子的炎性应答。从那以后，已被假设和探寻了其他的作用机制。然而，直到现在，尽管它在众多炎性疾病和其他疾病中的有益作用，该作用机制还没有被完全阐明。在过去，牛源的碱性磷酸酶已在动物模型和临床试验中用于例如败血症、急性肾损伤、炎性肠病、小肠结肠炎、缺血再灌注损坏或其他炎性疾病的治疗(Riggle等,JSurgRes.2013年3月；180(1):21-6；Peters等,JPharmacolExpTher.2013年1月；344(1):2-7；Martinez-Moya等,PharmacolRes.2012年8月；66(2):144-53；Pickkers等,CritCare.2012一月23日；16(1)；Ramasamy等,InflammBowelDis.2011年2月；17(2):532-42；Lukas等,InflammBowelDis.2010年7月；16(7):1180-6；Bol-Schoenmakers等,EurJPharmacol.2010年5月10日；633(1-3):71-7；Heemskerk等,CritCareMed.2009年2月；37(2):417-23；Tuin等,Gut.2009年3月；58(3):379-87；Su等,CritCareMed.2006年8月；34(8):2182-7；vanVeen等,BrJSurg.2006年4月；93(4):448-56；vanVeen,InfectImmun.2005年7月；73(7):4309-14；Verweij等,Shock.2004年8月；22(2):174-9)。尽管目前可获得从天然来源分离的以及重组改造的、在诊断学和疾病治疗两者中都有用的碱性磷酸酶，但是仍需要具有例如改变的(例如改善的)比活性、稳定性(例如，在体内的T1/2，或储存(货架期)的稳定性)或底物特异性的供选择的磷酸酶。本发明提供这样的改进的磷酸酶，所述改进的磷酸酶相较于WO2008/133511中广泛描述的嵌合型重组碱性磷酸酶具有改善的性能。技术实现要素：在第一实施方式中，本发明提供具有磷酸酶活性的分离蛋白，其中所述蛋白包括与SEQIDNO:5具有至少90％的序列同一性的至少200个连续氨基酸的氨基酸序列，与SEQIDNO:6具有至少90％的序列同一性的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，以及与SEQIDNO:7具有至少90％的序列同一性的至少40个连续氨基酸的氨基酸序列，其中全长蛋白包括与SEQIDNO:1的全长氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，条件是279位的氨基酸是亮氨酸(L)，328位的氨基酸是缬氨酸(V)并且478位的氨基酸是亮氨酸(L)。在优选实施方式中，全长蛋白包括与SEQIDNO:1的全长氨基酸序列具有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列，条件是对应279位的氨基酸是亮氨酸(L)，对应328位的氨基酸是缬氨酸(V)并且对应478位的氨基酸是亮氨酸(L)。本文中术语“对应”意为相对于成熟蛋白的被指定为“1位”的N端氨基酸的特定位置。术语“对应”明确地并不指在该特定位置上的特定氨基酸残基。术语“蛋白”和“多肽”指包括由肽键连接的氨基酸的化合物并且可以互换使用。如在本文中使用，当提及“氨基酸序列”时，它是指蛋白或肽分子的氨基酸序列。“氨基酸序列”可以从编码蛋白的核酸序列推导出。然而，术语如“多肽”或“蛋白”并非意欲将氨基酸序列限于推导出的氨基酸序列，而是可以包括推导出的氨基酸序列的翻译后修饰，如氨基酸缺失、添加和修饰，比如糖基化和添加脂质部分。而且，使用非天然氨基酸，比如D-氨基酸来提高稳定性或药代动力学行为也落在术语“氨基酸序列”的范围内，除非另外指出。优选地，所述蛋白的一部分包括与人PLAP的全长冠状结构域具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的50-65个、优选地60-65个、更优选地62-65个、更优选地64-65个、最优选地65个连续氨基酸的氨基酸序列。为了本发明的目的，对应人PLAP参考序列的全长冠状结构域的氨基酸序列为图1中描述的SEQIDNO:3中加下划线的，并且对应其中的366-430位。优选地，所述蛋白的一部分包括与人ALPI的冠状结构域侧翼的N端区域具有90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的200-365个、更优选地250-365个、更优选地300-365个、更优选地350-365个、更优选地至少360-365、最优选地365个连续氨基酸的氨基酸序列。该冠状结构域侧翼的N端区域被认为是催化结构域的两个部分中的一个。优选地，所述蛋白的一部分包括与人ALPI的冠状结构域侧翼的C端区域具有90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的40-54个、优选地45-54个、更优选地50-54个、更优选地52-54个、最优选地54个连续氨基酸的氨基酸序列。该冠状结构域侧翼的C端区域被认为是催化结构域的两个部分中的第二个。为了本发明的目的，人ALPI成熟蛋白参考序列的氨基酸序列被描述在图1中(SEQIDNO:2)。为确定一起被称作催化结构域的N端和C端侧翼区域的目的，人ALPI的冠状结构域在本文中为加下划线的。在特别优选的实施方式中，本发明提供了根据本发明的蛋白，其中所述蛋白包括与人PLAP的全长冠状结构域具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的50-65个、优选地60-65个、更优选地62-65个、更优选地64-65个、最优选地65个连续氨基酸的氨基酸序列；所述蛋白的一部分包括与人ALPI的冠状结构域侧翼的N端区域具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的200-365个、更优选地250-365个、更优选地300-365个、更优选地350-365个、更优选地360-365、最优选地365个连续氨基酸的氨基酸序列；并且所述蛋白的一部分包括与人ALPI的冠状结构域侧翼的C端区域具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的40-54个、优选地45-54个、更优选地50-54个、更优选地52-54个、最优选地54个连续氨基酸的氨基酸序列。冠状结构域的N端侧翼区域意为在冠状结构域的左手边邻近(即，相距优选地少于20个氨基酸、更优选地少于15个、更优选地少于10个、更优选地少于5个、更优选地少于3个、更优选地少于2个，最优选地没有氨基酸)冠状结构域序列(图1中加下划线的所述冠状结构域的对应的氨基酸)的一段氨基酸，其中左手侧定义为携带第一个氨基酸的氨基(NH2)的那部分肽链。冠状结构域的C端侧翼区域意为在冠状结构域的右手边对应邻近(即，相距优选地少于20个氨基酸、更优选地少于15个、更优选地少于10个、更优选地少于5个、更优选地少于3个、更优选地少于2个，最优选地没有氨基酸)冠状结构域序列的位置的一段氨基酸(图1中加下划线的所述冠状结构域的对应的氨基酸)，其中右手边定义为携带最后一个氨基酸的游离的α羧基的那部分肽链。在人类中，迄今为止已经识别了四种碱性磷酸酶同种型。这些同种型是肠碱性磷酸酶(ALPI)、胎盘碱性磷酸酶(ALPP)、胎盘样碱性磷酸酶(GCAP)和肝/骨/肾(或非组织特异性)碱性磷酸酶(TNAP)。前三个一起位于2号染色体上，而非组织特异性同种型位于1号染色体上。AP的确切生理功能不明，但是AP似乎参与大量的生理过程。人碱性磷酸酶的序列为本领域已知的并且可以在相关数据库中容易地查找。为了确定PLAP的冠状结构域和ALPI的催化结构域的序列同一性的百分数，优选地使用各自的参考序列。人ALPI的参考序列被描述为SEQIDNO:2。人ALPP的参考序列被描述为SEQIDNO:3。在图1中的那些参考序列中，通常称为冠状结构域的序列为加下划线的。胎盘碱性磷酸酶在本文中被缩写为ALPP或PLAP。缩写ALPI或IAP指肠碱性磷酸酶。胎盘样2碱性磷酸酶在本文中被缩写为ALPP2、ALPG或GCAP，并且缩写ALPL、TNSALP、TNAP或BLK在本文中被用来指肝/非组织特异性碱性磷酸酶。针对一个或相同的碱性磷酸酶的不同缩写在本文中可以互换使用。从构象的角度来看，碱性磷酸酶大体上由两个结构域组成：冠状结构域和活性位点结构域(MammalianAlkalinePhosphatases:FromBiologytoApplicationsinMedicineandBiotechnology,JoséLuisMillan；Wiley,2006)。活性位点结构域可以被划分为单独的部分，如催化残基和三个金属离子位点(Zn1、Zn2和Mg3)。从一级结构的角度来看，清楚地，冠状结构域的侧翼为形成活性位点结构域的氨基酸。因此，在优选的实施方式中，催化结构域不是由连续的氨基酸序列构成的，而是在冠状结构域的侧翼。参考表示一种根据本发明的碱性磷酸酶的氨基酸序列的SEQIDNO:1——所述SEQIDNO:1不以任何方式限制本发明——冠状结构域优选地包括366-430位的氨基酸，而催化结构域优选地指成熟蛋白序列中366位之前的以及430位之后的其余序列，如图1中所描述。碱性磷酸酶的氨基酸序列以及催化结构域和冠状结构域的相对位置是本领域技术人员已知的(MammalianAlkalinePhosphatases:FromBiologytoApplicationsinMedicineandBiotechnology,JoséLuisMillan；Wiley,2006)。在一些实施方式中，根据本发明的蛋白由此包括与人ALPP的冠状结构域具有至少90％的序列同一性的序列，以及与人肠碱性磷酸酶的催化结构域具有至少90％的序列同一性的序列。优选地，与ALPP的冠状结构域具有所述序列同一性的所述序列在根据本发明的蛋白中位于与ALPP的冠状结构域在天然ALPP蛋白中大致相同的位置，即如图1中所指示的相对于1位在大致366-430位(表示冠状结构域的序列是加下划线的)。与ALPP的冠状结构域具有序列同一性的序列优选地与ALPP的冠状结构域的天然序列具有至少95％、更优选地至少98％、最优选地100％的序列同一性，所述天然序列由SEQIDNO:3中加下划线的366-430位的氨基酸表示。氨基酸或核酸序列的同一性的百分数，或术语“序列同一性％”在本文中定义为在比对两个序列和引入的间隙(如果必要的话)以获得最大百分数的同一性之后，候选氨基酸或核酸序列中与参考序列中的残基相同的残基的百分数。在优选的实施方式中，所述至少百分数的序列同一性的计算在不引入间隙的情况下进行。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的，例如，“Align2”或美国国家生物技术信息中心(CNBI)的BLAST服务。优选地，具有与ALPI的冠状结构域侧翼的N端部分至少90％一致的序列的所述序列在根据本申请的蛋白中位于与ALPI的该部分在天然ALPI蛋白中大致相同的位置，即如由图1中SEQIDNO:1中的1-365位所表示的。进一步，与ALPP的催化结构域具有序列同一性的序列优选地与由图1中SEQIDNO:2中的1-365位所表示的ALPP的冠状结构域侧翼的N端部分具有至少95％、更优选地至少98％的序列同一性，条件是279位的氨基酸是L并且对应328位的氨基酸是V。最优选地，除了279位的氨基酸是L并且328位的氨基酸是V，与ALPI的催化结构域的N端部分具有序列同一性的序列与ALPI的催化结构域的天然序列相同。优选地，具有与ALPI的冠状结构域侧翼的C端部分至少90％同一性的序列的所述序列在根据本发明的蛋白中位于与ALPI的该部分在天然ALPI蛋白中大致相同的位置，即如由图1中SEQIDNO:1中的431-484位所表示的。与ALPP的冠状结构域侧翼的C端部分具有序列同一性的序列优选地与ALPP的冠状结构域侧翼的并且由SEQIDNO:2中的431-484位所表示的C端序列具有至少95％、更优选地至少98％的序列同一性，条件是478位的氨基酸是L。最优选地，除了478位的氨基酸是L，与ALPI的催化结构域的该C端部分具有序列同一性的序列与ALPI的催化结构域的天然序列相同。先前，研究表明具有与ALPP的冠状结构域具有序列同一性的冠状结构域序列并且具有与ALPI的催化结构域具有序列同一性的催化结构域的碱性磷酸酶(在本文中被称作催化ALPI/冠状ALPP(催化ALPI/冠状ALPP))在低Zn2+培养基中保持它的初始比活性。这些结果表明在体内的活性不依赖于Zn2+。相反，在相同的低Zn2+条件下，ALPI快速失去其活性。发明人推断活性不依赖于Zn2+的这种酶可用于Zn2+消耗是病理的一部分(例如，一般来说，营养缺陷、酗酒和肠道完整性受损、包括败血症的慢性感染，或炎性疾病)或Zn2+的添加(在生产中作为稳定剂)可能是禁忌(例如，败血症的急性阶段、自身免疫疾病)的疾病。除了生产和应用优势，催化ALPI/冠状ALPP也利于储存期间的稳定性。催化ALPI/冠状ALPP的性能详细描述在WO2008/133511中。本申请意外地表明根据本发明的蛋白在低Zn2+浓度下甚至更稳定。本文表明，涉及关于先前描述的催化ALPI/冠状ALPP序列的三个位置的特定修饰甚至更能增加对Zn2+的非依赖性。总之，由此已经表明天然AP(如ALPI)在具有低Zn2+浓度的环境中失去其催化活性，催化ALPI/冠状ALPP(如WO2008/133511中描述的)在具有低Zn2+的环境中保持其活性，但是在添加例如Zn2+螯合剂时失去其活性，而根据本发明的蛋白即使在存在锌螯合剂(如EDTA)时仍能保持其较多的活性。因此，在严重的Zn2+消耗是病理的一部分的疾病中，所述天然AP不能够在认为它是最有益的位点处(例如，在炎症位点处)展现其酶活性。相反，重组AP不受非常低的Zn2+浓度的影响，特别是根据本发明的蛋白能在具有非常低的Zn2+浓度的环境下，例如，在炎症位点处保持其活性。因此，这样的酶对起因于或伴有低Zn2+水平的疾病的治疗是非常有用的。与根据本发明的蛋白相比，这样降低的Zn2+水平使得其他碱性磷酸酶活性更低。人体中的一些酶的活性依赖于Zn2+，举例来说，如果存在足够水平的Zn2+，免疫应答则更有效。已知免疫系统的固有部分以及特定的部分受锌影响，并且已经确定包含锌的蛋白会在炎症位点积累。在健康个体中，Zn2+的血清参考值在10和20μM之间。例如在酗酒时或在营养不良期间，这些水平可以降低至小于10μM或甚至小于1μM。此外，(亚)慢性炎症，如类风湿性关节炎、败血症和克罗恩病，呈现有血清锌缺乏。在这样的Zn2+缺乏环境中，根据本发明的蛋白仍然是非常有活性的，而其他已知的碱性磷酸酶或多或少都会快速失去其磷酸酶活性。因此，本发明提供这样的见解，即根据本发明的蛋白在治疗伴有局部或全身性Zn2+缺乏的疾病中是特别有用的。相较于其他已知的碱性磷酸酶，根据本发明的蛋白在低Zn2+条件下更有活性。因此在优选的实施方式中，本发明提供了根据本发明的蛋白，用于预防或治疗伴有Zn2+缺乏的疾病。优选地，所述疾病包括炎性疾病、更优选地选自由自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血症、神经性皮炎、炎性肝病、炎性肺病和炎性肾病组成的组。术语“锌缺乏”或“Zn2+缺乏”意思是可用的锌的量(局部地)不足以确保细胞和/或酶活性不受妨碍。锌缺乏可以是绝对的或相对的，其中绝对的锌缺乏可以通过参照本领域已知的健康个体中的参照值来容易地确定。相对的锌缺乏，例如，可以出现在锌浓度仍然在由健康个体中的参照值设定的界限内，但是所需要的锌浓度比正常的更高的情况中，例如在炎症期间。在一些实施方式中，锌缺乏意思是受试者的(局部)锌浓度低于10μM，更优选地低于5μM，更优选地低于2μM，更优选地低于1μM，更优选地低于0.1μM，更优选地低于0.05μM，更优选地低于0.02μM，更优选地低于0.01μM，更优选地低于0.005μM，最优选地低于0.002μM。在一些实施方式中，锌缺乏意思是(局部)锌浓度小于不受妨碍的细胞和/或酶活性所必需的。术语“炎性疾病”意思是起因于或伴有对损伤或破坏的组织的保护性组织应答的任何疾病，所述保护性组织应答用于摧毁、稀释或隔绝有害试剂和损伤组织两者。急性炎症的典型症状是疼(痛)、发热(灼热)、泛红(皮肤发红)、肿胀(肿块)和功能缺失(机能丧失)。典型地，炎症的特征是炎性参数，比如C-反应蛋白、白细胞和细胞因子(IL-6、TNF-α等)的增加。尽管炎症起初本质上是保护性的，但是紊乱的炎性疾病，如类风湿性关节炎和(其他)自身免疫疾病也落在“炎性疾病”的定义内。在优选的实施方式中，本发明的蛋白用于治疗这样紊乱的或有害的炎性疾病。此外，在标准药代动力学分析期间，本发明已经意外地观察到根据本发明的蛋白靶向若干器官，特别是皮肤、肾、脾、肝、肺、脑、脂肪、骨和结肠。使用本发明放射性碘结合的蛋白，已经观察到相对于催化ALPI/冠状ALPP的器官/血液比率百分数，根据本发明的蛋白的器官/血液比率百分数特别有利于皮肤、肾、脾、肝、肺、脑、脂肪、骨和结肠，即根据本发明的蛋白比已知的催化ALPI/冠状ALPP蛋白相对更能靶向这些器官。特别地，根据本发明的蛋白比催化ALPI/冠状ALPP蛋白以更低的浓度存在于血液中，而以更高的浓度存在于所提到的器官中。当需要治疗与这些器官相关的病况，如肝神经性皮炎、肾损伤、肝纤维化、低磷酸酯酶症等时，治疗需要较少的蛋白，从而降低了成本和/或增加了效力。包含涉及这些器官的疾病的实验已经进行(低磷酸酯酶症)，在进展中(肾病)，或在计划中。因此，本发明提供了这样的蛋白，当与本领域已知的碱性磷酸酶比较时其表现出改善的锌非依赖性和药代动力学行为。发明人已经在各种工作实施方式中证明，根据本发明的蛋白用作药物。可以用根据本发明的蛋白治疗的疾病或病况包括：肾功能减退、肾损伤、肾衰竭和低磷酸酯酶症。进一步，因为构成根据本发明的碱性磷酸酶蛋白超过已经在使用的已知碱性磷酸酶蛋白的改进的具体特征，根据本发明的蛋白不仅用于肾功能减退、肾损伤、肾衰竭和低磷酸酯酶症，而且也用于预防或治疗自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血症、神经性皮炎、炎性肝病、炎性肺病和炎性肾病。这些都是影响根据本发明的蛋白靶向的器官的和/或伴有由(相对的)锌缺乏的疾病。术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”在本文中定义为出于防止受试者罹患特定疾病的意图，向所述受试者施用根据本发明的蛋白(的行为)。尽管治疗的意图是防止所述受试者罹患所述疾病，但因为受试者，例如，不一定易受特定治疗方案的影响，在一次或多次施用根据本发明的蛋白之后疾病状态未必被完全预防。优选地是，总体上，所述预防效力的实现体现在当与没有接受根据本发明的蛋白的一组受试者比较时，为了预防特定疾病而已经接受所述蛋白的一组受试者至少表现出在疾病严重性方面降低的增长，或例如所述疾病较少的并发症。例如在肾病的情况下，优选地，相对于没有用根据本发明的蛋白治疗的受试者，处于罹患肾病风险中的受试者在用所述蛋白治疗之后表现出肾功能更少的下降。如果受试者罹患了施用蛋白以便预防的那种疾病，可以提供进一步的施用(本文中称作“治疗(treatment)”)以防止所述疾病状态的恶化，或出于治愈的意图而作为治疗来提供进一步的施用。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”在本文中定义为出于治愈患有(预期的)疾病的受试者或改善、减轻、除去所述受试者的疾病症状的意图，向所述受试者施用根据本发明的蛋白(的行为)。尽管治疗的意图是治愈所述受试者，但因为受试者，例如，不一定易受特定治疗方案的影响，在一次或多次施用根据本发明的蛋白之后所述受试者未必会被治愈。优选地，总体上，所述治疗效力的实现体现在当与未治疗(或安慰剂治疗)组相比较时，已经用根据本发明的蛋白治疗的受试者至少表现出在它们的疾病状况方面的改善，或例如所述疾病的较少的并发症。例如在肾病的情况下，优选地，相对于没有用根据本发明的蛋白治疗的受试者，受试者在用所述蛋白治疗之后表现出改善的肾功能或肾功能更少的下降。本发明进一步提供了包括编码根据本发明的蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中使用时，术语“核酸序列”和“多核苷酸”还包含基于和/或来源于核酸序列的非天然分子，如，例如人工修饰的核酸序列、肽核酸以及包括至少一种修饰核苷酸和/或非天然核苷酸的核酸序列，如，例如肌苷、LNA、吗啉代和2’-O-甲基RNA。也提供了包括这样的根据本发明的多核苷酸的载体。这样的载体优选地包括另外的核酸序列，如对于编码磷酸酶的核酸序列的转录/翻译所必需的元件(例如启动子和/或终止子序列)。所述载体还可以包括编码选择标记(例如抗生素)以选择或维持用所述载体转化的宿主细胞的核酸序列。适合的载体的示例是克隆载体或表达载体。根据本发明可以使用适合于在所选择的宿主细胞中介导表达的任何载体，其在宿主细胞中或成整体或为游离型复制。载体可以是质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和/或其衍生物)、粘粒、噬菌体或噬菌粒、游离型载体或人工染色体。这样的多核苷酸或载体对于根据本发明的蛋白的生产是非常有用的，并且还可以用于基因疗法。因此，本发明提供了作为药物的根据本发明的蛋白。可能用根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体来治疗罹患或有风险罹患上文提到的要治疗的疾病中的任一种的患者，以便在体内表达根据本发明的蛋白。因此，本发明还提供了根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体作为药物的用途，所述药物优选地用于预防或治疗肾功能减退、肾损伤、肾衰竭、低磷酸酯酶症、自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血症、神经性皮炎、炎性肝病、炎性肺病和炎性肾病。还提供了根据本发明的蛋白、多核苷酸或载体在预防或治疗炎性疾病、肾病或低磷酸酯酶症的方法中的用途。还提供了根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体在制备药物中的用途，所述药物优选地用于预防或治疗肾功能减退、肾损伤、肾衰竭、低磷酸酯酶症、自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血症、神经性皮炎、炎性肝病、炎性肺病和炎性肾病。在另一个实施方式中，本发明提供了根据本发明的碱性磷酸酶蛋白、根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗伴有局部或全身性Zn2+缺乏的疾病，优选地所述疾病是炎性疾病、肾病或低磷酸酯酶症，优选地所述疾病包括炎性疾病，更优选地为选自由自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血症、神经性皮炎、炎性肝病、炎性肺病和炎性肾病组成的组的疾病。在又另一实施方式中，本发明提供了用于治疗待治疗优选地伴有Zn2+缺乏的疾病的受试者(优选地人)的方法，所述方法包括施用有效量的根据本发明的磷酸酶，其中所述疾病优选地包括炎性疾病，更优选地选自由自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血症、神经性皮炎、炎性肝病、炎性肺病和炎性肾病组成的组。因此，本发明提供了根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体，在各种疾病中的用途。根据本发明的蛋白因其器官分布尤其用于治疗涉及胃肠道、肾皮肤、肝、肺、脑、脂肪组织或骨的疾病。在一个优选实施方式中，本发明提供了根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体在治疗肾病中的用途。尽管对肾病的病理生理学持续了解，并且存在改善肾功能的疗法[LameireNH,Acutekidneyinjury:anincreasingglobalconcern,Lancet,2013Jul13；382(9887):170-9]，但是仍然需要治疗肾损伤和/或改善肾功能的可选治疗。本发明通过提供根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体而提供这样的可选治疗。在优选实施方式中，本发明提供了根据本发明使用的蛋白、多核苷酸和/或载体，其中所述肾病选自肾衰竭、急性肾损伤、慢性肾病、缺血性肾病的组。术语急性肾损伤(AKI)，优选地称作急性肾衰竭意思是肾功能迅速丧失。基于特征性化验结果，如升高的血尿素氮和肌酐，或肾没有生产足够量的尿的能力诊断AKI。AKI可以被细分为肾前AKI、内在AKI和肾后AKI。肾前AKI是由到达肾的有效血流降低造成的。对肾前AKI的典型化验结果为：Uosm：>500，UNa：<10，FeNa：<1％，并且BUN/Cr比：>20。当对肾自身的损伤是原因时，使用术语内在AKI。对内在AKI的典型化验结果为：Uosm：<350，UNa：>20，FeNa：>2％，并且BUN/Cr比：<15。如果尿道阻碍是AKI的原因，术语肾后AKI被留给这些状况。对肾后AKI的典型化验结果为：Uosm：<350，UNa：>40，FeNa：>4％，并且BUN/Cr比：>15。在世界范围内存在用于慢性肾病分类的一些指南。举个例子来说，国家肾脏基金会(2002)的分类标准“用于慢性肾病的肾脏病预后质量(K/DOQI)临床实践指南(K/DOQIclinicalpracticeguidelinesforchronickidneydisease)”被描述在下文中。技术人员可以基于其他指南选择不同的患者群体。典型地，肾小球滤过率(GFR)<60mL/min/1.73m2达3个月的所有个体都被分类为患有慢性肾病，无论是否存在肾损伤。用于将这些个体包括进来的基本原理是肾功能降低到该水平或更低水平表示丧失了成人正常肾功能水平的一半或更多，这可能是与许多并发症相关。一般地，具有慢性肾损伤的个体被分类为患有慢性肾病，而不管GFR的水平。用于将具有GFR>60mL/min/1.73m2的个体包括进来的基本原理是尽管有实质性肾损伤，但是GFR仍然可以被维持在正常水平或增加的水平，并且具有肾损伤的患者处于对慢性肾病的两个主要结果的增加风险中：肾功能缺失和心血管疾病的发展，这可能导致发病和死亡。尿中蛋白的缺失被认为是肾功能减弱和心血管疾病的独立标记。因此，如果有显著的蛋白缺失，英国指南会将字母“P”附到慢性肾病阶段。慢性肾病的5个阶段典型地按如下分类：阶段1：功能轻微减弱；具有正常或相对高的GFR(≥90mL/min/1.73m2)的肾损伤。肾损伤被定义为病理或损伤标记异常，包括血检或尿检或成像研究中的异常。阶段2：伴随肾损伤的GFR的轻度降低(60–89mL/min/1.73m2)。肾损伤被定义为病理异常或损伤标记，包括血检或尿检或成像研究中的异常。阶段3：GFR的中度降低(30–59mL/min/1.73m2)。为筛查和转诊的目的，英国指南区分阶段3A(GFR45–59)和阶段3B(GFR30–44)。阶段4：GFR的严重降低(15–29mL/min/1.73m2)。准备肾替代疗法。阶段5：确定为肾衰竭(GFR<15mL/min/1.73m2)，永久性肾替代疗法(RRT)，或终末期肾病(ESRD)。术语肾衰竭目前表示肾不能充分地过滤来自血液的废物的医学病况。两个主要形式是急性肾损伤，其加以适当的治疗经常是可逆的，以及慢性肾病，其经常是不可逆的。缺血性肾病指那些状况，其中肾小球滤过率的临床上明显的下降或肾实质缺失是由血流动力学上显著的肾动脉狭窄或导致肾脏低血压的其他原因，如，例如血液动力学休克或用于暂时中断血流的动脉夹的使用而造成的。发明人已经显示根据本发明的蛋白用于治疗低磷酸酯酶症(HPP)。这是相当出乎意料的，因为先前使用TNAP治疗低磷酸酯酶症的实验未能显示酶替代疗法的效力。因此开发了TNAP酶和骨归巢肽之间的人工融合蛋白(Whyte等,NEnglJMed.2012年3月8日；366(10):904-13)。意外地，根据本发明的蛋白不需要这样的骨归巢肽并且能够在小鼠模型中有效地减少低磷酸酯酶症的症状标志。在另一个优选实施方式中，本发明由此提供了根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体在治疗低磷酸酯酶症中的用途。低磷酸酯酶症的代谢基础源于编码非组织特异性碱性磷酸酶(TNAP)的基因中的分子缺陷。TNAP是附着在成骨细胞和软骨细胞的细胞膜的外表面的胞外酶。TNAP通常水解数种底物，包括无机焦磷酸盐(PPi)和吡哆醛5’-磷酸盐(PLP)，维生素B6的主要形式。当TNAP低时，无机焦磷酸盐(PPi)在细胞外积累并且强力抑制羟磷灰石的形成(矿化)，从而在婴儿和儿童中造成佝偻病并且在成人中造成软骨病(软骨)。PLP是维生素B6的主要形式并且必须被TNAP脱磷酸为吡哆醛(PL)以跨越细胞膜。脑中的维生素B6缺乏会损坏神经递质的合成，这可以造成癫痫。在一些情形中，脱水焦磷酸钙(CPPD)晶体在关节中的沉积可以造成假痛风。现今尚没有批准用于HPP的疗法。目前的治疗由缓解症状、维持钙平衡以及按需要施加物理、专业、牙科和整形外科干预组成。在一名婴儿中的二磷酸盐(焦磷酸盐合成类似物)施用对于骨骼没有可辨别的效果，并且婴儿的疾病继续发展直到在14个月的年纪死亡。在两名受到严重影响的婴儿中进行的骨髓细胞移植产生了放射影像和临床上的改善，但是效力的机理未被完全了解并且仍然存在显著的发病率。用正常血清或用来自具有佩吉特氏骨疾病(Paget’sbonedisease)的患者的富含ALP的血清的酶替代疗法无益[WhyteMP,ValdesR,RyanLM,McAlisterWH(1982年9月)."Infantilehypophosphatasia:enzymereplacementtherapybyintravenousinfusionofalkalinephosphatase-richplasmafrompatientswithPagetbonedisease)".J.Pediatr.1984年12月."Enzymereplacementtherapyforinfantilehypophosphatasiaattemptedbyintravenousinfusionsofalkalinephosphatase-richPagetplasma:resultsinthreeadditionalpatients".J.Pediatr.105(6):926–33]。这些酶替代疗法被认为是无效的，因为人们认为碱性磷酸酶的功能是在骨表面而不是在血液中。因此，改善酶替代疗法的效力的另外的尝试围绕靶向骨的TNAP酶进行，而取得令人满意的结果[Whyte等NEnglJMed.2012年3月8日；366(10):904-13]。意外地，本发明表明，在不引入人工骨靶向部分的情况下，根据本发明的蛋白在低磷酸酯酶症的小鼠动物模型中是有益的。本发明的蛋白超过Whyte等和Millan等[J.BoneMiner.Res.2008；23(6):777-787]所描述的那些蛋白的一个优势在于，因为不存在人工骨靶向部分，预期本发明的蛋白是免疫原性更低的。本发明的蛋白由与天然存在的人碱性磷酸酶蛋白具有高序列同一性的蛋白组成。此外，在生产的容易性和成本方面，本发明的蛋白优于靶向骨的碱性磷酸酶。在优选实施方式中，提供了用于治疗低磷酸酯酶症的根据本发明的蛋白、聚核苷酸和/或载体，其中所述磷酸酯酶症选自围产期低磷酸酯酶症、婴儿型低磷酸酯酶症、儿童型低磷酸酯酶症和成人型低磷酸酯酶症。围产期低磷酸酯酶症是低磷酸酯酶症的最致命形式。在子宫内，严重的矿物质不足会导致在妊娠期间和出生时的头膜(caputmembraneceum)、畸形肢或患肢缩短，以及由于呼吸衰竭的迅速死亡。婴儿型低磷酸酯酶症存在于生命的前6个月中。出生后的发育通常表现为正常，直到出现差的进食和不足的增重并且识别出佝偻病的临床症状。血钙过多和高钙尿也是常见的并且可以解释肾钙质沉着、肾损坏以及反复性呕吐的发作。估算生命第一年的死亡率为50％。儿童时期的低磷酸酯酶症具有多变的临床表现。由于牙骨质不发育、发育不全或发育异常，会出现乳牙的过早脱落(即在5岁之前)。通常，门齿最先掉脱；偶尔几乎全部的乳牙都过早脱落。牙科放射影像有时候会显示出佝偻病的“壳状牙”特有的放大的髓室和根管。患者还可能经历学步推迟、特征性鸭步、僵硬和疼痛的抱怨，并且具有符合非进行性肌病的四肢肌肉无力(尤其是大腿)。典型地，放射影像显示出佝偻病畸形以及靠近主长骨末端的特征性骨缺损(即从佝偻病生长板伸出到干骺端中的射线透射性的“舌”)。生长迟缓、频繁骨折和骨量减少都是常见的。尽管有全“开放的”囟门在放射影像研究上出现，这在受严重影响的婴儿和幼儿中仍是罕见的，因为存在颅缝的功能性骨性联结。“开放的”囟门的错觉是由大面积的矿物质不足的颅盖造成的。随后真实的早产儿颅缝骨融合可能提高颅内压力。成人型低磷酸酯酶症可以与佝偻病、乳牙的过早脱落或在相对良好的健康状况下成人牙列的提早脱落相关联。软骨病体现在由反复性愈合不佳的趾骨应力性骨折造成的脚痛，以及起因于股骨假骨折的大腿或臀部不适，当所述脚痛和大腿或臀部不适出现在放射影像研究中时，通过它们在邻近股骨的横向皮质中的位置来区分它们与大多数其他类型的软骨病(一般发生的)。一些患者罹患焦磷酸钙二水合物晶体沉积，伴随有偶尔的关节炎(假痛风)外显侵袭，这似乎是升高的内源性无机焦磷酸盐(PPi)水平的结果。这些患者还可能罹患关节软骨退化和焦磷酸盐关节病。放射影像可以揭示股骨近端的横向皮质中的假骨折、应力性骨折，并且患者可能经历骨量减少、软骨钙质沉着、焦磷酸盐关节病的特征，以及钙化关节周炎。在优选的实施例中，提供了用于治疗低磷酸酯酶症的根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体，其中所述治疗产生延长的存活；增加的体重；改善的骨骼表型(如，例如在松质骨和/或密质骨中的次级骨化中心的诱导、骨矿化的改善，或类骨质的诱导)；颅面缺损的减轻(如形状异常和冠状缝融合)；牙槽表型的改善(如臼齿高度和形式、牙质厚度和骨矿化的改善)；和/或患者的血浆PPi水平的降低。也提供了根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体在制备用于用于治疗或预防低磷酸酯酶症的药物中的用途，其中所述治疗导致延长的存活；增加的体重；改善的骨骼表型(如，例如在松质骨和/或密质骨中的次级骨化中心的诱导、骨矿化的改善，或类骨质的诱导)；颅面缺损的减轻(如形状异常和冠状缝融合)；牙槽表型的改善(如臼齿高度和形式、牙质厚度和骨矿化的改善)；和/或患者的血浆PPi水平的降低。也提供了用于治疗罹患或有风险罹患低磷酸酯酶症的受试者的方法，其中所述治疗导致延长的存活；增加的体重；改善的骨骼表型(如，例如在松质骨和/或密质骨中的次级骨化中心的诱导、骨矿化的改善，或类骨质的诱导)；颅面缺损的减轻(如形状异常和冠状缝融合)；牙槽表型的改善(如臼齿高度和形式、牙质厚度和骨矿化的改善)；和/或患者的血浆PPi水平的降低。在更优选的实施方式中，提供了用于治疗低磷酸酯酶症的根据本发明的蛋白、多核苷酸和/或载体，其中所述低磷酸酯酶症选自婴儿型、儿童型或成人型低磷酸酯酶症。更优选地，所述低磷酸酯酶症为婴儿型低磷酸酯酶症。在整个说明书、实施例和本领域文献中，其他命名被用来表示碱性磷酸酶的各自同种型。为了清楚起见，在下文表1中列出了常用的或本申请中使用的名称和缩写。表1：本专利申请中使用的或不同类型的碱性磷酸酶的众所周知的同义词或缩写术语“可分泌的(secretable)”意思是没有翻译后的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定被附着到成熟蛋白，从而确保蛋白能够被分泌而不是膜结合的。GPI锚定是在翻译后修饰期间可附着到蛋白的C端的糖脂。它由通过包含碳水化合物的连接体(葡萄糖胺和甘露糖通过糖苷键到肌醇)和经由乙醇胺磷酸(EtNP)桥连而连接到成熟蛋白的C端氨基酸的磷脂酰肌醇基团构成。疏水性磷脂酰肌醇基团内的两个脂肪酸将蛋白锚定到细胞膜。对于生产和下游加工有利的并且因此优选地是，根据本发明的蛋白不包括GPI锚定。清楚的是，所描述的可分泌的修饰的磷酸酶中的任一种(以及如此一来还有根据本发明的可分泌的蛋白)可以，例如，通过以与调控序列可操控的连接的方式将能够编码所述可分泌的磷酸酶的核酸引入到宿主细胞中，并且允许所述宿主细胞表达所述可分泌的磷酸酶，以及任选地从使宿主细胞生长和/或维持的培养基中分离所生成的磷酸酶来生产。然而，除了上文提到的GPI附着序列中的突变，存在制备无GPI锚定、分泌的蛋白的其他方法，例如：1)在作为膜锚定蛋白表达之后，磷脂酶可以被用来切割GPI锚定。因此本发明还提供用于生产分泌磷酸酶的方法，所述方法包括培养能够表达膜锚定的磷酸酶的宿主，允许所述宿主细胞生成所述磷酸酶并且用磷脂酶孵育得到的细胞并且任选地分离释放的磷酸酶。2)对GPI锚定的生成的干扰或在GPI锚定生成缺陷细胞(形式)的使用还可以被用来产生可分泌的形式的否则GPI锚定的蛋白。已经发现在GPI锚定生物化学缺陷细胞系的示例是例如Jurkat、AM-B、C84、BW、S49、CHO和Raji。在又另一实施方式中，本发明因此提供了用于生产分泌磷酸酶的方法，所述方法包括培养能够表达可分泌的(碱性)磷酸酶的宿主细胞(例如包括编码所提到的修饰的分泌(碱性)磷酸酶中的任一种的核酸序列的宿主细胞)，允许所述宿主生成所述可分泌的磷酸酶并且任选地分离所述生成的磷酸酶，其中所述宿主细胞不能够生物合成有功能的GPI锚定蛋白。然而，宿主细胞还可以生成具有有功能的GPI信号序列的磷酸酶。3)干扰或在转氨酶缺陷细胞的使用可以被用来抑制GPI锚定到蛋白的附着，致使蛋白为无锚定的并且可分泌的。这样的缺陷细胞已经通过CHO中的突变而获得。根据本发明的载体优选地包括附加的核酸序列，如编码磷酸酶的核酸序列的转录/翻译所必需的元件(例如启动子和/或终止子序列)。所述载体还可以包括为选择标记(例如抗生素)编码的核酸序列，以选择或维持用所述载体转化的细胞。优选地，根据本发明的多核苷酸和/或载体中不存在编码GPI锚定序列的核苷酸序列。适合的载体的示例为克隆或表达载体。本发明可以使用在适合的宿主细胞中介导表达的任何载体，在宿主细胞中或成整体或为游离型复制。载体可以是质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒或其衍生物)、粘粒、噬菌体或噬菌粒、游离型载体或人工染色体。此外，本发明还提供了如描述的包括根据本发明的蛋白、核酸序列或载体的宿主细胞。所述细胞可以是适合于重组蛋白的生产的真核细胞，优选地是哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞。适合的酵母宿主细胞包括，例如，酿酒酵母和毕赤酵母。优选的宿主细胞是哺乳动物(或更优选的人)来源的细胞，如BHK、HEK293、CHO或PerC6TM。在特别优选的实施方式中，宿主细胞是CHO细胞。编码根据本发明的蛋白的核酸序列、包括所述核酸序列的载体和/或包括所述核酸序列的宿主细胞在根据本发明的蛋白的生产中是非常有用的。根据本发明的蛋白包括糖基化位点，并且因此所述蛋白优选地在提供期望的糖基化模式的细胞中产生。在优选的实施方式中，所使用的生产系统是哺乳动物(例如人)体外生产平台，乃至更优选地所述生产包含大规模生产。在另一个优选的实施方式中，所使用的生产系统是其中引入了人工类人型糖基化模式的植物或酵母或哺乳动物(优选地非人)平台。在一个实施方式中，本发明因此提供了用于生产根据本发明的蛋白的方法，所述方法包括培养包括根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体的宿主细胞，并且允许所述宿主细胞生产所述蛋白。优选的宿主细胞是哺乳动物(或更优选的人)来源的细胞，如BHK、HEK293、CHO或PerC6TM。在特别优选的实施方式中，宿主细胞是CHO细胞。优选地，用于生产根据本发明的蛋白的方法进一步包括从所述培养物收获并且任选地纯化所述蛋白。如已经提到的，本文描述的根据本发明的蛋白在疗法中是有用的。在一个实施方式中，本发明提供包括根据本发明的蛋白的组合物，优选药物组合物。所述药物组合物任选地包括制药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述组合物可以作为任何形式，例如作为片剂、可注射的流体或输注流体等存在。而且，根据本发明的组合物、蛋白、核苷酸和/或载体可以经由不同途径，例如经静脉、直肠、支气管或口方式施用。仍另一种适合的施用途径是使用十二指肠滴。在优选的实施方式中，所使用的施用途径是静脉途径。对于本领域技术人员而言清楚的是，优选地递送有效量的根据本发明的蛋白。作为起始点，可以使用1-50,000U/kg/天。另一种适合的途径，例如对于HPP而言，是皮下途径。如果使用静脉施用途径，根据本发明的蛋白可以(至少在一定量的时间内)经由持续输注而被施用。根据本发明的所述组合物可以任选地包括制药学上可接受的赋形剂、稳定剂、激活剂、载体、渗透剂、推进剂、消毒剂、稀释剂和防腐剂。适合的赋形剂通常为药物制剂领域已知的，并且可以被技术人员容易地发现和应用，参考例如Remmington的PharmaceuticalSciences,MacePublishingCompany,PhiladelphiaPA，1985年，第17版。针对口腔施用，蛋白可以，例如，以固体剂型，如胶囊、(例如，具有肠溶衣的)片剂和粉末，或以液体剂型如酏剂、糖浆剂和混悬剂施用。AP可以与非活性成分和粉状载体如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等一起被包封在明胶胶囊中。可以被添加以提供期望的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其他已知的期望特征的附加非活性成分的示例是红氧化铁、硅胶、十二烷硫酸钠、二氧化钛、可食用的白墨水等。类似的稀释剂可以被用来制作压缩片剂。片剂和胶囊两者都可以被制造为缓释产品，以提供药物在数小时时期内的持续释放。压缩片剂可以是包有糖衣的或薄膜包衣的，以掩蔽任何不愉快的味道并且保护片剂避免空气，或是包有肠溶衣的，以用于在胃肠道中的选择性分解。用于口腔施用的液体剂型可以包含色素和风味料以增加患者的接受度。在优选实施方式中，包括根据本发明的蛋白的组合物适合于口腔施用并且包括肠溶衣以保护AP免于胃液和低pH的不利影响。肠溶衣和控释制剂是本领域公知的。本领域的肠溶衣组合物可以包括与一种或多种活性成分和其他赋形剂混合的水溶性肠溶衣聚合物，所述肠溶衣组合物分散在水性溶液中并且可以随后被干燥和/或制成丸。所形成的肠溶衣针对由储存期间的大气湿度和氧气以及由摄取后的胃液和低pH对根据本发明的蛋白的攻击提供抵抗，同时在存在于下肠道中的碱性条件下容易地被分解。本发明提供了根据本发明的蛋白作为药物优选地在治疗伴有局部或全身性锌缺乏、炎性疾病、肾病或低磷酸酯酶症的疾病中的用途。炎性疾病优选地选自由自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血症、神经性皮炎、炎性肝病、炎性肺病和炎性肾病组成的组。肾病优选地选自由肾衰竭、急性肾损伤、慢性肾病和缺血性肾病组成的组。低磷酸酯酶症优选地选自由围产期低磷酸酯酶症、婴儿型低磷酸酯酶症、儿童型低磷酸酯酶症和成人型低磷酸酯酶症组成的组。除了根据本发明的蛋白可以被并入药物组合物中，这样的磷酸酶还可以是营养组合物或营养食品的一部分。根据本发明的蛋白可以被添加到营养物(如牛奶)中，而且还可以在所述营养物中产生(例如通过分子工程学)。而且，可以制备片剂和/或胶囊，其随后被添加到营养物中或可以直接被人服用。进一步提供了用于治疗罹患炎性疾病、肾病或低磷酸酯酶症的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的根据本申请的蛋白，例如，具有磷酸酶活性的分离的或重组蛋白，或有效量的根据本申请的多核苷酸，或有效量的根据本申请的载体，其中所述蛋白的一部分包括与人PLAP的全长冠状结构域具有至少90％的序列同一性的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，所述蛋白的一部分包括与人ALPI的冠状结构域侧翼的N端区域具有90％的序列同一性的至少200个连续氨基酸的氨基酸序列，并且所述蛋白的一部分包括与所述人ALPI的冠状结构域侧翼的C端区域具有90％的序列同一性的至少40个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述全长蛋白包括与SEQIDNO:1的全长氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，条件是279位的氨基酸是亮氨酸(L)，328位的氨基酸是缬氨酸(V)并且478位的氨基酸是亮氨酸(L)。本发明将在以下非限制性实施例中被更详细地解释。附图说明图1：成熟蛋白LVL-RecAP、hIAP和hPLAP的氨基酸序列。推定的不同蛋白的冠状结构域是加下划线的。图2：与催化ALPI/冠状ALPP相比，LVL-RecAP的器官分布。所描述的是LVL-RecAP的器官比血液分布除以催化ALPI/冠状ALPP的器官比血液分布(＝y轴的比率)。较高的值表示当与催化ALPI/冠状ALPP比较时，LVL-RecAP能靶向相应的器官。图3：用媒介、1mgLVL-RecAP/kg/天，8mgLVL-RecAP/kg/天或16mgLVL-RecAP/kg/天治疗的Akp2-/-小鼠的存活。图4：罹患肾缺血/再灌注肾损坏的小猪的血清肌酐浓度。假装动物经受切除左肾的外科手术。然而，没有进行肾闭塞和再灌注。在接受0.32mg/kg/天的组中，在第0天，在再灌注之前施用一半的剂量，而其余的一半剂量在再灌注后8±2小时施用。在存活期的其余时间每天施用全剂量。图5：罹患缺血/再灌注肾损坏的小猪的AP浓度。假装动物经受切除左肾的外科手术。然而，没有进行肾闭塞和再灌注。在接受0.32mg/kg/天(200U/kg/天)的组中，在第0天，在再灌注之前给予一半剂量，而其余的一半剂量在再灌注后8±2小时时施用。在存活期的其余时间每天施用全剂量。图6：通过LVL-RecAP治疗的Alpl-/-小鼠的存活和体重改善。A)实验结束时存活的LVL-RecAP16。媒介、LVL-RecAP1和LVL-RecAP8的平均存活分别为p19、p22和p42.5。B)Alpl-/-媒介治疗的小鼠比WT同窝出生仔畜更轻；LVL-RecAP1治疗在p18时将体重改善到接近WT。媒介治疗的小鼠不比WT同窝出生仔畜存活更久，并且LVL-RecAP8治疗的小鼠在p53时仍然比同窝出生仔畜轻。然而，LVL-RecAP16治疗的小鼠在p53时呈现出与它们的WT同窝出生仔畜没有明显不同的体重。图7：LVL-RecAP治疗改善Alpl-/-小鼠的骨骼表型。来自用媒介、LVL-RecAP1、LVL-RecAP8、LVL-RecAP16治疗的Akp2-/-小鼠以及未治疗的WT对照的脊柱、前肢、胸腔、后肢和爪的放射影像(放大率5X)。A)Akp2-/-小鼠在椎骨、长骨和胸腔中表现出严重的软骨病(箭头)。次级骨化中心在Akp2-/-小鼠中丢失(星号)。在p18时，相较于未治疗的WT，用LVL-RecAP1的治疗轻微地矫正了该表型(箭头)。B)以LVL-RecAP8和LVL-RecAP16的治疗清楚地矫正了椎骨、长骨和胸腔中的骨表型。具体地，四肢最末端得到改善，如在次级骨化中心在跖骨区域的发育所证明的(箭头)。图8：LVL-RecAP治疗的Alpl-/-小鼠中改善的矿化。A)溶剂治疗的Alpl-/-(p18)、LVL-RecAP8(p51)、LVL-RecAP16p53和未治疗的WT小鼠p53的股骨的组织学分析。VonKossa染色显示出在增加LVL-RecAP8和LVL-RecAP16剂量的情况下更好的骨矿化。次级骨化中心和密质骨区域表明相较于未治疗的，矿化中的显著改善(黑色)。相较于WT，在LVL-RecAP8和LVL-RecAP16中存在较少的松质骨，但是在小梁区中存在增加的矿化，以及预期成为松质骨的更多的类骨质。B/C)对LVL-RecAP8和LVL-RecAP16的BV/TV和OV/BV的分析证明比年龄匹配的对照更小的骨体积和更大的类骨质体积。图9：LVL-RecAP治疗的Alpl-/-小鼠中的软骨病和血浆PPi水平的改善。A)溶剂治疗的Alpl-/-(p18)、LVL-RecAP8(p51)、LVL-RecAP16p53和未治疗的WT小鼠p53的股骨的组织学分析。股骨切片的Goldner三色染色显示出Alpl-/-中严重的软骨病，以及在增加LVL-RecAP8和LVL-RecAP16剂量的情况中，皮质区和次级骨化中改善的矿化。增大的类骨质区域的存在表明骨的沉积，但是还没有矿化。B/C)接受LVL-RecAP1、LVL-RecAP16的Akp2-/-小鼠和WT的血浆中的PPi浓度。LVL-RecAP1治疗导致Alpl-/-小鼠中升高的PPi水平在p18时显著降低。在p53时，相较于WT对照，LVL-RecAP16治疗导致对血浆PPi水平的矫正。图10：在LVL-RecAP治疗的Alpl-/-小鼠中没有颅面缺损。WT(A、D)、媒介治疗的Alpl-/-(B、E)和LVL-RecAP16(C、F)的小鼠头骨分别在p21和p53时的μCT等值面图像。治疗的Alpl-/-小鼠的额骨和顶骨与WT小鼠的额骨和顶骨都没有明显不同。成年的LVL-RecAP16-治疗的Alpl-/-小鼠的头骨与WT在大小和形状方面没有表现出不同。图11：LVL-RecAP治疗部分补救Alpl-/-小鼠中的牙槽表型。相较于WT对照在p25-26时的(A)放射影像和(D)μCT分析，(B、F)未治疗的Alpl-/-小鼠下颌骨以低矿化和减少的牙槽骨(AB)、具有薄牙质(DE)和宽髓室的短臼齿(M1、M2和M3)，以及缺损的(白色星号)门齿(INC)牙质为特征。相较于(E)对照牙周组织的组织学，(G)Alpl-/-小鼠表现出没有无细胞牙骨质(AC)，以及侵袭PDL空间的牙槽骨类骨质，产生骨牙粘连(星号)。(C、H)LVL-RecAP8治疗的Alpl-/-小鼠显示出臼齿高度、牙质厚度和骨矿化的改善的放射影像外观，但是门齿仍有缺陷。(I)组织学上LVL-RecAP未把无细胞牙骨质修复到齿根曲面。相较于(J、L)在p53时的对照，(K、M)LVL-RecAP16-治疗的Alpl-/-小鼠表现出臼齿周围减少的牙槽骨矿化。在治疗的小鼠Alpl-/-中臼齿形态和矿化表现相对正常，而门齿在齿根类似物上仍然为严重受影响的(白色星号)。相较于(N)WT对照臼齿的组织学，(P)LVL-RecAP16-治疗的Alpl-/-小鼠以矿化的牙槽骨和类骨质(星号)以及减少但是被保持的PDL空间为特征。较差的牙周附着被缺少牙骨质、PDL解体和分离，以及结合上皮的向下生长所证明。PDL附着(v形)到牙齿的小区域被标注。相较于(O)对照组织中的强壮和平行的PDL胶原纤维组构，由天狼猩红苦味酸(picrosirius)染色在偏振光下表示，(Q)LVL-RecAP16-治疗的Alpl-/-小鼠以较不有序的PDL为特征，尽管组构和附着区域邻近齿根附着的突破区存在(白色v形)。图12：RecAP治疗减弱人近端肾小管上皮细胞(ciPTEC)中的LPS诱导的细胞因子产生。CiPTEC被用recAP(1-5-10U/ml)预处理，接着由LPS-孵育(10μg/ml)24小时，并且随后在细胞中在基因水平上通过qPCR(10U/mlrecAP)，并且在上清液中在蛋白水平上通过ELISA测定TNF-α、IL-6和IL-8的产量。(C)recAP(10U/ml)在LPS暴露之前2小时、与LSP同时或在LPS暴露之后2小时施用，接着测定TNF-α、IL-6和IL-8蛋白含量。(D)ciPTEC被用失活的AP(缺少水解性能)预处理2小时，接着由LPS孵育(10μg/ml)24小时，其后测定TNF-α、IL-6和IL-8蛋白含量。对照细胞与培养基一起孵育。数据表示为平均值±SEM(n＝5)；#与对照相比，p<0.05；*与LPS相比，p<0.05。图13：recAP的效果不被限于LPS诱导的炎症并且为肾特异性的。CiPTEC被用recAP(10U/ml)预处理2小时，接着用(A)TNF-α(10ng/ml)或(B)LPS刺激的外周血单核细胞(PBMC，1ng/mlLPS)的上清液孵育24小时，其后在蛋白水平上通过ELISA测定IL-6和IL-8的产量。(C)PBMC被用recAP(10U/ml)预孵育2小时，接着LPS暴露(1ng/ml)孵育24小时。通过ELISA测定IL-6和IL-8的产生。用培养基孵育对照细胞。数据表示为平均值±SEM(n＝5)；#与对照相比，p<0.05；*与LPS相比，p<0.05。图14：recAP在体外LPS诱导的ATP释放上的作用。ciPTEC被用recAP(10U/ml)预处理，接着被LPS孵育(10μg/ml或100μg/ml)。30分钟后，收集上清液以通过生物发光确定细胞ATP释放。对照细胞与培养基一起孵育。数据表示为平均值±SEM(n＝5)；#与对照相比，p<0.05。图15：RecAP在体内阻止LPS诱导的肾功能退化。肾功能通过FITC(异硫氰酸荧光素)-海葱糖的t1/2的经皮测定来评估。在大鼠中AKI被LPS诱导(t＝0时，0.3mg/kg体重)，接着在t＝2时由recAP测定(1000U/kg体重)。在t＝2小时和t＝21.5小时时进行T1/2测定，(A、B：针对一只大鼠在两个分别的时间点获得的FITC-海葱糖动力学的实施例)。在t＝5和t＝16之间收集尿，并且在1.5和t＝24小时时对血浆采样，从而允许以t＝1.5和t＝24的平均血浆值计算(C)尿素分泌分数和(D)肌酐清除率。数据表示为平均值±SEM(安慰剂，LPSn＝6；LPS+recAPn＝5)；#与安慰剂相比，p<0.05。图16：RecAP在体内LPS诱导AKI期间防止肾损伤。(A)尿KIM-1分泌和(B)NGAL分泌，(C)血浆NGAL水平(t＝24)，以及(D)肾KIM-1蛋白含量通过ELISA确定。(E)石蜡肾切片被抗-KIM-1染色以使KIM-1蛋白表达可视化。比例尺：400μm(左栏)，200μm(右栏)。数据表示为平均值±SEM(安慰剂，LPSn＝6；LPS+recAPn＝5；尿参数：安慰剂n＝5)，#与安慰剂相比，p<0.05。图17.在上清液中，recAP对LPS诱导的细胞因子没有效果。收集LPS孵育(10μg/ml)或培养基孵育(对照)ciPTEC达24小时的上清液，用或不用recAP(10U/ml)孵育另外24小时，接着通过ELISA测定TNF-α、IL-6和IL-8。数据表示为平均值±SEM；#与对照相比，p<0.05；*与LPS相比，p<0.05。图18.人血清中的RecAP在25℃和在37℃的酶活性之间的相关性。图19.人血清中的LVL-RecAP在25℃和在37℃的酶活性之间的相关性。图20示出RecAP和LVL-RecAP在25℃和在37℃的活性/μg蛋白。数值表示对于给定的蛋白浓度在25℃和37℃之间的平均Δ活性。实施例实施例1LVL-RecAP在缓冲液中的稳定性材料：人重组碱性磷酸酶：1.sALPI-ALPP-CD(SEQIDNO:4)(DOM：2008年8月4日)2.LVL-recAP(SEQIDNO:1)(DOM：2011年10月14日)方法：锌依赖性：确定两批人重组碱性磷酸酶的酶活性和蛋白含量。随后针对每个条件制备100μg/mL的蛋白溶液，以确定如表2中列出的批次sALPI-ALPP-CD和LVL-recAP的锌依赖性。所制备的样品被储存在室温下并且在T＝0、T＝2h和T＝24h时分析酶活性。表2：重组碱性磷酸酶批次sALPI-ALPP-CD和LVL-recAP的条件，以确定在存在和不存在锌以及螯合剂(EDTA)的影响时它们的稳定性(保持的活性)。根据如SOPPC001中指示的标准程序确定酶活性。通过OD280测定(εrecAP1.01mL/mg/cmOD280)确定蛋白浓度。结果表3：不同的碱性磷酸酶在如表2中具体说明的条件下的活性。如表3中清楚地示出，在存在金属螯合剂(EDTA)时，LVL-RecAP比sALPI-ALPPCD明显更稳定(即显示出更多的残余酶活性；如由带星号的值指示的)，表明其活性较少依赖于Zn2+。实施例2LVL-RecAP在缓冲液中的稳定性材料人重组碱性磷酸酶：1.sALPI-ALPP-CD(DOM：2008年8月4日)2.LVL-recAP(DOM：2011年10月14日)方法在第二个独立实验中，针对表4中列出的若干个条件测试sALPI-ALPP-CD和LVL-recAP的稳定性。对于该实验中的两个重组AP批次，针对每个缓冲条件制备在pH为9.6的0.025M的甘氨酸缓冲液、人血清和人柠檬酸血浆中的100μg/mL的蛋白溶液，以确定稳定性。所有制备的重组AP样品在37℃下孵育，并且在T＝0、T＝0.5h、T＝1h、T＝2h和T＝24h时分析酶活性。表4：重组碱性磷酸酶批次sALPI-ALPP-CD和LVL-recAP在甘氨酸缓冲液中的条件，以确定在存在和不存在锌时它们的稳定性(保持的活性)以及螯合剂(EDTA或柠檬酸)的影响。结果表5–不同的碱性磷酸酶在如表4具体说明的条件下的活性。根据SOPPC001进行酶活性确定。通过OD280测定(εrecAP1.01mL/mg/cmOD280)确定蛋白浓度。如表5中清楚地示出并且与表3中的结果一致，在存在金属螯合剂(EDTA)时，LVL-RecAP比sALPI-ALPPCD明显更稳定(如由带星号的值指示)，表明其活性较少依赖于Zn2+。实施例3LVL-RecAP的热稳定性和PLP动力学方法蛋白表达构建包含分泌的、FLAG表位-标记的sALPI-PLAP-CD和LVL-RecAP的表达质粒，如先前所描述的那样(Kozlenkov等JBiolChem277,22992-22999(2002)，以及Kozlenkov等J.BoneMiner.Res.19,1862-1872(2004))。将FLAG-标记的酶通过电穿孔法瞬时转染到COS-1细胞中，随后在DMEM培养基中生长24h，如先前所描述的那样(Narisawa等Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.293,G1068-1077(2007))，然后用无血清Opti-MEM(LifeTechnologies)替换培养基。转染后60小时收集包含分泌蛋白的Opti-MEM，随后通过2-μm醋酸纤维素过滤器过滤并且用包含1mM的MgCl2和20μM的ZnCl2的TBS透析。酶动力学为了测定FLAG-标记的酶的相对催化活性，用0.2–0.6μgmL-1的抗-FLAGM2抗体(Sigma-Aldrich)包被微量滴定板。这些板用饱和浓度的FLAG-标记的LVL-RecAP或sALPI-PLAP在室温下孵育3h，之后用PBS洗涤所述板，所述PBS包含0.008％的Tween-80，并且比较PLP与M2-饱和的酶的相对活性。在标准分析缓冲液(50mM的Tris-HCl缓冲液、100mM的NaCl、1mM的MgCl2和20μM的ZnCl2)中pH7.4下测定生理学底物吡哆醛-5′-磷酸盐(PLP)(Sigma-Aldrich)的水解作用。使用PiColorLockGold(InnovaBiosciences)通过测定650nm下的吸光度(A650)来确定所释放的磷酸盐的浓度。针对不断增加的浓度的磷酸盐构建的标准曲线在0–50μM之间是线性的，并且所有的实验都被指定落在该水解的磷酸盐浓度范围内。针对所指出的底物浓度范围计算摩尔反应速率(表示为[Pi]s-1)，并拟合成与[底物]相对的单结合位点模型(GraphPadPrism)，以计算Km(没有应用双倒数作图法，因为在非常低的底物浓度下缺少相互换算的精确性)。针对PLP使用400μM的底物浓度。可溶性酶的浓度为约1nM，并且取决于每种酶的催化效率，孵育时间的范围从15–30min。为了在PiColorLockGold方法中确保稳态条件并且矫正非特异性底物信号，早期读数(5min时)被从后来的读数中减去，并且在对应的Pi标准曲线上测定ΔA650，所述Pi标准曲线是为每个实验单独构建的。为了测定热稳定性，在65℃下，在包含1mM的MgCl2和20μM的ZnCl2的1M的DEA(pH9.8)中孵育FLAG-标记的酶。样品在不同时间点被除去并且放置在冰上，随后使用pNPP并且使用以下方法测定残余活性：作为在25℃下、pH7.4时，在50mM的Tris-HCl缓冲液、100mM的NaCl中，405nm下的吸光度(A405)为时间的函数，使用pNPP(10mM)作为底物测定结合酶的活性，所述pNPP包含1mM的MgCl2和20μM的ZnCl2。还在不断增加的温度(25–100℃)下在该缓冲液中孵育酶10min，并且以相同的方式测定残余活性。结果FLAG-标记的酶的生产为了比较LVL-RecAP与sALPI-PLAP的动力学性质，FLAG-标记的序列被添加到两者的cDNA中，如先前比较研究PLAP和TNAP时所进行的(Kozlenkov等JBiolChem277,22992-22999(2002)，以及Kozlenkov等J.BoneMiner.Res.19,1862-1872(2004))。所述cDNA在COS-1细胞中表达，并且回收包含分泌酶的培养物上清液。通过抗-FLAG抗体蛋白质印迹分析确认表达和回收成功。生理学底物的动力学参数对炎症和癫痫涉及的生理学底物，具体地维生素B6同效维生素PLP，研究LVL-RecAP和sALPI-PLAP的磷酸水解酶性质。在生理pH(7.4)时，LVL-RecAP示出比sALPI-PLAP更低的Km(30.1μM对60.7μM)，表明在生理pH时，改进的LVL-RecAP相比sALPI-PLAP具有更高的PLP亲和性。酶稳定性通过热失活研究来研究LVL-RecAP中的氨基酸突变对酶的整体稳定性的影响。尽管sALPI-PLAP已经具有很大提高的耐热性(在77.8℃时，50％失活)，但是LVL-RecAP特别更加抵抗热失活(在80.6℃时，50％失活)。实施例4LVL-RecAP在大鼠中的药代动力学分布A部分用碘-125进行放射性标记使用如由Greenwood等*描述的氯胺-T方法用碘-125对sALPI-PLAP-CD蛋白和LVL-RecAP蛋白进行放射性标记。标记原理是基于碘化物“原位”氧化成碘原子，以及它亲核取代到酪氨酸残基的羟基邻位的酚环中。使用氯胺-T技术对sALPI-PLAP蛋白进行放射性碘化，以便获得～0.5mCi/mg的最终比活性和～1mg/mL(NaCl0.9％)的最终浓度。*F.CGreenwood,V.MHunter,H.GGlover,Thepreparationof131Ilabelledgrowthhormoneofhighspecificradioactivity,Biochem.J.)89(1963)114-123.A.1材料-sALPI-PLAP碱性磷酸酶(496.7U/mg)和LVL-RecAP(624U/mg)由AM-Pharma以6.34mg/mL的浓度提供在25％的甘油w/v、5mM的Tris、2mM的MgCl2、50μM的ZnCl2中，pH为8.0。sALPI-PLAP蛋白和LVL-RecAP蛋白被储存在4℃下。-碘-125放射性核素以10-5N氢氧化钠中的碘化钠的形式购自PerkinElmer(比活性：643.8GBq/mg–放射性核素纯度：99.95％)。-氯胺-T(N-氯-对甲苯磺酰甲基亚硝酰胺，MW227.6g/mol)、三氯乙酸、焦亚硫酸钠(MW190.1g/mol)和络氨酸购自Sigma。Tris缓冲液(5mM，pH为8)在Chelatec实验室中制备。-0.9％NaCl的是由提供。A.2方法将850μg的蛋白、约600μCi的Na125I、50μL的Tris缓冲液和10μL的氯胺-T(404.8nmol，50当量/蛋白)相继加入到1.5mL的Lo-Bind微量离心管中。在室温下搅拌1分钟进行反应。将2μL的放射性标记介质与5％的MBS溶液混合，并且放射性标记效率通过快速薄层层析法(ITLC)以10％的TCA作为洗脱液来评估(碱性磷酸酶在条带底部，而游离的125-碘在条带顶部被洗脱)。在将30μL的络氨酸溶液(在水中为10mg/mL)加入到粗混合物之后，碘化的sALPI-PLAP和碘化的LVL-RecAP通过凝胶过滤(G10，GEHealthcare)以0.9％的NaCl洗脱来纯化。将0.2mL体积的级分收集在试管中。在针对碘-125放射性核素校准的自动γ计数器(WallaceWizard2470–PerkinElmer)中测定每个级分的放射性。合并包含期望的放射性碘化产物的级分。通过ITLC验证放射性标记的化合物的放射化学纯度。A.3放射性标记的sALPI-PLAP蛋白的结果和表征由ITLC确定的两种蛋白的放射性标记的效率都超过85％。在G10纯化之后，两种蛋白的标记反应的放射纯度都高于97％。G10纯化后的放射性标记的sALPI-PLAP溶液的特点被总结在表6中。表6：纯化后的125I-sALPI-PLAP溶液的特点A.4碱性磷酸酶的活性经由ELISA评估放射性标记的sALPI-PLAP的酶活性。材料-碱性磷酸酶比色测定试剂盒(参考ab83369–批号：GR118166-3)。-在0.9％的NaCl中稀释为0.25mg/mL的未标记的重组人碱性磷酸酶-在0.9％的NaCl中稀释为0.25mg/mL的放射性标记的重组人碱性磷酸酶实验流程Abcam试剂盒使用磷酸对硝基苯酯(pNPP)作为磷酸底物，其在被AP脱磷酸时将变成黄色(λ最大值＝405nm)的。试剂盒可以检测样品中10-250μU的AP。对未标记和放射性碘化的sALPI-PLAP进行碱性磷酸酶比色测定。试验按照Abcam提供的实验流程中所描述的进行。简单地说，由0至20nmol/孔的pNPP标准品(最终体积：120μL)生成标准曲线。每孔加入10μL的AP酶溶液。并行地，将sALPI-PLAP的测试样品在分析缓冲液中稀释15000和8000倍。加入10和20μL的每组稀释液，并且用分析缓冲液将最终体积补到80μL。随后，向包含测试样品的每个孔加入50μL的pNPP溶液。标准品和样品反应液在黑暗中25℃下孵育60min。随后以20μL的终止液终止所有反应液。在酶标仪中测定405nm时的O.D.。绘制pNP标准曲线。将样品读数应用至标准曲线以获得由AP样品生成的pNP的量。可如下计算出测试样品的AP活性：sALPI-PLAP活性(U/m)＝A/V/Tx测试样品的稀释系数A：由样品生成的pNP的量(以μmol计)V：测试孔中加入的样品的体积(以mL计)T：以分钟计的反应时间sALPI-PLAP活性(U/mg)＝sALPI-PLAP活性(U/mL)/sALPI-PLAP的浓度(mg/mL)结果表7汇总了结果。表7：未标记的sALPI-PLAP和125I-ALPI-PLAP的酶活性未标记的和放射性标记的sALPI-PLAP的酶活性近似于约475U/mg。因此，ALPI-PLAP的活性不会被使用氯胺-T作为氧化剂的放射性碘化影响。B部分：125I-sALPI-PLAP蛋白在健康的大鼠中的生物分布研究B.1材料本研究使用的大鼠品系的特点呈现如下：动物管理饲养：大鼠在治疗前居住在动物设施中，并且在治疗后居住在放射性室。食物：可自由获得的大鼠饮食。在治疗前没有禁食期。水：通过聚丙烯瓶任意递送自来水。居住：在治疗前，动物三个一组居住在标准条件的聚碳酸酯笼子中，通过指明研究号码、动物号码、性别，以及研究开始和结束日期的卡片识别。在治疗后，为分泌平衡被指定的动物被转移到代谢笼(一个笼子一只)。环境：记录每天的温度。房间的温度在22和24℃之间。使用自动计时器控制人造光周期(10小时有光，14小时黑暗)。人员：所涉及的同事是具有相应资格并且经过培训的。挑选：接收时由研究负责人检查动物。只挑选健康的动物。特别注意动物中炎症反应的任何信号(例如，脓肿；皮肤炎症等)。B.2125I-sALPI-PLAP和125I-LVL-RecAP的给药溶液就在体内施用之前，将碘化的sALPI-PLAP和LVL-RecAP溶液在0.9％的NaCl中稀释为0.25mg/mL。B.3研究设计所述研究设计被呈现在表8和9中。表8：用于125I-sALPI-PLAP体内分布的研究设计组动物数量血液采样时间处死时间生物分布A13只雄性2mn、10mn30mn血液和器官A23只雄性5mn、45mn2h血液和器官A33只雄性15mn、4h6h血液和器官A43只雄性1h、3h、18h24h血液和器官A5*3只雄性NA48h血液和器官*单独居住在代谢笼中，在24h和48h时收集尿和粪便表9：用于125I-LVL-RecAP体内分布的研究设计组动物数量血液采样时间处死时间生物分布B13只雄性2mn、10mn30mn血液和器官B23只雄性5mn、45mn2h血液和器官B33只雄性15mn、4h6h血液和器官B43只雄性1h、3h、18h24h血液和器官B5*3只雄性NA48h血液和器官B.4施用在实验时，SpragueDawley大鼠的平均重量是约240g。以400μg/kg的剂量水平对未麻醉的大鼠静脉注射到侧面尾静脉(左侧)中，所述剂量水平对应每只大鼠96μg蛋白的量和每只大鼠约58μCi的活性。注射体积为约380μL。使用治疗当天每只大鼠的个体体重来计算个体剂量体积。大鼠被放置在竞争装置中。为了使尾部血管扩张，尾部被浸在温水(45℃)中，并且随后用酒精消毒。给药溶液被缓慢注射到尾静脉中。为了计算每只大鼠接受的实际剂量，在治疗前后对注射剂称重，并且在γ计数器中计算给药溶液的等分试样。B.5在各种器官中的分布在处死时，通过腹腔注射2.5mL/kg体重的盐酸氯胺酮(50mg/mL)和盐酸塞拉嗪(20mg/mL)在PBS中的混合物来麻醉动物。随后通过经由心脏穿刺的放血法快速处死大鼠。收集感兴趣的器官，接着把大于2g的器官切成碎片，如肝、胃、小肠和结肠。其后用生理血清漂洗每块，之后用柔软的纸巾擦拭，单独称重和计数。所选择的器官是肝、肾、心脏、肺、脾、骨骼肌、股骨、脑、甲状腺、胃、具有内容物的小肠、具有内容物的结肠、皮肤和肾周脂肪。组织放射性的计数是在针对碘-125放射性核素校准的自动γ计数器(WallaceWizard2470–PerkinElmer)中进行的。器官/组织中的放射性浓度表示为每克组织注射剂量的百分数(％ID/g)。数据分析包括注射剂量的百分数(％ID)和每个器官或组织的等量蛋白。对于界限清楚的器官，这是使用在整个器官中计数的放射性来计算的。对于血液，这是假设血液占总体重的6.4％来近似估算的。另外，计算组织中残留的放射性和血液中的放射性之间的比率(器官/血液比率)。最后，计算sALPI-PLAP的器官/血液比率和LVL-RecAP的器官/血液比率之间的比率(图2)。B.6在大鼠血液和血清中的分布血液和血清的放射性水平在处死时，从经由对被麻醉的大鼠进行心脏穿刺的放血法来获得血液样品，所述大鼠是通过腹腔注射2.5mL/kg体重的盐酸氯胺酮和盐酸塞拉嗪在PBS中的混合物而被麻醉的。在研究设计(表8和9)中指出的其他时间点，在没有麻醉的情况下使用23号蝶形针从侧面尾静脉(右侧)取血。每个血液样品都被收集到预先称重的具有凝血活化剂(Sarstedt)的微量离心管中。所述管被称重并且在γ计数器中测定放射性。血液样品在室温下孵育30min，随后以10000g离心所述血液样品5min来制备血清。将血清收集到预先称重的管中并且在γ计数器中计数。血液和血清中的放射性浓度表示为每mL中注射剂量和等量的sALPI-PLAP的百分数。数据分析包括针对总血液和血清计算的注射的百分数。表10和11示出在不同器官中测定的放射性分别相对于sALPI-PLAP和LVL-RecAP的血液血清放射性的的比率。图2示出LVL-RecAP的器官/血液比率与sALPI-PLAP的器官/血液比率的比率。例如，比率2表示LVL-RecAP比sALPI-PLAP靶向指示的器官2倍之多。当使用相同剂量时，更高的比率进一步表示LVL-RecAP在特定器官中出现相对更大的活性。表10–sALPI-PLAP的器官/血液比率表11–LVL-RecAP的器官/血液比率实施例5婴儿型低磷酸酯酶症的Akp2-/-小鼠模型婴儿型低磷酸酯酶症的Akp2-/-小鼠模型是本领域已知的(JDentRes90(4):470-476,2011)。简而言之，Akp2-/-小鼠是通过经由同源重组将Neo盒插入到鼠TNALP基因(Akp2)的外显子6中以功能性地失活Akp2基因，从而导致没有可检测的TNALPmRNA或蛋白而创建的。动物使用和组织收集程序遵守由桑福德伯纳姆医学研究所动物伦理委员会批准的实验流程。动物被以下任一种媒介(N＝10)治疗：1mgLVL-RecAP/kg/天(N＝10)；8mgLVL-RecAP/kg/天(N＝8)；或16mgLVL-RecAP/kg/天(N＝10)。测定存活并且评估骨骼发育。评估肾的矿化。测定血浆PPi、血浆吡哆醛、血浆钙和磷酸盐水平，针对不同治疗组测定股骨和/或胫骨长度。收集显微CT数据用于分析每个剂量中残留的骨质增生(hyperosteodosis)。结果-对16mg/kg/天治疗的动物，提高的长期存活(图3).-甚至在最高剂量下都存在对长骨中的骨骼缺损的(不完全的)补救(数据未示出)。-在牙齿表型中存在一定补救(数据未示出)。-似乎存在对颅缝早闭的补救(数据未示出；待确认)。-对于肾的工作仍在进行。有迹象表明在未治疗的小鼠的肾中存在矿物，而被在治疗的小鼠的肾中存在较少矿物(数据未示出)。实施例6猪肾模型中的缺血再灌注材料和方法媒介、对照和试验品信息对照和试验品制备在每次剂量施用之前，制备新鲜的对照品LVL-RecAP稀释溶液(安慰剂)用于使用在研究上，并且不使用时在2至8℃下冷藏储存。测试品LVL-RecAP按原样使用。当制备测试品制剂时不做纯度调整。测试品的制剂是通过与适当体积的灭菌生理盐水混合以获得0、0.96或4.8mg/mL的标称浓度来制备的。在每次剂量施用之前，使用灭菌设备和无菌技术在层流操作台制备制剂。制剂被分发到适合数量的褐色玻璃血清瓶中，使用之前保存在冰上，并且在制备2小时内使用于给药。偶尔，在研究期间按照需要进行额外的制备。给药制剂的分析在第0天(第3至7组)和第7天(第7组)，在制备品的每天给药之前收集最终给药制剂的两份0.5mL的样品。从中间层收集样品并且冷冻储存(-50至-90℃)以供将来可能的分析。检测系统信息动物获得和环境适应从MidwestResearchSwine,Gibbon,Minnesota接收雄性实验用幼年驯养约克郡杂种猪(MaleexperimentallyDomesticYorkshirecrossbredswine)(家养猪)(在接收时约8至10周龄)。在第10至28天的驯化周期期间，每天观察动物的总体健康和任何疾病信号。对粪便样品进行卵细胞和寄生虫评估，并且对于研究选择的动物，所有结果都是阴性的。随机、分配研究和维持使用独立的简单随机化方法的动物(随机选择重12.5至25.0kg)被分配到下面的表12中识别的对照和治疗组。为研究选择的动物在年龄和重量上尽量一致。在进入研究之前，兽医对动物的健康进行评估。为研究获得但没有选入研究的额外的动物被转移到常备动物栖息地。为每只动物分配使用在ProvantisTM数据收集系统中的动物号码，并且植入承载唯一识别号码的微芯片。每只动物还通过供应商的耳标来识别。个体的动物号码、植入物号码、耳标号码和研究号码都被包括在每只动物的唯一识别中。每个笼子通过动物号码、研究号码、组号码和性别来识别。在实验中动物单独居住在具有活动地板或具有塑性涂层地板的不锈钢移动笼中。这种居住设施为这些动物提供用于活动的充足空间。根据MPI研究SOP提供动物强化。每天提供大约12小时的荧光照明。黑暗周期由于研究相关的活动被间歇性中断。持续监控、记录温度和湿度，并且最大程度地维持在分别为61至81°F和30至70％的指定范围方案内。实际温度和湿度结果不被报告但是被维持在研究档案中。饮食(CertifiedLab#5K99,PMINutritionInternational,Inc.)经由限制喂食提供，除了在指定时间期间。按需要提供食品营养强化，包括纤维块或片。外科手术手术相关的药物下面的表13呈现研究期间使用的手术相关的药物和剂量水平。根据MPI研究SOP进行术前和术后治疗。手术前动物被禁食至少8小时，并且按表13中指示的进行麻醉和维持。体温被维持在37±3℃。在手术之前，进行超声以确定是否存在肾囊肿。如果没有观察到囊肿，切除左肾并且按下文描述的对右肾进行治疗。如果一个肾上存在囊肿，切除那个肾并且对侧肾经受堵塞手术。如果两个肾上都存在囊肿，将该动物从研究中去除，而不对其进行外科手术。外科手术使用由Lee等(J.Vet.Med.Sci72(1):127-130)公开的方法诱导肾缺血/再灌注损伤。一旦麻醉，所有动物以躺卧方式放置，并且手术位点以洗必泰擦洗和溶液交替擦拭做准备。进行中线剖腹手术以暴露两个肾。基于超声结果，切除左肾或右肾。对于第2组动物(假装)，随后移除并清理，以及插入的腹部垫，并且以温食盐水灌洗腹部。以常规方式闭合腹部，以缝皮钉和组织胶闭合皮肤。随后允许动物恢复。对于所有其他动物，在移除指定的肾之后，使用血管环隔离和收缩其余的肾血管。使用血管环堵塞血管达45(±1)分钟，之后允许血管再灌注。对照和试验品的静脉内单次剂量以0.333mL/kg(以一半剂量0.167mL/kg施用给第7组动物)的剂量体积在再灌注开始之前施用。对于所有的第1、5和6组动物(对照，0.32和1.6mg/kg)，随后移除并且清理植入的腹部垫，按上文描述的灌洗和闭合腹腔，并且允许动物恢复。对于所有的第7组动物(0.32mg/kg/天)，在腹股沟做出切口并且分离左侧或右侧股静脉。导管进入到血管中，并且所述导管在皮肤下穿行并且穿过胸腔上做出的切口取出。以非吸收性缝线将开口附着和锚定到肌肉。随后移除和清理植入的腹部垫，按上文描述的灌洗和闭合腹腔，并且允许动物恢复。试验和对照品施用在第0天，对照或试验品在再灌注开始之前分别以0、0.32和1.6mg/kg的全剂量静脉施用给所有的第1、5和6组动物。所有剂量以0.333mL/kg的剂量体积施用。同样在第0天，用两个单独的半剂量0.16mg/kg的方式，以0.32mg/kg的组合剂量水平，以0.167mL/kg的剂量体积，将试验品静脉施用给所有的第7组动物。第一剂量在再灌注开始之前施用，而第二剂量在再灌注后大约8(±2)小时施用。在第1至7天，在与初始第0天的剂量大约相同的时间(±2小时)，将0.32mg/kg/天(0.333mL/kg)的全剂量施用给所有的第7组动物。统计下面的表14定义本节描述的统计分析中使用的比较集。在每次时间间隔内将原始数据制成表，并且计算每个终点和小组的平均偏差和标准偏差。对于血清肌酐浓度，使用重复测量的协方差分析(RMANCOVA)将治疗组与参照组进行比较。重复测量的协方差分析(RMANCOVA)针对在三次或更多次测试后时间间隔处测量的终点，构建重复测量分析(混合模型)。对于每个终点，针对治疗效果、时间以及治疗和时间的相互作用测试模型。测试前数据(给药之前的最后一次测量)作为协变量被包括在模型中如果通过时间相互作用没有显著(p>0.05)的治疗，评估治疗的主要效果。如果治疗效果不显著(p>0.05)，结果被认为是不显著的，并且不对变量进行进一步分析。如果治疗效果显著(p<0.05)，针对每个治疗组与参照组的成对比较进行线性对比。如果治疗效果显著(p<0.05)，通过针对每个时间点的简单的“治疗”效果，将每个治疗组与合适的参照组比较。这些简单的效果成对比较由“通过时间治疗”相互作用获得。以0.05和0.01的显著水平报告所有的成对比较的结果。所有检验都是双尾检验。结果血清肌酐如图4中示出的，相对于试验前的值，在所有间隔处都存在肌酐的轻微至中等升高。肌酐倾向于在再灌注24小时时增加最多，并且随后随着之后的间隔逐渐降低。肌酐的变化是与继发于手术相关的肾损伤的减少的肾小球过滤一致的(数据未示出)。在大部分治疗组中，并且在大部分间隔处，试验品的施用倾向于减轻手术相关的肌酐升高，表明LVL-RecAP的保护效果。如图5中示出的，相对于试验前的值，在再灌注后24小时接受试验品的所有治疗组中，在碱性磷酸酶(ALP)中都存在剂量依赖型升高。ALP活性在接受≤1.6mg/kg的治疗组中逐渐降低，但是在接受0.32mg/kg/天的动物中持续逐渐增加。实施例7在人中的安全性试验材料和方法目的：为了评估在健康受试者中通过静脉(i.v.)注射施用单次和多次剂量的重组改进碱性磷酸酶(LVL-recAP)的安全性和耐受性。为了确定在健康受试者中i.v.注射单次和多次剂量的LVL-recAP之后，LVL-recAP的药代动力学(PK)。设计和治疗这是在计划数目为50名健康受试者中进行的2部分、单中心研究。A部分将是直至连续4组的随机、双盲、安慰剂对照、单次上升剂量(SAD)研究，每组8名健康的男性和女性受试者(6名接受LVL-recAP，而2名接受安慰剂)。将进行尝试以在每个治疗组中包括相等数量的男性和女性受试者，其中每组最少有2名并且最多有4名女性。单次剂量的LVL-recAP或安慰剂将通过1小时i.v.注射施用。B部分将是直至2组的随机、双盲、安慰剂对照、多次上升剂量(MAD)研究，每组9名健康的男性和女性受试者(6名接受LVL-recAP，而3名接受安慰剂)。将进行尝试以在每个治疗组中包括相等数量的男性和女性受试者，其中每组最少有2名并且最多有4名女性。受试者将在第1、3和5天接受LVL-recAP或安慰剂的1小时i.v.注射。以下治疗将被施用：A部分第1组：200U/kg的LVL-recAP的1小时注射第2组：500U/kg的LVL-recAP的1小时注射第3组：1000U/kg的LVL-recAP的1小时注射第4组：2000U/kg的LVL-recAP的1小时注射B部分第5组：在第1、2和3天接受500U/kg的LVL-recAP的1小时注射第6组：在第1、2和3天接受1000U/kg的LVL-recAP的1小时注射在对第1组第9天和第2组第4天完成A部分之后，将进行中间的PK评估。取决于结果，针对其余的SAD和MAD组的注射和PK采样安排可以调整。在该第一次人内研究中，参与A部分最低剂量水平的受试者(第1组)将根据旗标给药设计被给药，以确保最小风险。这意思是最初2名受试者将被给药。这些受试者中的一名将接受活性药物LVL-recAP，而另一名受试者将接受安慰剂。如果在给药后的最初24个小时陈队最初的受试者的安全性和耐受性结果是委托调查方可接受的，那么最低剂量水平的其他6名受试者将会以安慰剂对照随机方式给药(5名为有活性的以及1名为安慰剂)。观察期A部分：从施用药品之后的第1天直至48小时(第3天)。在第4、6、9和15天短时间走访临床研究中心。B部分：从最后一次施用药品之后的第1天直至48小时(第7天)。在第8、10、13和19天短时间走访临床研究中心。将在每个研究组的(第一次)药品施用之前3周内筛查受试者资格。后续检查将发生在第15天(A部分)和第19天(B部分)。受试者A部分：32名健康的男性和女性受试者B部分：18名健康的男性和女性受试者入选的主要标准性别：男性或女性年龄：18-55岁(包括18和55)身体质量指数(BMI)：18.0-30.0kg/m2(包括18.0kg/m2和30.0kg/m2)研究药品活性药品活性物质：LVL-recAP，改进的重组形式的内源性人碱性磷酸酶(AP)活性：用于磷酸的单酯的脱磷酸作用的水解酶适应症：急性肾损伤强度：600、1500、3000和6000U/mL剂型：i.v.注射制造商：PRA制药安慰剂物质：20mM的柠檬酸盐、250mM的山梨糖醇、2mM的MgCl2、50μM的ZnCl2，pH为7.0活性：无适应症：不适用强度：不适用剂型：i.v.注射制造商：NovaLaboratoriesLtd，GloucesterCrescent,Wigston,Leicester,LE184YL,UK评估标准安全性：不良事件(AE)、生命体征(包括仰卧位心脏收缩和舒张血压、脉搏、体温和呼吸速率)、12-导联心电图(ECG)、持续心脏监测(遥测)、临床实验室(包括临床化学(AP被认为是PK参数)、血液学和尿分析)检验、身体检查和抗药抗体(ADA)。药代动力学：基于PK参数的LVL-recAP血清浓度和AP活性分析结果对于所有给药组，给药和观察时期都已经结束，并且没有在任何组中观察到严重的不良事件。对所有测量参数的分析正在进行中。实施例8材料和方法小鼠先前已经报道过Alpl-/-小鼠的产生和特点(Narisawa等,1997)。Alpl-/-小鼠拟表型婴儿型HPP，包括TNAP的整体缺乏、PPi积累和矿化缺陷(Fedde等,1999；Narisawa等,2001；Anderson等,2004；Millan等,2008)。具有维生素B6的膳食增补简略地抑制癫痫并且延长寿命，直到出生后18-22天，但是矿物质不足和类骨质积累随着年龄持续恶化(Narisawa等,1997；Fedde等,1999；Narisawa等,2001；Millán等,2008)。因此，该研究中的所有动物(产仔的动物、哺乳期的母亲、幼崽和刚断奶的小动物)被允许自由获取包含提高水平(325ppm)的吡哆醇的改良的实验室啮齿类饮食5001。通过对基因组DNA的PCR进行基因表型，如先前描述的那样(Yadav等,2011)。实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准了所有的动物研究。可溶性嵌合型人碱性磷酸酶(LVL-RecAP)使用在25％的甘油w/v、5mM的Tris/HCl、2mM的MgCl2、50μM的ZnCl2中浓度为10.1mg/ml的LVL-RecAP溶液，pH为8.0。酶具有如由高压液相色谱法确定的>99.99％的纯度。用LVL-RecAP进行剂量应答研究Alpl-/-小鼠被分成5个组：媒介治疗的：仅以媒介治疗的Alpl-/-小鼠(n＝14)；LVL-RecAP1：用LVL-RecAP以1mg/kg/天治疗的Alpl-/-小鼠(n＝14)；LVL-RecAP8：用LVL-RecAP以8mg/kg/天治疗的Alpl-/-小鼠(n＝12)；以及LVL-RecAP16：用LVL-RecAP以16mg/kg/天治疗的Alpl-/-小鼠(n＝10)。Alpl-/-小鼠的野生型同窝出生仔畜用作参照动物并且不接受注射(n＝14)。媒介或LVL-RecAP组每天以SC注射到肩胛骨区。在上午8:00和11:00之间施用注射。施用体积基于注射前测量的体重计算。所有的治疗都在出生后第1天开始，并且每天重复直至第53天或直至尸体剖检时。样品收集在对完成实验流程的那些动物，在最后一次注射LVL-RecAP后24小时，第53天或对表现出末期疾病的那些动物提前进行尸体剖检。在安射死之前腹腔施用三溴乙醇。通过心脏穿刺将血液收集到肝素锂管中。尸体剖检由全套病理学检查和x-射线组成。放射影像和微计算机断层扫描(μCT)用FaxitronMX-20DC4(Chicago,IL,USA)，使用20kV的能量获得骨骼肌的放射图像。以30kV扫描单侧-下颌骨。来自P21小鼠的完整解剖头骨被固定，随后使用eXploreLocusSPμCT成像系统(GEHealthcarePre-ClinicalImaging，(London,ON,Canada))在18μm的各向同性体素分辨率下扫描。使用Parker方法扫描技术以1600ms的曝光时间，在80kV的操作电压和80mA的电流下获取测量值，其使样品旋转180度加20度的扇形角。扫描被校准到羟磷灰石平台，并且以18μm3的有效体素尺寸构建3D图像。使用1400Hounsfield单位的固定阈值来区别矿化组织。患者的感兴趣区域(ROI)和额骨被建立为长度为1mm，宽度为1mm，深度等于骨的厚度，并且位置开始于距矢状面和冠状缝0.75mm的距离处，如先前描述的那样(Liu等,2014)。使用Microview2.2版软件(GEHealthcarePre-ClinicalImaging，London,ON,Canada)测量骨体积、密度和结构的参数，并且建立算法(Meganck等,2009；Umoh等,2009)。进行比较定量结果的学生t检验，以在基因型之间建立统计学上的显著差异。根据Bouxsein等2010年(Bouxsein等,2010)的推荐分析和报告μCT骨数据。对于牙科成像，以10μm的体素尺寸在ScancoMedicalμCT50(ScancoMedicalAG，Brüttisellen,Switzerland)上扫描解剖的单侧-下颌骨。下颌骨z-堆叠被输出为DICOM文件并且使用ImageJ软件(1.48r)重定向，其中为比较挑选切面的可比较的冠状、矢状和横向平面。对于定量分析，以6μm的体素尺寸、55KVp、145mA、0.36度的旋转步长(180度的角度范围)和每幅图400ms的曝光量在ScancoMedicalμCT35上扫描下颌骨。ScancoμCT软件(HP,DECwindowsMotif1.6)被用于3D重建和图像显示。在3D重建之后，使用0.6g/cc的整体阈值对牙冠、牙釉质、齿根和牙槽骨体积进行切片。针对整个牙冠并且单独地针对分叉区的牙釉质、根部牙本质和牙槽骨来测量总体积(TV)、骨(矿化组织)体积(BV)和组织矿物密度(TMD)。还针对牙釉质和齿根测量厚度。组织学分析骨样品被清洁，在4℃下被固定在4％的多聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水中达3天，并且随后被转移到70％的乙醇，用于在4℃下储存。按照先前所描述的制备塑性切片(Yadav等,2012)。按照先前所描述的在塑性切片上进行VonKossa和VanGieson三色染色法(Narisawa等,1997)。由ScanScopeXT系统(Aperio，Vista,CA,USA)扫描VonKossa或VanGieson–染色的切片，并且通过使用BioquantOsteo软件(BioquantOsteoanalysisCo.，Nashville,TN,USA)来分析图像。用于组织学的左侧-下颌骨被固定在Bouin溶液中达24h，并且随后在AFS溶液(醋酸、甲醛、氯化钠)中脱去矿物质，并且被嵌入在石蜡中用于连续切片，如先前所描述的那样(Foster,2012)。对于苦味酸天狼猩红染色，以0.2％的磷钼酸水性溶液、0.4％的直接红80和1.3％的2,4,6-三硝基苯酚(Polysciences,Inc.，Warrington,PA)对石蜡组织切片进行染色，如先前所描述的那样(Foster,2012)。在用于显微摄影的偏振光下观察天狼猩红-染色的切片。生物力学测试在切除肌肉组织后，用卡尺测量股骨、胫骨、肱骨和桡骨的长度。骨被冷冻、包裹在包含盐溶液的纱布中以避免脱水。通过使用如先前所描述的Instron1101通用材料测试机器(Huesa等,2011)，以三点弯曲试验对分离的股骨和胫骨进行评估。在测试前，骨被缓慢解冻并保持在室温下。完整的股骨和胫骨被放置在测试机器中，在两个以15mm的距离分开的支撑部上，并且负载被施加到骨干的中间，由此以2mm·min-1的速度创建3点弯曲试验。PPi试验血浆中的PPi浓度通过来自反应产物6-磷酸[6-3H]葡糖酸盐的UDP-D-[6-3H]葡萄糖(AmershamPharmacia)的活性炭上的差异吸光度来确定，如所描述的那样(Hessle等,2002；Yadav等,2014)。统计考虑到不同浓度的LVL-RecAP导致不同的存活率，以年龄匹配的方式比较三个治疗组是不可能的。因为这个原因，进行未配对的、参数化、双尾学生t检验来比较治疗的Alpl-/-小鼠与WT组。当p<0.05时，差异被认为是显著的。为了比较治疗组之间存活曲线的差异，进行Gehan-Breslow-Wilcoxon检验。结果LVL-RecAP治疗的Alpl-/-小鼠中增加的存活和体重相较于媒介治疗的和1mg/kg/天(LVL-RecAP1)的组，接受8mg/kg/天(LVL-RecAP8)或16mg/kg/天(LVL-RecAP16)的LVL-RecAP的小鼠的存活被显著提高(p＝0.001)(图6A)。当被治疗的组的存活曲线与彼此比较时，差异是统计学上显著的(针对所有比较，p<0.0001)。在LVL-RecAP8、LVL-RecAP1和媒介治疗的组中，生存中值分别为44、22和19天。对于LVL-RecAP16组，不能计算生存中值，因为动物到第53天实验结束时仍然活着。从p7开始，Alpl-/-动物比它们的WT同窝出生仔畜轻。在治疗的第18天，以1mg/kg/天的LVL-RecAP的治疗相较于媒介治疗的小鼠在体重方面产生统计学上显著的增加，而相较于WT同窝出生仔畜没有显著差异(图6B)。接受维生素B6饮食的Alpl-/-小鼠通常死于p18-24，因此，生存更久的LVL-RecAP8和LVL-RecAP16组与媒介治疗的小鼠的比较是不可能的，并且这些相较于WT小鼠是相反的。从p18，LVL-RecAP8组中的动物明显比它们的WT同窝出生仔畜更轻(图6B)，而LVL-RecAP16组中的小鼠在体重方面表现出正常化，并且在p53时与WT小鼠难以区别(图6B)。LVL-RecAP治疗改善Alpl-/-小鼠的骨骼表型未治疗的Alpl-/-小鼠的放射影像(图7A)表现出明显的骨骼异常，包括降低的组织矿化密度和骨折，如先前所描述的那样(Yadav等,2011)。我们发现在接受1mg/kg/天的LVL-RecAP达18天的Alpl-/-的小鼠中，骨骼表型上存在改善(图7A)，并且在LVL-RecAP8和LVL-RecAP16组中益处更明显(图7B)。不管剂量如何，肢体远端都显示出正常的形态学，而对于所有的治疗组，在脊柱、前肢、后肢和胸腔中都观察到部分矫正。LVL-RecAP8和LVL-RecAP16小鼠还在股骨和颈骨中呈现了较少的裂缝和骨折。在p44和p53时，在LVL-RecAP8和LVL-RecAP16中，膝盖和肘中的关节轮廓分别呈现出不规则性(图7)。为了评估软骨病的改善程度，我们对LVL-RecAP-治疗的和WT对照小鼠的塑性嵌入式未脱钙的后肢切片进行了组织形态分析(图8A和9A)。我们测量了骨和类骨质体积(图8B、8C)，并且还分析了血清PPi水平(图9B、9C)。与早先时候的发现(Yadav等,2011)一致，vonKossa染色显示Alpl-/-小鼠表现出严重的矿化缺陷、薄的密质骨、减少的松质骨和受损的骨化中心(图8A)，而LVL-RecAP8和LVL-RecAP16-治疗的动物两者都表现出显著增强的密质骨和改善的次级骨化中心。组织形态学(图8B、8C)显示在LVL-RecAP8和LVL-RecAP16组两者中，BV/TV比率(图8B)都显著低于年龄相当的WT对照(0.0321和0.0302，N＝9)，而相较于WT对照，OV/BV百分数(图8C)显著高于所述两个治疗组(0.0001和0.0175，N＝9)。LVL-RecAP8和LVL-RecAP16治疗组之间的差异不是统计学上显著的。后肢塑性切片的组织学三色染色(图9A)证实这些发现。Alpl-/-小鼠已经严重减少矿化的骨质量(绿色染色区)，其中由类骨质积累(红色染色区)标记密质骨和松质骨中的缺陷。相反，53天大的WT对照具有稳健的密质骨，在次级骨化存在松质骨中并且在骨表面处存在少量类骨质。LVL-RecAP8和LVL-RecAP16组中的Alpl-/-小鼠在密质骨中显示出显著的改善，尤其是在LVL-RecAP16组中，其中没有注意到与WT小鼠相比的主要差异。而在Alpl-/-小鼠中，次级骨化中心中松质骨的形成通过治疗获得改善，LVL-RecAP8和LVL-RecAP16小鼠仍然保持为大于正常的类骨质区(红色)。与骨骼发现一致，我们在所有治疗组中都发现了血清PPi浓度的矫正。当与媒介治疗的对照动物相比较时，LVL-RecAP1动物(图9B)具有显著降低的PPi水平。LVL-RecAP16治疗的动物具有与WT同窝出生仔畜的PPi水平在统计学上难以区分的PPi水平。在LVL-RecAP治疗的Alpl-/-小鼠中不存在颅面异常Alpl-/-小鼠以颅面形状异常和冠状缝融合为特征(Liu等,2014)。为了确定颅面骨骼在Alpl-/-小鼠中受治疗影响的程度，我们对额叶和顶叶颅骨进行了基于μCT的分析。在p21时的结果表明当与WT或治疗的Alpl-/-小鼠相比较时，溶剂治疗的Alpl-/-小鼠的额骨和顶骨在骨体积分数、骨矿物含量、骨矿物密度、组织矿物含量和组织矿物密度方面显著减少(表15)。相反，治疗的Alpl-/-小鼠的额骨和顶骨两者与野生型小鼠的额骨和顶骨均没有明显不同。LVL-RecAP16治疗的Alpl-/-小鼠的成年头骨在尺寸和形状方面没有与WT表现出不同(图10)。表15.颅骨的μCT分析。在p21时分析WT、未治疗的Alpl-/-(媒介)以及RecAP16-治疗的Alpl-/-小鼠的额骨和顶骨。数值报告为平均值±SD。*表示表型之间以及治疗组之间的统计学显著性。LVL-RecAP治疗部分补救Alpl-/-牙槽缺陷Alpl在小鼠中的消融导致在牙基质、牙质、齿槽骨和牙釉质中的发育型矿化缺陷(Foster等,2014a；Foster等,2014b；McKee等2011；Yadav等,2012)，与患有HPP的人受试者的病例报告一致。无细胞牙基质的缺乏导致缺失牙周附着到齿根表面和过早牙脱落，即HPP的标志。当臼齿形成接近完成时，即在p25-26时，LVL-RecAP8-治疗的和媒介治疗的Alpl-/-小鼠与WT比较。放射影像和μCT成像显示，与对照相比(图11A、D)，未治疗的Alpl-/-小鼠下颌骨以极其低矿化的骨、牙质内的短臼齿和宽髓室，以及严重缺乏的门齿为特征(图11B、F)。通过组织学，Alpl-/-小鼠牙齿以没有无细胞牙基质以及牙槽骨类骨质侵入牙周韧带(PDL)空间为特征，导致关节僵硬和功能性牙周组织缺失(图11G与11E)。8mg/kg/天的LVL-RecAP的施用在p26时改善臼齿高度、牙质厚度和骨矿化的放射影像外观，尽管门齿仍有缺陷(图11C、H)。在组织结构上，尽管该剂量的LVL-RecAP没有将无细胞牙基质到修复到齿根曲面，臼齿相关的PDL空间和牙槽骨边界被更好地维持(图11I)。在p50-53时，将LVL-RecAP16组与WT比较，以确定对于成熟的牙齿结构和功能的影响。放射影像和μCT成像表示与对照相比，在Alpl-/-小鼠下颌骨中，在臼齿周围齿槽骨和邻间骨矿化减少(图11J-M)。在LVL-RecAP16小鼠中，臼齿形态和牙质表现出很大程度地正常化，并且这一点被第一臼齿的μCT分析证实(表16)。LVL-RecAP16组中的牙釉质在BV/TV或TMD方面与WT不同。与WT相比，臼齿齿冠和齿根在BV/TV和TMD中表现为轻微的但是显著的4-10％的减少，表明牙质矿化没有被完全救治，并且齿根厚度被减少15％。与WT相比，牙槽骨矿化在LVL-RecAP16组中仍然有更严重地缺陷，其中BV/TV减少27％，而TMD减少13％。在治疗的Alpl-/-小鼠中，门齿同样仍然是严重受影响的(图11K、M)。通过组织学，LVL-RecAP16小鼠以矿化的牙槽骨和类骨质，以及减少但是保留的PDL空间为特征(图11N,P)。到p53时，在LVL-RecAP16组中没有牙齿缺失被注意到，尽管牙周附着仍然是有缺陷的，如由牙基质缺失，PDL组织破坏和从齿根曲面的分离，以及结合上皮的向下生长证明的。然而，PDL附着到牙齿的小区被注意到是与有序的PDL纤维相关联的(图11O、Q)，表明存在一些受损的附着，可以用于保持臼齿。表16.牙槽组织的μCT分析。比较p50-53时在WT(n＝5)和以RecAP16(n＝4)治疗的Alpl-/-小鼠中的第一下颌臼齿和相关联的齿槽骨。值被报告为平均值±SD。*通过独立样品t检验，p<0.05ND＝未确定实施例8的参考文献AndersonH.C.,SipeJ.B.,HessleL.,DhanyamrajuR.,AttiE.,CamachoN.P.,MillánJ.L.Impairedcalcificationaroundmatrixvesiclesofgrowthplateandboneinalkalinephosphatase-deficientmice.Am.J.Pathol.2004；164(3):841-847.BouxseinML,BoydSK,ChristiansenBA,GuldbergRE,JepsenKJandMüllerR.Guidelinesforassessmentofbonemicrostructureinrodentsusingmicro-computedtomography.JBoneMinerRes2010；25(7):1468-86.FeddeKN,BlairL,Silverstein,J,CoburnSP,RyanLM,WeinsteinRS,WaymireK,NarisawaS,Millán,JL,MacGregorGR,WhyteMP,Alkalinephosphataseknockoutmicerecapitulatethemetabolicandskeletaldefectsofinfantilehypophosphatasia.JBoneMinerRes1999；14:2015-2026.FosterBL,NagatomoKJ,NocitiFH,FongH,DunnD,TranAB,WangW,NarisawaS,MillánJL,SomermanMJ2012Centralroleofpyrophosphateinacellularcementumformation.PLoSOne7(6):e38393.FosterB.L.,NagatomoK.J.,TsoH.W.,TranA.B.,NocitiF.H.,Jr.,NarisawaS.,YadavM.C.,McKeeM.D.,MillanJ.I.,SomermanM.J.Toothrootdentinmineralizationdefectsinamousemodelofhypophosphatasia.JBoneMinerRes.2013；28(2):271-82.FosterBL,NocitiFH,Jr.,SomermanMJ(2014a).Therachitictooth.EndocrRev35(1):1-34.FosterBL,RamnitzMS,GafniRI,BurkeAB,BoyceAM,LeeJSetal.(2014b).RareBoneDiseasesandTheirDental,Oral,andCraniofacialManifestations.JDentRes93(7suppl):7S-19S.HessleL.,JohnsonK.A.,AndersonH.C.,NarisawaS.,SaliA.,GodingJ.W.,TerkeltaubR.,MillánJ.L.Tissue-nonspecificalkalinephosphataseandplasmacellmembraneglycoprotein-1arecentralantagonisticregulatorsofbonemineralization.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002；99(14):9445-9449.HuesaC.,YadavM.C.,M.A.,GoodyearS.R.,RobinsS.P.,TannerK.E.,AspdenR.M.,MillánJ.L.,FarquharsonC.PHOSPHO1isessentialformechanicallycompetentmineralizationandtheavoidanceofspontaneousfractures.Bone.2011；48(5):1066-1074.LiuJ,NamHK,CampbellC,GasqueKC,MillánJL,HatchNE.Tissue-nonspecificalkalinephosphatasedeficiencycausesabnormalcraniofacialbonedevelopmentintheAlpl(-/-)mousemodelofinfantilehypophosphatasia.Bone2014；67:81-94.McKeeM.D.,NakanoY.,MasicaD.L.,GrayJ.J.,LemireI.,HeftR.,WhyteM.P.,CrineP.,MillánJ.L.Enzymereplacementtherapypreventsdentaldefectsinamodelofhypophosphatasia.J.Dent.Res.2011；90(4):470-476.MeganckJA,KozloffKM,ThorntonMM,BroskiSMandGoldsteinSA.Beamhardeningartifactsinmicro-computedtomographyscanningcanbereducedbyX-raybeamfiltrationandtheresultingimagescanbeusedtoaccuratelymeasureBMD.Bone2009；45(6):1104-1116.MillánJL,NarisawaS,LemireI,LoiselTP,BoileauG,LeonardP,GramatikovaS,TerkeltaubR,PleshkoCamachoN,McKeeMD,CrinePandWhyteMP,Enzymereplacementtherapyformurinehypophosphatasia.JBoneMinerRes2008；23:777-787.NarisawaS,WennbergC.MillánJL,AbnormalvitaminB6metabolisminalkalinephosphataseknock-outmicecausesmultipleabnormalities,butnott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4.5；Sigma-Aldrich)混合，接着衍生化(60min，70℃，500rpm)和离心(3min，RT，13400rpm)，其后上清液被转移到HPLC小瓶中并注射。通过使用PolarisC18-A柱(150x4.6mm)，使用洗脱液A(0.1M的K2HPO4、10mM的TBAHS(pH6.5)和2％的MeOH)和洗脱液B(H2O:ACN:THF；50:49:1)以梯度洗脱，嘌呤被HPLC系统(ThermoScientific)分离。保留时间为7.1(腺苷)、8.4(AMP)、12.5(ADP)、16.2(ATP)和14.8min(cAMP)。基于以荧光(激发：280nm；发射：420nm)测定的样品和参考标准的峰面积进行定量。统计学分析数据表示为平均值±SEM或中值[第25％，第75％]。通过柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验估算数据的正态性。使用方差分析与Bonferroni多重比较检验，或克鲁斯卡尔-沃斯利检验与Dunns事后检验估算组之间的统计学差异。双侧p值都小于0.05被认为是统计学上显著的。用Windows的GraphpadPrism5.00(GraphpadSoftwareInc.，SanDiego,CA,USA)进行所有的检验。体内LVL-RecAP减弱和LPS-诱导的炎性应答用LVL-RecAP预处理人ciPTEC(Wilmer,2010)剂量依赖地减弱LPS-诱导细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8在基因和蛋白水平上的生成(图12A-B)。脱毒LPS(dLPS)被用作阴性对照并且没有效果。当与LPS同时或在LPS暴露之后2hr施用LLVL-RecAP时，获得了在蛋白水平上类似的保护性结果(图12C)。进行对照实验以验证LVL-RecAP是否使培养基中分泌的细胞因子脱磷酸，而情况并非如此(图17)。为了证实LVL-RecAP-诱导细胞因子生成减少是由于酶的脱磷酸性质，研究缺乏水解性能的失活的LVL-RecAP的效果。失活的LVL-RecAP没有减弱ciPTEC中LPS-诱导的炎性应答(图12D)。LVL-RecAP的体外效果是肾特异性的并且不被限于LPS-诱导的炎症为了进一步研究LVL-RecAP的肾保护机制，ciPTEC与被小牛IAP脱磷酸的前炎性细胞因子TNF-α一起孵育(Chen,2010)。TNF-α诱导细胞因子IL-6和IL-8的生成也被LVL-RecAP预处理减弱，而失活的LVL-RecAP没有效果(图13A)。在败血症相关AKI的发病机理中，LPS通过结合到表达在PTEC(ciPTECCt:30.5±3.9；n＝5)上的TLR4诱导局部炎性应答。疾病的另一个标志是全身性炎性应答，这影响肾上皮和内皮细胞两者，造成AKI的发展(Peters,2014)。为了模拟该内毒素诱导的肾炎，ciPTEC与LPS-刺激的外周血单核细胞的上清液(PBMCs,1ng/mlLPS)一起孵育。这诱导IL-6和IL-8的生成，当用LVL-RecAP预处理ciPTEC时，所述诱导会被减少(图13B,TNF-α是不可检测的)。与由TNF-α介导的炎性应答被LVL-RecAP预处理减弱这一发现一起，这表明存在由LVL-RecAP靶向的另一个介导物。相反，用LVL-RecAP预处理PBMCs不影响这些细胞中LPS-诱导的炎性应答(图13C)，表明LVL-RecAP的效果是肾特异性的。LVL-RecAP可以通过ATP/腺苷通路在体外产生肾保护效果LVL-RecAP的第二潜在靶点是ATP，所述ATP在由例如炎症和低氧造成的细胞应激期间释放(Eltzschig,2012)。细胞外的ATP具有有害作用，但是可以被外核苷酸酶(例如AP)转变为ADP、AMP并且最终转变为腺苷，通过结合到腺苷受体A1、A2A、A2B和A3中的一个而产生抗炎和组织保护效果(Bauerle,2011,DiSole,2008)。有趣地是，尽管腺苷受体A1、A2B和A3在ciPTEC中的表达不受LPS孵育的影响(数据未示出)，但是A2A的表达基于LPS刺激被上调(增加倍数：4.1±0.4；相较于安慰剂，p<0.001)。该效果被LVL-RecAP共同治疗减弱(增加倍数：2.9±0.2；相较于安慰剂，p<0.001；相较于LPS，p<0.05)，表明腺苷通路在LVL-RecAP的保护效果中的作用。此外，我们观察到在LPS孵育之后细胞外的ATP浓度增加，在更高的LPS浓度的情况下，这是更明显的，但是会被LVL-RecAP预孵育逆转(图14)。LPS在直至24hr时不影响细胞活力(数据未示出)。这支持LVL-RecAP可以通过ATP/腺苷通路产生它的肾保护效果的假设。LVL-RecAP治疗在大鼠中LPS-诱导AKI期间减弱受损的肾功能为了证实LVL-RecAP在体内的有益效果，AKI在大鼠中被LPS(0.3mg/kgBW)诱导，并且通过对异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的海葱糖动力学进行的经皮测定来评估肾功能，如先前报道过的那样(Schock-Kusch,2011)。FITC-海葱糖通过过滤单独地被肾清除，并且它从血浆室中的消失可以经皮实时测定(Schock-Kusch,2011,Schock-Kusch,2009)。相较于通常使用的肌酐清除，这允许以更精确的方式研究AKI的进展。前述的LPS注射，绘出基线血液样品以确定临床参数和血浆细胞因子，并且从所测定的动力学来确定基线FITC-海葱糖半衰期(t1/2)，以查明组之间的同质性(数据未示出)。在1.5hr后，LPS治疗导致增加的血浆细胞因子水平、若干个血浆参数异常(表18)、立毛、腹泻和减少的自发活动，证实存在全身性炎症。在LPS施用后2hr，用LVL-RecAP(1000U/kgBW)或安慰剂(生理盐水)治疗大鼠，紧接着是经皮肾功能测定。LPS显著地延长FITC-海葱糖的t1/2，表明肾功能的显著降低。该倾向被LVL-RecAP治疗减弱(图15A)。在所有组中，肾功能都在24hrs内完全恢复(图15B)。仍然，相较于接受LPS而非LVL-RecAP的动物，LVL-RecAP治疗的动物中的血浆尿素水平明显更低(表19)。同样，LVL-RecAP治疗阻止LPS-诱导部分尿素分泌的增加(图15C)以及LPS-诱导内源性肌酐清除的减少(图15D)。LVL-RecAP在血浆中的生物活性被证实，并且在注射(安慰剂：293±12U/ml；LPS：260±13U/ml；LPS+AP：2150±60U/ml；p<0.0001)后22hrs表现出八倍增加。LVL-RecAP在体内LPS-诱导AKI期间防止肾损伤LVL-RecAP对LPS-诱导的AKI的肾保护效果进一步通过肾组织学和特定肾小管损伤标记来研究。没有在治疗组之间发现组织学方面的差异，其中变化的范围从没有损坏(0)直至最小退行性改变(如泡沫外观)和邻近肾小管细胞的最小肿胀(1)，以及泡沫外观和中等肿胀以及一些细胞凋亡病例(2)(安慰剂：1[0.75-2]；LPS：1.5[0-2]；LPS+LVL-RecAP：1[0-1.0])。LPS治疗导致肾IL-6表达水平的显著增加，而其他细胞因子和损伤标记(MPO：髓过氧物酶；BAX：Bcl2-相关X蛋白；iNOS：诱导型一氧化氮合成酶)不受影响(表20)。LVL-RecAP不能减少肾IL-6的表达水平，但是能增强抗炎性细胞因子IL-10的肾表达(表20)。此外，LPS施用导致肾损伤分子(KIM)-1和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)在尿分泌中的显著增加，伴有增加的肾基因表达水平。该效果由LVL-RecAP共同施用阻止(图16A-B，表20)。针对血浆NGAL水平(图16C)和针对肾KIM-1蛋白水平(图16D)观察到LVL-RecAP的类似效果，这主要位于近肾小管上皮细胞的顶面(图16E)。在体内LPS-诱导AKI期间减少的尿腺苷分泌为了进一步阐明LVL-RecAP的肾保护机制，我们研究了ATP-腺苷通路的作用。LPS治疗倾向于为减少肾中针对所有四种腺苷受体的基因表达水平，其中只有腺苷受体A3达到统计学上的显著性(表20)。有趣地是，LPS治疗显著地降低腺苷的尿分泌(安慰剂：68.0±7.8pg腺苷/10μg肌酐；LPS：19.4±6.3pg腺苷/10μg肌酐；p<0.001)，而不改变cAMP、ATP、ADP和AMP的分泌(数据未示出)。这可以表明肾在LPS-诱导AKI期间利用腺苷。相较于LPS自己，LVL-RecAP治疗对于腺苷受体基因表达(表20)或尿腺苷分泌(LPS+LVL-RecAP：16.7±6.8pg腺苷/10μg肌酐：相较于安慰剂，p<0.001)没有效果。表表17.引物/探针说明表18.血浆细胞因子和实验参数LPS施用后1.5hr确定血浆参数。取决于每个参数的分布，数据表示为平均值±SEM，以及中值[第25％，第75％]。相较于t＝24，血浆参数的分布差异有可能与样品大小相关。使用单向方差分析(one-wayANOVA)与Bonferroni事后检验，或克鲁斯卡尔-沃斯利检验与Dunns事后检验估算显著差异。安慰剂，LPSn＝6；LPS+recAPn＝5。#相较于安慰剂，p<0.05。*相较于LPS，p<0.05。LPS为脂多糖；recAP为重组碱性磷酸酶；ND：未检测到。表19.血浆和尿参数LPS施用后1.5hr确定血浆参数。在LPS施用后5和21hr之间确定尿参数。取决于每个参数的分布，数据表示为平均值±SEM，以及中值[第25％，第75％]。使用克鲁斯卡尔-沃斯利检验与Dunns事后检验，或单向方差分析(one-wayANOVA)与Bonferroni事后检验估算显著差异。安慰剂，LPSn＝6；LPS+recAPn＝5；尿参数：安慰剂n＝5。#相较于安慰剂，p<0.05。*相较于LPS，p<0.05。LPS，脂多糖；recAP，重组碱性磷酸酶。表20.肾基因表达水平取决于每个参数的分布，数据表示为平均值±SEM，以及中值[第25％，第75％]。使用单向方差分析(one-wayANOVA)与Bonferroni事后检验，或克鲁斯卡尔-沃斯利检验与Dunns事后检验估算增加倍数的显著差异。安慰剂，LPSn＝6；LPS+recAPn＝5。#相较于安慰剂，p<0.05。*相较于LPS，p<0.05。LPS，脂多糖；recAP，重组碱性磷酸酶；MPO，髓过氧物酶；BAX，Bcl2-相关X蛋白；iNOS，诱导型一氧化氮合成酶。实施例9的参考文献Bauerle,J.D.,Grenz,A.,Kim,J.H.,Lee,H.T.,andEltzschig,H.K.2011.AdenosineAgenerationandsignalingduringacutekidneyinjury.JAmSocNephrol22:14-20.Chen,K.T.,Malo,M.S.,Moss,A.K.,Zeller,S.,Johnson,P.,Ebrahimi,F.,Mostafa,G.,Alam,S.N.,Ramasamy,S.,Warren,H.S.,etal.2010.Identificationofspecifictargetsforthegutmucosaldefensefactorintestinalalkalinephosphatase.AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol299:G467-475.DiSole,F.2008.Adenosineandrenaltubularfunction.CurrOpinNephrolHypertens17:399-407.Eltzschig,H.K.,Sitkovsky,M.V.,andRobson,S.C.2012.Purinergicsignalingduringinflammation.NEnglJMed367:2322-2333.Kiffer-Moreira,T.,Sheen,C.R.,Gasque,K.C.,Bolean,M.,Ciancaglini,P.,vanElsas,A.,Hoylaerts,M.F.,andMillan,J.L.2014.Catalyticsignatureofaheat-stable,chimerichumanalkalinephosphatasewiththerapeuticpotential.PLoSOne9:e89374.Peters,E.,Heemskerk,S.,Masereeuw,R.,andPickkers,P.2014.AlkalinePhosphatase:APossibleTreatmentforSepsis-AssociatedAcuteKidneyInjuryinCriticallyIllPatients.AmJKidneyDis.63:1038-48Schock-Kusch,D.,Sadick,M.,Henninger,N.,Kraenzlin,B.,Claus,G.,Kloetzer,H.M.,Weiss,C.,Pill,J.,andGretz,N.2009.TranscutaneousmeasurementofglomerularfiltrationrateusingFITC-sinistrininrats.NephrolDialTransplant24:2997-3001.Schock-Kusch,D.,Xie,Q.,Shulhevich,Y.,Hesser,J.,Stsepankou,D.,Sadick,M.,Koenig,S.,Hoecklin,F.,Pill,J.,andGretz,N.2011.TranscutaneousassessmentofrenalfunctioninconsciousratswithadeviceformeasuringFITC-sinistrindisappearancecurves.KidneyInt79:1254-1258.Wilmer,M.J.,Saleem,M.A.,Masereeuw,R.,Ni,L.,vanderVelden,T.J.,Russel,F.G.,Mathieson,P.W.,Monnens,L.A.,vandenHeuvel,L.P.,andLevtchenko,E.N.2010.Novelconditionallyimmortalizedhumanproximaltubulecelllineexpressingfunctionalinfluxandeffluxtransporters.CellTissueRes339:449-457.实施例10LVL-RecAP与RecAP在不同温度条件下的比较10.6.材料10.6.1参考标准LVL-RecAP批号：NB1963p1PRAID：14-049蛋白含量：9.9mg/mL(OD280)活性：6537U/mL(660U/mg)储存条件：标称-70℃有效期限：2015年1月8日RecAP批号：2013-052,lot62PRAID：14-311蛋白含量：13.3mg/mL(OD280)活性：9871U/mL(742U/mg)储存条件：2-8℃有效期限：2016年6月6日10.6.2空白基质以下生物基质被用于样品溶液的制备。基质：血清种类：人供应商：SeraLaboratoriesInternational,HaywardsHeath,UK储存条件：标称储存温度-20℃PRAID：14-0624、14-0647和14-0652有效期限：2016年5月2日(14-0624)、2016年5月6日(14-0647和14-0652)10.7.方法10.7.1溶液制备10.7.1.12M的氢氧化钠通过将8g的氢氧化钠溶解在大约90mL的Milli-Q水中并且在冷却到室温后将体积调整到100mL来制备2摩尔的氢氧化钠溶液。室温储存所述溶液，最长储存时间为一个月。10.7.1.21M的氯化镁通过将4.06g的六水合氯化镁溶解在大约16mL的Milli-Q水中来制备1摩尔的氯化镁溶液。在标称+4℃下储存所述溶液，最长储存时间为一个月。10.7.1.30.1M的氯化锌通过将272.5mg的氯化锌溶解在大约16mL的Milli-Q水中来制备0.1摩尔的氯化锌溶液。溶解以后，将体积调整到20mL。在标称+4℃下储存所述溶液，最长储存时间为一个月。10.7.1.425℃，pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液的方法通过将3.76g的甘氨酸溶解在大约1800mL的Milli-Q水中来制备pH为9.6的0.025摩尔的甘氨酸溶液。将溶液加温到25℃，并且用2M的氢氧化钠(参见10.7.1.1节)调节到pH9.6。将体积补足至2000mL并复校pH。pH应该是在25℃下为pH9.6。在标称+4℃下储存所述溶液，最长储存时间为一周。10.7.1.525℃，酶稀释缓冲液的方法通过将0.5mL的1M的氯化镁(参见10.7.1.2节)与0.5mL的0.1M的氯化锌(参见10.7.1.3节)和500mL的pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液(参见10.7.1.4节)混合来制备酶稀释缓冲液。向该溶液中加入5.00g的甘露糖醇和0.25g的牛血清白蛋白并搅拌溶解。检查pH并且如果认为有需要则用2M的氢氧化钠调节到在25℃下为pH9.6。每天新鲜制备酶稀释缓冲液。10.7.1.625℃，pH为9.6的0.0103M的磷酸对硝基苯酯的方法通过将1528mg的磷酸对硝基苯酯溶解在大约360mL的pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液(参见10.7.1.4节)中来制备pH为9.6的0.0103M的磷酸对硝基苯酯。检查pH并且如果认为有需要则用2M的氢氧化钠(参见10.7.1.1节)调节到在25℃下为pH9.6。检查pH后，用pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液将体积调节到400mL。在标称+4℃下储存所述溶液，最长储存时间为5天。10.7.1.725℃，工作底物的方法通过将120mL的pH为9.6的0.0103M的磷酸对硝基苯酯溶液(参见10.7.1.6节)与1.25mL的1M的氯化镁溶液(参见10.7.1.2节)混合来制备工作底物。向该溶液中加入大约15mL的pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液(参见10.7.1.4节)，并且检查pH并且如果认为有需要则用2M的氢氧化钠(参见10.7.1.1节)调节到在25℃下为pH9.6。用pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液将体积调节到145mL。每天新鲜制备工作底物。10.7.1.837℃，pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液的方法通过将3.76g的甘氨酸溶解在大约1800mL的Milli-Q水中来制备pH为9.6的0.025摩尔的甘氨酸溶液。将溶液加温到25℃，并且用2M的氢氧化钠(参见10.7.1.1节)调节到pH9.6。将体积补足至2000mL并复校pH。pH应该是在37℃下为pH9.6。标称+4℃储存所述溶液，最长储存时间为一周。10.7.1.937℃，酶稀释缓冲液的方法通过将0.5mL的1M的氯化镁(参见10.7.1.2节)与0.5mL的0.1M的氯化锌(参见10.7.1.3节)和500mL的pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液(参见10.7.1.8节)混合来制备酶稀释缓冲液。向该溶液中加入5.00g的甘露糖醇和0.25g的牛血清白蛋白并搅拌溶解。检查pH并且如果认为有需要则用2M的氢氧化钠调节到在37℃下为pH9.6。每天新鲜制备酶稀释缓冲液。10.7.1.1037℃，pH为9.6的0.0103M的磷酸对硝基苯酯的方法通过将1528mg的磷酸对硝基苯酯溶解在大约360mL的pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液(参见10.7.1.8节)中来制备pH为9.6的0.0103M的磷酸对硝基苯酯。检查pH并且如果认为有需要则用2M的氢氧化钠(参见10.7.1.1节)调节到在37℃下为pH9.6。检查pH后，用pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液将体积调节到400mL。在标称+4℃下储存所述溶液，最长储存时间为5天。10.7.1.1137℃，工作底物的方法通过将120mL的pH为9.6的0.0103M的磷酸对硝基苯酯溶液(参见10.7.1.10节)与1.25mL的1M的氯化镁溶液(参见10.7.1.2节)混合来制备工作底物。向该溶液中加入大约15mL的pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液(参见10.7.1.4节)，并且检查pH并且如果认为有需要用2M的氢氧化钠(参见10.7.1.1节)调节到在37℃下为pH9.6。用pH为9.6的0.025M的甘氨酸溶液将体积调节到145mL。每天新鲜制备工作底物。10.7.2LVL-RecAP放射性示踪溶液(500μg/mL)通过用酶稀释缓冲液(参见10.7.1.5节)将252.5μL的LVL-RecAP(参见10.6.1节)稀释到5.00mL来制备LVL-RecAP放射性示踪溶液。所述放射性示踪溶液的最终浓度为500μg/mL，该溶液被使用于RecAP放射性示踪的人血清样品的制备(参见10.7.4节)。10.7.3RecAP放射性示踪溶液(500μg/mL)通过用酶稀释缓冲液(参见10.7.1.5节)将188.0μL的RecAP(参见10.6.1节)稀释到5.00mL来制备RecAP放射性示踪溶液。所述放射性示踪溶液的最终浓度为500μg/mL，该溶液被使用于RecAP放射性示踪的人血清样品的制备(参见10.7.5节)。10.7.4LVL-recAP放射性示踪的人血清样品的制备通过使用以下浓度对LVL-RecAP进行放射性示踪到三组单独的空白血清批次来制备血清样品：在分析之前，血清样品在标称-70℃下储存。10.7.5RecAP放射性示踪的人血清样品的制备通过使用以下浓度对RecAP进行放射性示踪到三组单独的空白血清批次来制备血清样品：在分析之前，血清样品在标称-70℃下储存。10.7.6用于LVL-RecAP和RecAP的酶活性的样品溶液的制备通过使用酶稀释缓冲液(参见10.7.1.5节的25℃的方法，或10.7.1.9节的37℃的方法)对LVL-RecAP产品样品或RecAP产品样品进行稀释来制备用于LVL-RecAP和RecAP的酶活性的样品溶液。通过取125μL的LVL-RecAP和/或RecAP血清样品稀释来自LVL-RecAP和/或RecAP样品的样品1，并且用酶稀释缓冲液稀释到2.50mL来制备用于LVL-RecAP或RecAP的酶活性的最终样品溶液。通过取125μL的LVL-RecAP和/或RecAP血清样品稀释来自LVL-RecAP和/或RecAP样品的样品2，并且用酶稀释缓冲液稀释到2.00mL来制备用于LVL-RecAP或RecAP的酶活性的最终样品溶液。通过取167μL的LVL-RecAP和/或RecAP血清样品稀释来自LVL-RecAP和/或RecAP样品的样品3，并且用酶稀释缓冲液稀释到2.00mL来制备用于LVL-RecAP或RecAP的酶活性的最终样品溶液。通过取250μL的LVL-RecAP和/或RecAP血清样品稀释来自LVL-RecAP和/或RecAP样品的样品4，并且用酶稀释缓冲液稀释到2.00mL来制备用于LVL-RecAP或RecAP的酶活性的最终样品溶液。通过取500μL的LVL-RecAP和/或RecAP血清样品稀释来自LVL-RecAP和/或RecAP样品的样品5，并且用酶稀释缓冲液稀释到2.00mL来制备用于LVL-RecAP和/或RecAP的酶活性的最终样品溶液。通过取1000μL的LVL-RecAP和/或RecAP血清样品稀释来自LVL-RecAP和/或RecAP样品的样品6，并且用酶稀释缓冲液稀释到2.00mL来制备用于LVL-RecAP和/或RecAP的酶活性的最终样品溶液。通过取1000μL的LVL-RecAP和/或RecAP血清样品稀释来自LVL-RecAP和/或RecAP样品的内源性(样品7)，并且用酶稀释缓冲液稀释到2.00mL来制备用于LVL-RecAP和/或RecAP的酶活性的最终样品溶液。10.8.实施、结果和讨论10.8.1设备和设置使用以下方法和设置：分光光度计：具有磁搅拌器的、具有25℃(AN-18-3)或37℃(AN-18-4)的单细胞珀尔帖制热器组的ThermoFisherEvolution300UV/VIS波长：405nm测定：每15秒一次测定3分钟。第一分钟不被考虑在计算中。液槽(cuvette)类型：玻璃以下溶液被移液到玻璃液槽中。溶液的温度，对于AN-18-3，25℃±0.5℃；或对于AN-18-4，37℃±0.5℃。在加入样品之前，首先混合工作底物和酶稀释液。混合溶液并将液槽立即放置在分光光度计中，并且以15秒间隔逐步测量从1至3分钟的吸光度增加，以获得至少9个数据点。在3分钟(最后一次)的数据点处，光密度≤1.5。此外，线性是可接受的；每组平行试验的相关系数(r)应该≥0.990。为评估考虑其中相关系数(r)≥0.990的所有样品结果，报告其中相关系数(r)<0.990的样品结果仅供参考。以两组平行试验方式进行酶活性，每个稀释液测试一次。10.8.2LVL-RecAP和RecAP的酶活性尽管在研究计划中描述了两种单独的结果(酶活性)的差异应该≤5.0％以接受这两个单独的稀释结果，但是具有针对每个测量值≥0.990的相关系数(r)的所有结果都可以用于评估。这是因为酶活性方法是针对LVL-RecAP药品样品在25℃±0.5℃下验证的，而不是针对其他碱性磷酸酶来源和/或其他条件。图19示出人血清中的RecAP在25℃和在37℃的酶活性之间的相关性。图20示出人血清中的LVL-RecAP在25℃和在37℃的酶活性之间的相关性。图20示出RecAP和LVL-RecAP在25℃和在37℃的活性/μg蛋白。值表示对于给定蛋白浓度在25℃和37℃之间的平均Δ活性。当前第1页1 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