变异型血凝素复合体蛋白、以及使用其的具有多能性的干细胞的培养方法与流程
本发明涉及一种源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白、具有多能性的干细胞的培养方法、除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可能产生的脱离了未分化状态的细胞的方法、维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法、iPS细胞的培养方法、iPS细胞的细胞团块的分割方法、以及这些方法中使用的试剂盒。
背景技术：
在将人iPS细胞等多能性干细胞进行大量培养时，通过一系列的扩增培养(传代培养)的重复而制备许多未分化的细胞。已知的是，在该一系列的培养中，有从未分化状态逸脱的细胞即“未分化逸脱细胞”偶然地产生。
已知有该未分化逸脱细胞具有与未分化细胞大致同等的分裂能力，且诱发从未分化细胞向未分化逸脱细胞的转换。即，未分化逸脱细胞产生时，其增殖速度超过未分化细胞的增殖速度，抑制未分化细胞的增殖。
未分化逸脱细胞的产生在不熟练的培养操作者的培养中较多地观察到。另外，已知集落尺寸过大、集落彼此的合并为产生的一个原因。因此，通过在低汇合下传代、维持播种时的均匀性，可以某种程度上降低未分化逸脱细胞的产生频率。另外，通过近年来所开发的培养基，也某种程度上抑制未分化逸脱细胞的产生频率。但是，尽管如此，未分化逸脱细胞仍偶然地产生，在产生的情况下，除去含有未分化逸脱细胞的集落还是必须的。
含有未分化逸脱细胞的集落维持未分化状态，因此，在传代时通过显微镜下的移液操作而仔细地被除去。模仿这种集落除去手法的装置、例如组合有观察装置和机器人操作的移液的装置也已经被开发出来。
另外，专利文献1中公开有：为了一边维持iPS细胞等多能性干细胞的未分化一边使其增殖，在活化素存在下将多能性干细胞进行培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2012-143229号公报
技术实现要素：
发明所要解决的课题
如上所述，在人iPS细胞等多能性干细胞的传代培养中，容易引起脱离未分化的现象，难以维持未分化，在数次传代后，引起许多iPS细胞集落脱离未分化的现象，可能形成含有脱离了未分化状态的细胞的集落。因此，仔细的培养、及仔细的集落选择这样的繁琐的操作变得不可缺少。从促进干细胞产业方面考虑，也期望繁琐的操作少、即使不是熟练者也可以的、多能性干细胞的未分化维持方法。
另外，从再生医疗或对创新药物开发研究的实用化方面考虑，期待稳定地大量供给人iPS细胞等多能性干细胞的高品质细胞。因此，近年来，尝试通过悬浮培养进行的培养，但在细胞块分割时对细胞造成损伤等成为问题。因此，期望可以简便且有效地大量培养人iPS细胞等多能性干细胞的方法。
源自肉毒杆菌的血凝素(HA)为肉毒神经毒素复合体的成分。近年来发现：该HA具有与作为细胞粘附分子的E-钙粘着蛋白特异性地结合、由此破坏肠管上皮细胞的细胞间屏障的分子机制。本发明人等尝试了使用该HA所具有的分子机制来除去具有多能性(“pluripotency”，以下同样)的干细胞的培养中的集落中产生的“脱离了未分化状态的细胞”。
本发明在一方式中，提供能够除去具有多能性的干细胞的培养中的集落中产生的“脱离了未分化状态的细胞”的新的血凝素。
本发明在一方式中，提供使用血凝素的、具有多能性的干细胞的新的培养方法。
用于解决课题的技术方案
本发明在一方式中涉及一种变异型血凝素复合体蛋白，其为源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白，其中，所述复合体蛋白至少含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分(subcomponent)HA2及HA3，构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异。
本发明在一方式中涉及一种变异型血凝素复合体蛋白，其为源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白，其中，所述复合体蛋白由亚成分HA1、HA2及HA3形成，相当于所述亚成分HA1的野生型的氨基酸序列的第264位的天冬酰胺的氨基酸、相当于所述亚成分HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相当于所述亚成分HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸中的一个氨基酸或两个氨基酸产生变异。
本发明在一方式中涉及一种具有多能性的干细胞的培养方法，其中，包含在本发明的变异型血凝素复合体蛋白的存在下进行细胞培养。
本发明在一方式中涉及一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可能产生的脱离了未分化状态的细胞的方法，其中，包含在本发明的变异型血凝素复合体蛋白的存在下进行细胞培养。
本发明在一方式中涉及一种源自人的iPS细胞的培养方法，其中，包含在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将所述iPS细胞进行悬浮培养。
本发明在一方式中涉及一种源自人的iPS细胞的细胞团块的分割方法，其中，包含在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将所述iPS细胞进行悬浮培养。
发明效果
根据本发明，在一方式中，可以发挥能够除去在具有多能性的干细胞的培养中的集落中产生的“脱离了未分化状态的细胞”的效果。
根据本发明，在一方式中，可以发挥能够简便且有效地大量培养具有多能性的干细胞的效果。
附图说明
图1是在第三天添加B型野生型HA复合体时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例2)。
图2是在第三天添加B型变异型HA复合体1(HA1 N286A)时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例2)。
图3是在第三天添加B型变异型HA复合体2(HA3 R528A)时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例2)。
图4是在第三天添加B型变异型HA复合体3(HA1 N286A/HA3 R528A)时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例2)。
图5是在第三天添加B型变异型HA复合体4(HA3 K607A)时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(比较例1)。
图6是在第三天添加B型野生型HA复合体1时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例3)。
图7是在第三天添加B型野生型HA复合体2时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例3)。
图8是在第三天添加B型野生型HA复合体3时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例3)。
图9是在第三天添加B型野生型HA复合体4时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例3)。
图10是在第三天添加B型野生型HA复合体5时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例3)。
图11是在悬浮培养中添加B型野生型及B型变异型HA复合体时的iPS细胞的细胞团块的显微镜观察照片的一例(300个细胞/孔、实施例4)。
图12是在悬浮培养中添加B型野生型及B型变异型HA复合体时的iPS细胞的细胞团块的显微镜观察照片的一例(500个细胞/孔、实施例4)。
图13是在悬浮培养中B型野生型HA复合体的各种添加时间(6、12、18及24小时)中的、iPS细胞的细胞团块的显微镜观察照片的一例(实施例5)。
图14是说明实施例6中进行的实验的流程的图。
图15示出表示实施例6中的培养天数和活细胞浓度的关系的图表的一例。
图16是说明实施例7中进行的实验的流程的图。
图17示出表示实施例7中的培养天数和活细胞浓度的关系的图表的一例。
图18是在第三天添加A型变异型HA复合体2(HA3 R528A)时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例7)。
图19是在第三天添加A型变异型HA复合体3(HA1 N285A/HA3 R528A)时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(实施例7)。
图20是在第三天添加A型变异型HA复合体4(HA3 K607A)时的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例(比较例3)。
图21是对照(不添加HA)的iPS细胞的集落的显微镜观察照片的一例。
具体实施方式
已知源自肉毒杆菌的野生型血凝素为由HA1(33K、HA-33)、HA2(17K、HA-17)及HA3(70K、HA-70)的3种亚成分所构成的复合体。其中，源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素的亚成分HA1、HA2及HA3以2：1：1的比例形成12聚物复合体。另外，已知：源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素与E-钙粘着蛋白结合，介由E-钙粘着蛋白而抑制细胞间粘附；为HA2和HA3的复合体时也可得到E-钙粘着蛋白结合活性。
本发明在一方式中，基于如下见解：只要是至少含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3、具有构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列、且使构成糖链识别部位的氨基酸中的至少一个产生变异的血凝素(变异型血凝素)，则可以选择性地抑制在具有多能性的干细胞的培养中的集落内已产生的和/或产生的脱离了未分化状态的细胞(以下，也称为“未分化逸脱细胞”)的细胞间粘附，进而可以选择性地除去未分化逸脱细胞。
另外，本发明在一方式中，基于如下见解：在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将具有多能性的干细胞进行悬浮培养时，即使如人iPS细胞那样为纤细的细胞，也可以将细胞团块容易且有效地分割成小块，进而可以由小块形成新的细胞团块。
另外，本发明在一方式中，基于如下见解：与B型野生型血凝素相比，至少含有源自A型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3、具有构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列、且使构成糖链识别部位的氨基酸中的至少一个产生变异的血凝素(A型变异型血凝素)可以有效地除去未分化逸脱细胞。
[具有多能性的干细胞]
本发明中，在没有限定的一个或多个实施方式中，具有多能性的干细胞为人多能性(pluripotent)干细胞。本发明中，在没有限定的一个或多个实施方式中，人多能性干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
[脱离了未分化状态的细胞(未分化逸脱细胞)]
本发明中，在没有限定的一个或多个实施方式中，脱离了未分化状态的细胞(未分化逸脱细胞)的细胞的形态与未分化状态的细胞的形态不同，可以辨别。在没有限定的一个或多个实施方式中，成为未分化逸脱细胞可以通过未分化标记物的消失而确认。在没有限定的一个或多个实施方式中，未分化标记物为Oct3/4、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60。
[变异型血凝素(HA)复合体蛋白]
就本发明而言，在一个或多个实施方式中涉及一种源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白(以下，也称为“本发明的变异型HA复合体蛋白”)。本发明的变异型HA复合体蛋白为至少含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3、构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异的变异型血凝素复合体蛋白。就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，为具有构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列、且构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异的变异型血凝素复合体蛋白。另外，就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，为具有E-钙粘着蛋白结合活性、且构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异的变异型血凝素复合体蛋白。另外，就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，为具有E-钙粘着蛋白功能抑制活性、且构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异的变异型血凝素复合体蛋白。
就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可以发挥如下效果：在具有多能性的干细胞的培养中，能够抑制在集落内已产生的和/或产生的未分化逸脱细胞的细胞间粘附。本发明的变异型HA复合体蛋白优选可以从集落中除去未分化逸脱细胞，另外可以发挥如下效果：在具有多能性的干细胞的培养中，能够使所构成的集落维持在未分化状态(可以持续形成由维持在未分化状态的具有多能性的干细胞构成的集落)。
就本发明的变异型HA复合体蛋白至少含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3而言，在一个或多个实施方式中，还可以含有亚成分HA1。就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，为由HA2及HA3的2成分所构成的复合体，从更有效地抑制细胞间粘附、可以更有效地除去未分化逸脱细胞的观点出发，为由HA1、HA2及HA3的3成分所构成的复合体。
本发明的变异型HA复合体蛋白的构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异。就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可以也称为使源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素中的糖链结合活性的至少一部分或全部缺失的变异型血凝素复合体蛋白。作为源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素中的构成糖链结合部位的氨基酸，本发明人等发现了HA1的氨基酸序列(序列号1)的第286位的天冬酰胺及HA3的氨基酸序列(序列号3)的第528位的精氨酸等。另外，作为其它的氨基酸，已知有HA1的氨基酸序列(序列号1)的第264位的天冬酰胺等(例如KwangKook Lee et al,Biochem Biophys Res Commun 2014 Apr 4,Vol 446,Issue 2,pp.568-573等)。就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，这些氨基酸或相当于这些氨基酸的氨基酸产生变异，从可以自集落中有效地除去未分化逸脱细胞方面考虑，优选HA3的氨基酸序列(序列号3)的第528位的精氨酸或相当于其的氨基酸产生变异，更优选HA3的氨基酸序列(序列号3)的第528位的精氨酸或相当于其的氨基酸和HA1的氨基酸序列(序列号1)的第286位的天冬酰胺或相当于其的氨基酸产生变异。本发明中，“相当于这些氨基酸的氨基酸”是指立体结构上与上述的构成糖链结合部位的野生型的氨基酸同等的位置的氨基酸。就本发明中的氨基酸的变异而言，在一个或多个实施方式中，包含置换为不识别糖链的氨基酸，优选包含置换为丙氨酸。
本发明的变异型HA复合体蛋白具有源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素中的构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列。即，就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，具有E-钙粘着蛋白结合活性。因此，本发明在其它的方式中涉及一种至少含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3、具有E-钙粘着蛋白结合活性、且构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异的源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白。作为E-钙粘着蛋白结合部位，与源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素同样地具有E-钙粘着蛋白结合活性的源自A型肉毒杆菌的野生型血凝素中的E-钙粘着蛋白结合部位已经被解析(例如KwangKook Lee et al,Science 2014 Jun 20,Vol.344,no.6190 pp.1405-1410等)。
就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，作为亚成分HA3，包含在HA3的野生型(野生型HA3)的氨基酸序列(序列号3)中第528位的精氨酸或相当于其的氨基酸产生变异的氨基酸序列的一部分或全部。
就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，作为亚成分HA2，包含HA2的野生型(野生型HA2)的氨基酸序列(序列号2)的一部分或全部。
就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，作为亚成分HA1，包含在HA1的野生型(野生型HA1)的氨基酸序列(序列号1)中第264位的天冬酰胺或相当于其的氨基酸和/或第286位的天冬酰胺或相当于其的氨基酸产生变异的氨基酸序列的一部分或全部。
就本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，为由亚成分HA1、HA2及HA3形成、相当于所述亚成分HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相当于所述亚成分HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸中的一个氨基酸或两个氨基酸产生变异的变异型血凝素复合体蛋白。
作为本发明的变异型HA复合体蛋白的第1实施方式，可举出包含在野生型HA1的氨基酸序列(序列号1)中第264位的天冬酰胺和/或第286位的天冬酰胺产生变异的HA1(变异型HA1)、野生型HA2及野生型HA3的变异型HA复合体(变异型HA复合体1)。在变异型HA复合体1的一个或多个实施方式中，只要变异型HA复合体1中所含的亚成分HA1的至少1个为变异型HA1即可，优选全部的HA1为变异型HA1。
作为本发明的变异型HA复合体蛋白的第2实施方式，可举出包含在野生型HA1、野生型HA2、及野生型HA3的氨基酸序列(序列号3)中第528位的精氨酸或相当于其的氨基酸产生变异的HA3(变异型HA3)的变异型HA复合体(变异型HA复合体2)。在变异型HA复合体2的一个或多个实施方式中，只要变异型HA复合体2中所含的亚成分HA3的至少1个为变异型HA3即可，优选全部的HA3为变异型HA3。
作为本发明的变异型HA复合体蛋白的第3实施方式，可举出包含变异型HA1、野生型HA2及变异型HA3的变异型HA复合体(变异型HA复合体3)，从更有效地抑制细胞间粘附、更有效地除去未分化逸脱细胞的观点出发，优选列举在野生型HA1的氨基酸序列(序列号1)中第286位的天冬酰胺变异为丙氨酸的HA1(序列号4)、野生型HA2(序列号2)及在野生型HA3的氨基酸序列(序列号3)中第528位的精氨酸变异为丙氨酸的HA3(序列号5)。在变异型HA复合体3的一个或多个实施方式中，只要变异型HA复合体3中所含的亚成分HA1的至少1个为变异型HA1即可，优选全部的HA1为变异型HA1。另外，只要变异型HA复合体3中所含的亚成分HA3的至少1个为变异型HA3即可，优选全部的HA3为变异型HA3。
就本发明的变异型复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可以在亚成分HA1的C末端结合有标签。作为结合于C末端的标签，在一个或多个实施方式中，可举出FLAG标签、D4标签(DDDD、序列号15)等。就本发明的变异型复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，优选不在亚成分HA1的N末端结合标签，优选不在亚成分HA1的N末端结合His标签或FLAG标签。
[具有多能性的干细胞的培养方法]
本发明在一方式中，包含一种具有多能性的干细胞的培养方法，其中，在本发明的变异型HA复合体蛋白的存在下进行细胞培养(以下，也称为“本发明的培养方法”)。根据本发明的培养方法，由于在本发明的变异型HA复合体蛋白的存在下进行细胞培养，因此，在一个或多个实施方式中，能够除去未分化逸脱细胞，另外，可以发挥如下效果：在具有多能性的干细胞的培养中，使所构成的集落维持在未分化状态。另外，根据本发明的培养方法，由于在本发明的变异型HA复合体蛋白的存在下进行细胞培养，因此，在一个或多个实施方式中，即使如源自人的iPS细胞那样为纤细的细胞，也可以将球形的细胞团块有效地分割，优选可以将具有多能性的干细胞有效且大量地进行培养。在本发明的培养方法中，就细胞培养而言，在一个或多个实施方式中，可举出粘附培养(平面培养)及悬浮培养等。
[粘附培养]
作为本发明的培养方法的第一实施方式，可举出通过粘附培养而进行细胞培养。细胞培养为粘附培养的情况下，在一个或多个实施方式中，可以发挥如下效果：从形成于培养面上的集落中除去未分化逸脱细胞。因此，本发明在其它的方式中涉及一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可能产生的脱离了未分化状态的细胞的方法，其中，包含在本发明的变异型血凝素复合体蛋白的存在下进行细胞培养。另外，本发明在其它的方式中涉及一种由脱离了未分化状态的细胞所产生的集落来形成由未分化状态的细胞构成的集落的方法，其中，包含将在本发明的变异型HA复合体蛋白的存在下所述脱离了未分化状态的细胞产生的集落进行培养。本发明在其它的方式中涉及一种维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法，其中，包含在本发明的变异型HA复合体蛋白的存在下进行细胞培养。
根据本发明的培养方法、除去方法、集落形成方法和/或维持方法，在一个或多个实施方式中，可以从集落中有效地除去未分化逸脱细胞，可以仅将未分化细胞有效地培养。根据本发明的培养方法及除去方法，在一个或多个实施方式中，可以一边在用培养装置的培养中维持封闭空间，一边除去未分化逸脱细胞，可以进行集落选拔，即，使构成集落的细胞实质上仅为未分化细胞。
第一实施方式中的细胞培养可以采用目前所使用的和/或今后所开发的、具有多能性的干细胞的培养条件及培养基等，可以通过使本发明的变异型HA复合体蛋白存在于该培养条件的培养基中来进行。在没有限定的一个或多个实施方式中，可以将本发明的变异型HA复合体蛋白添加于培养中的培养基，或者，可以使用预先添加有本发明的变异型HA复合体蛋白的培养基进行培养。在没有限定的一个或多个实施方式中，本发明的变异型HA复合体蛋白可以在确认了集落中产生未分化逸脱细胞的情况下随时添加。培养基、培养板等可以使用市售的培养基、培养板。
就本发明的培养方法、除去方法、集落形成方法和/或维持方法中使用的本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，从有效地除去未分化逸脱细胞方面考虑，优选含有变异型HA3，更优选含有变异型HA1及变异型HA3。存在于培养基的本发明的变异型HA复合体蛋白的浓度在没有限定的一个或多个实施方式中，从有效地除去未分化细胞的观点出发，可举出5nM以上、10nM以上、或15nM以上。从同样的观点出发，为200nM以下，150nM以下，或100nM以下。
在本发明的培养方法、除去方法、集落形成方法和/或维持方法中，就添加于培养基中的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可以通过细胞内吸收(内吞作用等)而自发地被除去。另外，通过装备以变异型HA复合体蛋白所附带的标签为目标的吸附柱并使培养基循环，可以将变异型HA复合体蛋白强制地从培养基中进行回收。通过这样将变异型HA复合体蛋白自发和/或强制地除去、回收，可以适时且暂时地或连续地进行未分化逸脱细胞的除去。就本发明的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，包含通过生物反应器的自动运转而进行具有多能性的干细胞的细胞培养。
第一实施方式中的细胞培养在没有限定的一个或多个实施方式中，可以为使用饲养细胞的培养，也可以为无饲养培养。就饲养细胞而言，在没有限定的一个或多个实施方式中，可举出：MEF(Mouse Embryo Fibroblast，鼠胚成纤维细胞)细胞、SL10、及SNL76/7饲养细胞等。就饲养细胞而言，在没有限定的一个或多个实施方式中，在饲养细胞中，优选具有多能性的干细胞的迁移速度比较缓慢的饲养细胞。饲养细胞在没有限定的一个或多个实施方式中，从具有多能性的干细胞的迁移比较缓慢、在具有多能性的干细胞的培养中的集落中可以使未分化逸脱细胞产生于集落中央部方面考虑，优选SNL 76/7饲养细胞。
[悬浮培养]
作为本发明的培养方法的第二实施方式，可举出通过悬浮培养而进行细胞培养。细胞培养为悬浮培养的情况下，在一个或多个实施方式中，即使为如源自人的iPS细胞那样纤细的细胞，也可将细胞团块有效地分割，优选可以将具有多能性的干细胞有效且大量地进行培养。因此，本发明在其它的方式中涉及一种具有多能性的干细胞的细胞团块的分割方法，其中，包含在本发明的变异型HA复合体蛋白的存在下，将具有多能性的干细胞进行悬浮培养。
就第二实施方式中的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，包含：通过将所述干细胞的细胞团块在源自肉毒杆菌的血凝素存在下进行悬浮培养，从而将所述干细胞的细胞团块分割成小块；及将所述小块进行悬浮培养而形成新的细胞团块。就第二实施方式中的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，在与细胞团块的分割相同的培养基内进行细胞团块的形成。就添加于培养基中的本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可以通过细胞内吸收(内吞作用等)而自发地除去。因此，就第二实施方式中的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，可以不清洗变异型HA复合体蛋白，通过连续培养而进行细胞团块的分割和新的细胞团块的形成。就第二实施方式中的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，不包含清洗变异型HA复合体蛋白的工序。另外，在一个或多个实施方式中，通过装备以本发明的变异型HA复合体蛋白所附带的标签为目标的吸附柱，并使培养基循环，可以强制地从培养基中回收本物质。通过这样可以自发和/或强制地除去、回收变异型HA复合体蛋白、能够控制细胞团块的分割并适时且暂时地或连续地发挥分割效果的本发明的培养方法，在一个或多个实施方式中，包含通过生物反应器的自动运转而进行具有多能性的干细胞的细胞培养。
第二实施方式中的细胞培养可以采用目前所使用的和/或今后所开发的、具有多能性的干细胞的培养条件及培养基等，可以通过使本发明的变异型HA复合体蛋白存在于该培养条件的培养基中而进行。在没有限定的一个或多个实施方式中，可以将本发明的变异型HA复合体蛋白添加于培养中的培养基，或者，也可以使用预先添加有本发明的变异型HA复合体蛋白的培养基进行培养。培养基及培养容器等可以使用市售的培养基及培养容器。
就存在于培养基的本发明的变异型HA复合体蛋白的浓度而言，在没有限定的一个或多个实施方式中，从有效地除去未分化细胞的观点出发，可举出5nM以上、10nM以上、或15nM以上。从同样的观点出发，为200nM以下、150nM以下、或100nM以下。
就悬浮培养而言，在一个或多个实施方式中，可以采用目前所使用的和/或今后所开发的、具有多能性的干细胞的培养条件及培养基等，通过使本发明的变异型HA复合体蛋白存在于该培养条件的培养基中而进行。
[iPS细胞的培养方法]
就本发明而言，在一个或多个实施方式中涉及一种iPS细胞的培养方法，其中，包含在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将所述iPS细胞进行悬浮培养(以下，也称为“本发明的iPS细胞的培养方法”)。根据本发明的iPS细胞的培养方法，即使如源自人的iPS细胞那样为纤细的细胞，也可以将球形的细胞团块有效地分割，因此，可以将iPS细胞有效且大量地进行培养。因此，就本发明而言，在一个或多个实施方式中涉及一种iPS细胞的细胞团块的分割方法，其中，包含在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将iPS干细胞进行悬浮培养(以下，也称为“本发明的分割方法”)。
就本发明的iPS细胞的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，包含：通过将iPS细胞的细胞团块在源自肉毒杆菌的血凝素存在下进行悬浮培养，将iPS细胞的细胞团块分割成小块；及将所述小块进行悬浮培养而形成新的细胞团块。就本发明的iPS细胞的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，在与细胞团块的分割相同的培养基内进行细胞团块的形成。就添加于培养基的本发明的变异型HA复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可以通过细胞内吸收(内吞作用等)而自发地除去。因此，就本发明的iPS细胞的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，可以不清洗变异型HA复合体蛋白，通过连续培养而进行细胞团块的分割和新的细胞团块的形成。就本发明的iPS细胞的培养方法而言，在一个或多个实施方式中，不包含清洗变异型HA复合体蛋白的工序。另外，在一个或多个实施方式中，通过装备以本发明的变异型HA复合体蛋白所附带的标签为目标的吸附柱，并使培养基循环，可以从培养基中强制地回收本物质。通过这样可以自发和/或强制地除去、回收变异型HA复合体蛋白、可以控制细胞团块的分割而适时且暂时地或连续地发挥分割效果的本发明的培养方法，在一个或多个实施方式中，包含通过生物反应器的自动运转而进行具有多能性的干细胞的细胞培养。
作为本发明的iPS细胞的培养方法及分割方法中使用的源自肉毒杆菌的血凝素，作为一个或多个实施方式，可举出源自A型肉毒杆菌的血凝素及源自B型肉毒杆菌的血凝素等。作为源自B型肉毒杆菌的血凝素，在一个或多个实施方式中，优选含有在C末端结合有标签的亚成分HA1。就源自B型肉毒杆菌的血凝素而言，在一个或多个实施方式中，可举出本发明的变异型HA复合体蛋白等。
在本发明的iPS细胞的培养方法及分割方法中，从能够以低浓度将细胞团块有效地分割方面考虑，优选源自A型肉毒杆菌的血凝素。作为源自A型肉毒杆菌的血凝素，在一个或多个实施方式中，可举出源自A型野生型肉毒杆菌的血凝素及后述的源自A型变异型肉毒杆菌的血凝素。
在本发明的iPS细胞的培养方法及分割方法中，悬浮培养条件、HA的添加条件等可以与第二实施方式的培养方法同样地进行。
[组合物]
本发明在其它的方式中涉及一种含有源自肉毒杆菌的血凝素的组合物(以下，也称为“本发明的组合物”。)。本发明的组合物可以用于本发明的培养方法、本发明的除去方法、本发明的集落形成方法、本发明的维持方法、和/或本发明的分割方法。因此，本发明在其它的方式中涉及一种用于本发明的培养方法、本发明的除去方法、本发明的集落形成方法、本发明的维持方法、和/或本发明的分割方法的组合物，其中，包含源自肉毒杆菌的血凝素。另外，本发明在其它的方式中涉及一种源自肉毒杆菌的血凝素在本发明的培养方法、本发明的除去方法、本发明的集落形成方法、本发明的维持方法、和/或本发明的分割方法中的用途。作为源自肉毒杆菌的血凝素，在一个或多个实施方式中，可举出上述的源自A型肉毒杆菌的血凝素及源自B型肉毒杆菌的血凝素以及它们的复合体，作为源自B型肉毒杆菌的血凝素，在一个或多个实施方式中，可举出本发明的变异型HA复合体、及野生型HA复合体。
[试剂盒]
本发明在其它的方式中涉及一种试剂盒，其包含具有多能性的干细胞用的培养基成分和本发明的变异型血凝素复合体蛋白(以下，也称为“本发明的试剂盒”。)。本发明的试剂盒中的“变异型血凝素复合体蛋白”如上所述。本发明的试剂盒可以用于本发明的培养方法、除去方法、集落形成方法、和/或维持方法。具有多能性的干细胞用的培养基成分没有特别限定，可以使用目前所使用的或今后所开发的培养基成分。
[用于具有多能性的干细胞的培养的组合物]
本发明在其它的方式中涉及一种含有源自肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白的、用于具有多能性的干细胞的培养的组合物(以下，“本发明的培养用组合物”)。本发明的培养用组合物可以用于本发明的培养方法、本发明的除去方法、本发明的集落形成方法、本发明的维持方法、和/或本发明的分割方法。
本发明的培养用组合物中所含的源自肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白为至少含有源自肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3、具有构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列、且构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异的变异型血凝素复合体蛋白。构成变异型血凝素复合体蛋白的血凝素只要是具有与E-钙粘着蛋白的相互作用的血凝素，其肉毒杆菌的类型没有特别限制。作为肉毒杆菌，在没有特别限定的一个或多个实施方式中，可举出A型肉毒杆菌或B型肉毒杆菌。
就源自肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可举出作为源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白的本发明的变异型HA复合体蛋白。
就源自肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，可举出源自A型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白(以下，也称为“A型变异型HA复合体”)。
作为A型变异型HA复合体，在一个或多个实施方式中，可举出构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异的公知的A型变异型HA复合体。作为源自A型肉毒杆菌的野生型血凝素中的构成糖链结合部位的氨基酸，例如有：HA1的氨基酸序列(序列号16)的第285位的天冬酰胺、及HA3的氨基酸序列(序列号18)的第528位的精氨酸、HA1的氨基酸序列(序列号16)的第263位的天冬酰胺等。
A型变异型HA复合体至少含有源自A型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3，在一个或多个实施方式中，可以还含有亚成分HA1。就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，为由HA2及HA3的2成分构成的复合体，从更有效地抑制细胞间粘附、可以更有效地除去未分化逸脱细胞的观点出发，为由HA1、HA2及HA3的3成分构成的复合体。
A型变异型HA复合体的构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异。就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，可以也称为使源自A型肉毒杆菌的野生型血凝素中的糖链结合活性的至少一部分或全部缺失的变异型血凝素复合体蛋白。就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，构成糖链结合部位的氨基酸或相当于这些氨基酸的氨基酸产生变异，从可以从集落中有效地除去未分化逸脱细胞方面考虑，优选HA3的氨基酸序列(序列号18)的第528位的精氨酸或相当于其的氨基酸产生变异，更优选HA3的氨基酸序列(序列号18)的第528位的精氨酸或相当于其的氨基酸和HA1的氨基酸序列(序列号16)的第285位的天冬酰胺或相当于其的氨基酸产生变异。
A型变异型HA复合体具有源自A型肉毒杆菌的野生型血凝素中的构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列。即，就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，具有E-钙粘着蛋白结合活性。
就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，作为亚成分HA3，包含在A型-HA3的野生型(野生型HA3)的氨基酸序列(序列号18)中第528位的精氨酸或相当于其的氨基酸产生变异的氨基酸序列的一部分或全部。
就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，作为亚成分HA2，包含A型-HA2的野生型(野生型HA2)的氨基酸序列(序列号17)的一部分或全部。
就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，作为亚成分HA1，包含在A型-HA1的野生型(野生型HA1)的氨基酸序列(序列号16)中第264位的天冬酰胺或相当于其的氨基酸、和/或第286位的天冬酰胺或相当于其的氨基酸产生变异的氨基酸序列的一部分或全部。
就A型变异型HA复合体而言，在一个或多个实施方式中，可以在亚成分HA1的C末端结合有标签。作为与C末端结合的标签，在一个或多个实施方式中，可举出FLAG标签、D4标签(DDDD、序列号15)等。就本发明的变异型复合体蛋白而言，在一个或多个实施方式中，优选不在亚成分HA1的N末端结合标签，优选不在亚成分HA1的N末端结合His标签或FLAG标签。
就本发明而言，在一个或多个实施方式中涉及：使用本发明的培养用组合物的、将具有多能性的干细胞进行培养的方法、除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可能产生的脱离了未分化状态的细胞的方法、及维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法。就这些方法而言，在一个或多个实施方式中，包含在本发明的培养用组合物的存在下将具有多能性的干细胞进行细胞培养。
本发明进一步涉及以下的没有限定的一个或多个实施方式。
[A1]一种变异型血凝素复合体蛋白，其为源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白，其中，
所述复合体蛋白至少含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3，
构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异。
[A2]一种变异型血凝素复合体蛋白，其为源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白，其中，
所述复合体蛋白至少含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3，
具有构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列，且
构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异。
[A3]根据[A1]所述的变异型血凝素复合体蛋白，其中，所述复合体蛋白还含有源自B型肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA1。
[A4]根据[A3]所述的变异型血凝素复合体蛋白，其中，所述构成糖链结合部位的氨基酸选自由相当于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第264位的天冬酰胺的氨基酸、相当于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相当于所述HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸构成的组。
[A5]一种变异型血凝素复合体蛋白，其为源自B型肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白，其中，
所述复合体蛋白由亚成分HA1、HA2及HA3形成，
相当于所述亚成分HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相当于所述亚成分HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸中的一个氨基酸或两个氨基酸产生变异。
[A6]根据[A1]～[A5]中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白，其中，在所述亚成分HA1的C末端结合有标签。
[A8]根据[A1]～[A7]中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白，其中，所述复合体蛋白具有E-钙粘着蛋白功能抑制活性。
[A9]根据[A1]～[A8]中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白，其中，所述复合体蛋白具有E-钙粘着蛋白结合活性。
[A10]根据[A1]～[A9]中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白，其中，所述复合体蛋白具有构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列。
[B1]一种具有多能性(pluripotency)的干细胞的培养方法，其中，包含在[A1]～[A10]中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白的存在下进行细胞培养。
[B2]根据[B1]所述的方法，其中，所述细胞培养为粘附培养或悬浮培养。
[C1]一种除去在具有多能性(pluripotency)的干细胞的培养中产生的或可能产生的脱离了未分化状态的细胞的方法，其中，包含在[A1]～[A10]中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白的存在下进行细胞培养。
[C2]一种维持具有多能性(pluripotency)的干细胞的未分化状态的方法，其中，包含在[A1]～[A10]中任一项所述的变异型HA复合体蛋白的存在下进行细胞培养。
[D1]一种源自人的iPS细胞的培养方法，其中，包含在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将所述iPS细胞进行悬浮培养。
[D2]根据[D1]所述的方法，其中，包含：通过在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将所述iPS细胞的细胞团块进行悬浮培养，从而将所述细胞团块分割成小块；及
将所述小块进行悬浮培养而形成新的细胞团块，
在与所述细胞团块的分割相同的培养基内进行所述细胞团块的形成。
[D3]一种源自人的iPS细胞的细胞团块的分割方法，其中，包含在源自肉毒杆菌的血凝素存在下将所述iPS细胞进行悬浮培养。
[D4]根据[D1]～[D3]中任一项所述的方法，其中，所述源自肉毒杆菌的血凝素通过内吞作用而被摄入。
[D5]根据[D1]～[D4]中任一项所述的方法，其中，所述源自肉毒杆菌的血凝素选自由源自A型肉毒杆菌的血凝素及源自B型肉毒杆菌的血凝素构成的组。
[D6]根据[D5]所述的方法，其中，所述源自B型肉毒杆菌的血凝素包含权利要求1～5中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白。
[E1]一种含有源自肉毒杆菌的血凝素的组合物，其用于[B1]、[B2]、[C1]、[C2]及[D1]～[D6]中任一项所述的方法。
[F1]一种试剂盒，其包含具有多能性的干细胞用的培养基成分和[A1]～[A10]中任一项所述的变异型血凝素复合体蛋白。
[F2]根据[F1]所述的试剂盒，其用于[B1]、[B2]、[C1]、[C2]及[D1]～[D6]中任一项所述的方法。
[G1]一种含有源自肉毒杆菌的变异型血凝素复合体蛋白的组合物，其中，
所述复合体蛋白为如下变异型血凝素复合体蛋白：
至少含有源自肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA2及HA3、
具有构成E-钙粘着蛋白结合部位的氨基酸序列、且
构成糖链结合部位的氨基酸中的至少一个产生变异，
所述组合物用于选自由如下方法构成的组中的任一种方法：
除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可能产生的脱离了未分化状态的细胞的方法、
维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法、
将源自人的iPS细胞进行悬浮培养的方法、及
源自人的iPS细胞的细胞团块的分割方法。
[G2]根据[G1]所述的组合物，其中，所述肉毒杆菌为A型肉毒杆菌或B型肉毒杆菌。
[G3]根据[G1]或[G2]所述的组合物，其中，所述复合体蛋白还含有源自肉毒杆菌的血凝素的亚成分HA1。
[G4]根据[G3]所述的组合物，其中，在A型肉毒杆菌的情况下，所述构成糖链结合部位的氨基酸选自由相当于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第263位的天冬酰胺的氨基酸、相当于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第285位的天冬酰胺的氨基酸、及相当于所述HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸构成的组，
在B型肉毒杆菌的情况下，所述构成糖链结合部位的氨基酸选自由相当于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第264位的天冬酰胺的氨基酸、相当于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相当于所述HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸构成的组。
[H1]一种具有多能性的干细胞的培养方法，其中，包含在[G1]～[G4]中任一项所述的组合物的存在下进行细胞培养。
[H2]根据[H1]所述的方法，其中，所述细胞培养为粘附培养或悬浮培养。
[H3]一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可能产生的脱离了未分化状态的细胞的方法，其中，包含在[G1]～[G4]中任一项所述的组合物的存在下进行细胞培养。
[H4]一种维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法，其中，包含在[G1]～[G4]中任一项所述的组合物的存在下进行细胞培养。
实施例
以下，通过实施例，进一步详细地说明本发明，但这些实施例为例示性的，本发明不受这些实施例限定。
(实施例1)
[B型肉毒HA复合体的制作]
按照以下的步骤制作下述表1所示的源自B型肉毒杆菌的野生型HA复合体及变异型HA复合体1～4。这些HA复合体(野生型HA复合体及变异型HA复合体)使用源自B型肉毒杆菌的野生型HA亚成分(HA1、HA2、HA3)、变异型HA1(HA1 N286A、序列号4)、变异型HA3(HA3 R528A、序列号5)及变异型HA3X(HA3 K607A、序列号6)而制作。
(1)质粒的制作
就野生型而言，分别使用下述的引物，以Clostridium botulinum B-Okra株的基因组DNA为模板，通过PCR法对编码作为HA1、HA2及HA3的各自的蛋白质的以下的蛋白质的基因进行扩增。
(各亚成分的蛋白质)
HA1：在由序列号1的氨基酸序列的7-294位的氨基酸序列构成的蛋白质的C末端结合有FLAG标签的重组蛋白
HA2：在由序列号2的氨基酸序列的2-146位的氨基酸序列构成的蛋白质的N末端结合有FLAG标签的重组蛋白
HA3：在由序列号3的氨基酸序列的19-626位的氨基酸序列构成的蛋白质的N末端结合有Strep标签的重组蛋白
(标签序列)
FLAG标签：DYKDDDDK(序列号7)
Strep标签：WSHPQFEK(序列号8)
(HA1扩增用引物)
HA1正向引物：catgccatgggcatccaaaattcattaaatgac(序列号9)
HA1反向引物：cgggatccttacttgtcgtcatcgtctttgtagtctgggttactcatagtccatatc(序列号10)
(BHA2扩增用引物)
HA2正向引物：tgaataagctttcagctgaaagaacttttc(序列号11)
HA2反向引物：cactttggtaccttatattttttcaagtttga(序列号12)
(HA3扩增用引物)
HA3正向引物：gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg(序列号13)
HA3反向引物：cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc(序列号14)
变异型HA复合体1～4(表1)中，将插入有野生型HA的载体为模板，利用通过PCR的定点诱变(site-directed mutagenesis)法而进行变异体的制作。
关于扩增的DNA片段，HA1插入于pET52b(+)的NcoI-BamHI site，HA2插入于pT7-FLAG-1(Sigma)的HindIII-SalI site，关于HA3，插入于pET52b(+)(Novagen)的KpnI-SalI site(pET-BHA3)。
(2)蛋白质表达
制作的质粒分别单独转化大肠菌株Rosetta2(DE3)(Novagen)。蛋白质表达诱导使用Overnight Express Autoinduction system1(Novagen)而进行。HA1及HA3在30℃下进行蛋白质表达诱导36小时，关于HA2，在18℃下进行蛋白质表达诱导40小时。大肠菌通过离心而回收，在-80℃下保存。
(3)蛋白质纯化及复合体制作
HA1及HA2使用Anti-FLAG M2 agarose(Sigma)进行纯化。HA3使用StrepTrap HP(GE Healthcare)进行纯化。
将分别纯化的重组体蛋白质以HA1：HA2：HA3＝4：4：1的摩尔比进行混合，在37℃下孵育3小时后，利用StrepTrap HP进行纯化，由此得到HA复合体。
[表1]
(实施例2)
[B型变异型HA复合体给iPS细胞带来的影响]
在饲养细胞上播种iPS细胞(day0)，每24小时用维持培养基进行培养基交换。在3天后(day3)，添加HA复合体(野生型HA复合体或变异型HA复合体)，孵育24小时，用PBS清洗2次，用维持培养基进行培养基交换(day4)。其后，每24小时用维持培养基进行培养基交换，至9天后(day9)。培养后，用免疫细胞染色法确认所培养的细胞的Oct3/4的表达。使用的细胞、培养基及培养条件如下所述。
[细胞]
iPS细胞：Tic NP29(将用MEF维持的Tic进行了传代的细胞)
饲养细胞：SNL 76/7
[培养基]
iPS细胞：Repro Stem(商品名，ReproCELL公司制)、5ng/mLbFGF(ReproCELL公司制)
饲养细胞：DMEM(Sigma公司制)(7％FBS(GIBCO公司制)，1％Penicillin-streptomycin solution(NACALAI TESQUE公司制))
[容器]
12孔板(培养面积：3.8cm2/孔，Corning公司制)
[HA制备、添加方法]
用PBS将HA复合体进行逐级稀释，进而，使用培养基(Repro Stem)进行稀释(终浓度：100nM)。进一步加入bFGF(终浓度5ng/ml)，将其添加于孔中。
[培养条件]
37℃、5％CO2气氛下
iPS细胞传代后，在3天后(day3)的培养基交换中，以各浓度添加HA复合体，培养24小时。其后，在4天后(day4)的培养基交换中，更换为不添加HA复合体的培养基，继续进行培养。
[观察]
在day3、day4、day5及day9，用IN Cell Analyzer 2000(商品名，GE卫生保健生物科学公司制)观察培养细胞，取得图像。将得到的显微镜观察照片示于图1～4。图1～4中，将在上图中用实线包围的部分示于下图。
(比较例1)
使用变异型HA复合体4(HA3 K607A)，进行与实施例2同样的实验。将其结果示于图5。图5中，将在上图中用实线包围的部分示于下图。
图1表示野生型HA复合体的显微镜照片，图2表示变异型HA复合体1的显微镜照片，图3表示变异型HA复合体2的显微镜照片，以及图4表示变异型HA复合体3的显微镜照片。
已知亚成分HA1中的第286位天冬酰胺及HA3中的第528位的精氨酸为糖链识别部位。如图2～4所示，在使糖链结合活性缺失的任一种变异型HA复合体1～3中，自变异型HA复合体添加24小时后(day3)，未分化逸脱细胞的细胞间粘附变得松弛，可以确认未分化逸脱细胞的细胞间粘附的抑制。特别是变异型HA复合体2(HA3 R528A)抑制集落中心的未分化逸脱细胞的细胞间粘附，同时确认了细胞的剥离，另外，在变异型HA复合体3(HA1 N286A/HA3 R528A)中，如图4所示，自变异型HA复合体添加24小时后(day3)，细胞间粘附变得松弛，在48小时后(day4)，与其它变异型HA及野生型HA相比，可看到细胞剥离的效果高(图4的箭头所示的部分)。进而得知：在培养第9天(day9)，形成未分化维持集落。另一方面，作为钙粘着蛋白结合活性消失变异体的比较例1的变异型HA复合体4(HA3 K607A)不能确认细胞间粘附的抑制及细胞的剥离(图5)。因此表明：通过使糖链结合活性缺失的变异型HA复合体1～3，可以抑制局部的细胞-细胞间粘附，同时，特别是通过变异型HA复合体2及3，可以进行有效的未分化逸脱细胞的剥离。
使用DAPI和未分化标记物(Oct3/4、TRA-1-60及SSEA-4)或内胚层、中胚层或外胚层的初期分化标记物(α-SAM、Serumalbumin或Nestin)将集落进行染色。其结果，在集落中心产生的未分化逸脱细胞，其未分化标记物及上述的初期分化标记物均为阴性，其周边的细胞，确认未分化标记物为阳性。
(实施例3)
[B型HA复合体给iPS细胞带来的影响(其2)]
如下述表2所示，在不同的位置上结合有标签，除此之外，通过与实施例1同样的步骤制作野生型HA复合体1～5。
使用制备的野生型HA复合体1～5，与实施例2同样地操作，确认给iPS细胞带来的影响。将其结果示于图6～10。图6表示野生型HA复合体1的显微镜照片，图7表示野生型HA复合体2的显微镜照片，图8表示野生型HA复合体3的显微镜照片，图9表示野生型HA复合体4的显微镜照片，以及图10表示野生型HA复合体5的显微镜照片。
[表2]
如图6～10的箭头所示，在任一个野生型HA复合体中，自野生型HA复合体添加24小时后(day3)，可以确认未分化逸脱细胞的细胞间粘附的松弛(细胞间粘附的抑制)。特别是野生型HA复合体1、3及4，自添加24小时后(day3)，可确认细胞的剥离，其中，野生型HA复合体1在培养第5天(day5)，可确认未分化逸脱细胞被除去，并形成未分化维持集落。因此表明：通过野生型HA复合体1，可以进行有效的未分化逸脱细胞的剥离。
(实施例4)
[B型变异型HA复合体给iPS细胞团块带来的影响(其1)]
使用V形底96孔板制作iPS细胞团块，每天进行半量培养基交换。在培养第3天(day3)，对iPS细胞团块添加HA复合体。在培养第4天(day4)，将iPS细胞团块移至平底96孔板，进行轻柔移液，确认细胞团块是否分裂。使用的细胞、培养基、HA复合体及培养条件等如下所述。
[细胞]
人iPS细胞(用Tic NP41(iMatrix-511(nippi)维持的iPS细胞))
[培养基]
mTeSR1(STEMCELL Technologies)
[容器]
V形底96孔板(Sumitomo Bakelite)
[HA]
野生型HA复合体
变异型HA复合体1(HA1 N286A)
变异型HA复合体2(HA3 R528A)
变异型HA复合体3(HA1 N286A/HA3R528A)
变异型HA复合体4(HA3 K607A)
[HA制备、添加方法]
将用PBS对HA复合体进行逐级稀释、进而使用培养基(mTeSR1)进行了稀释的物质(终浓度：100nM)添加于孔中。
[培养条件]
37℃、5％CO2气氛下
[观察]
对全视野，使用In Cell Aanalyzer(商品名，GE卫生保健生物科学公司制)观察细胞团块，取得图像。在变异型HA复合体添加前后(day3及day4)以倍数4倍进行拍摄。将得到的显微镜照片示于图11及12。
将分裂的细胞团块在层粘连蛋白包覆的培养面上进行培养(饲养细胞：SNL)，每天进行总量培养基交换。在培养第5天，进行细胞形态的观察，同时利用使用mouse monoclonal Oct3/4antibody(Santa Cruz Biotechnology，sc-5279)的免疫细胞染色法确认所培养的细胞的Oct3/4的表达，另外，进行DAPI染色。
作为对照，除不添加HA复合体以外，与上述同样地进行。将以上的结果示于下述表3。
[表3]
[评价基准]
◎：可以将细胞团块分割成更小的块。
○：可以分割细胞团块。
△：几乎不能确认细胞团块的分割。
×：细胞团块没有分割。
如图11及12所示，通过添加野生型HA复合体及变异型HA复合体1～3，可以使人iPS细胞团块分割成更小的尺寸的细胞团块。特别是通过变异型HA复合体1～3的添加，可以使人iPS细胞团块分割成更小的块。另一方面，在作为钙粘着蛋白结合活性消失变异体的比较例1的变异型HA复合体4(HA3 K607A)的添加中，几乎没有看到细胞团块的分割，在对照(不添加HA复合体)中，细胞团块没有进行分割。
(实施例5)
[B型HA复合体给iPS细胞团块带来的影响(其2)]
作为前培养，在30ml反应器中将iPs细胞培养5天。将培养第5天的细胞移至24孔板，添加HA复合体。自HA复合体添加经过6、12、18或24小时后，通过培养基交换而除去HA，进行移液而使细胞团块分割。其后进行培养24小时，观察细胞团块的形态。使用的细胞、培养基、HA及培养条件等如下所述。将得到的显微镜照片示于图13。
[细胞]
人iPS细胞(Tic，National Center for Global Health and Medicine，Np.52)
[培养基]
mTeSR1(Cata #0580/05896，STEMCELL TECHNOLOGIES)
[培养环境]
37℃，5％CO2气氛下
[培养容器]
24孔板(Corning，Cat.No.3526)
[播种密度]
1.0×105个细胞/ml
[HA]
野生型HA复合体5(His-BHA1-FLAG：His-BHA2：Strep-BHA3)
添加浓度：40nM
[观察装置]
IN Cell Analyzer(GE Healthcare)
如图13所示，将通过HA复合体的添加而较小地分割成的细胞团块进行培养，由此再次形成凝团块。另外，确认有如下倾向：相对于HA复合体的添加时间(从HA添加至培养基交换的时间)，添加时间为6小时的情况下，分割的程度最强，在12小时以后，不易被分割。由此表明：就培养基内的HA复合体而言，可能是通过细胞的内吞作用等HA复合体消化或失活。因此表明：通过HA复合体而使细胞团块分割之后，即使在不进行HA的除去操作的情况下，也可以使iPS细胞再次凝集而形成细胞团块。另一方面，添加于培养基中的HA复合体通过装备以HA复合体所附带的标签为目标的吸附柱并使培养基循环，可以强制地从培养基中回收HA复合体。因此表明：可以自发或强制地除去、回收HA复合体，因此，可以适时且暂时地或连续地发挥逸脱细胞的除去或细胞团块的分割效果，可以进行生物反应器中的自动运转。
(实施例6)
[B型变异型HA复合体给iPS细胞团块带来的影响(其3)]
通过图14所示的步骤进行iPS细胞的培养。首先，在生物反应器中将iPS细胞进行悬浮培养120小时，形成iPS细胞的细胞团块。接着，添加B型变异型HA复合体，进行HA处理6小时后，通过移液将细胞团块进行分割，接着添加10μM ROCK抑制剂，进一步进行悬浮培养。另外，每24小时进行活细胞浓度的测定。将其结果的一例示于图15。
[细胞]
人iPS细胞(Tic，National Center for Global Health and Medicine，Np.52)
[培养基]
mTeSR1(Cata #0580/05896，STEMCELL TECHNOLOGIES)
[培养环境]
37℃，5％CO2气氛下
[培养容器]
24孔板(Corning，Cat.No.3526)
[播种密度]
1.0×105个细胞/ml
[HA]
B型变异型HA复合体(标签(结合部位、种类)HA1：C末端FLAG、HA2：N末端FLAG、HA3：N末端Strep)
添加浓度：10nM
[观察装置]
IN Cell Analyzer(GE Healthcare)
可以确认：通过HA处理后的移液而分割成小的块的细胞团块，通过其后的培养进行再凝集而形成细胞团块。因此表明：通过细胞的内吞作用等，HA复合体消化或失活。另外，可以确认：如图15所示，活细胞浓度随着培养天数而增加。因此，通过有效利用基于HA处理的细胞分割操作，可以实现iPS细胞的高密度培养工艺。
(实施例7)
[B型变异型HA复合体给iPS细胞团块带来的影响(其4)]
通过图16所示的步骤进行iPS细胞的培养。首先，在生物反应器中放入iPS细胞，接着添加10μM ROCK抑制剂，进行24小时ROCK抑制剂处理之后，进行悬浮培养120小时，形成iPS细胞的细胞团块。接着添加B型变异型HA复合体，进行HA处理6小时后，通过移液将细胞团块进行分割。接着添加10μM ROCK抑制剂，进行ROCK抑制剂处理18小时后，进一步进行悬浮培养12小时。予以说明，每24小时进行培养基交换及活细胞浓度的测定。将其结果的一例示于图17。
[细胞]
人iPS细胞(Tic，National Center for Global Health and Medicine，Np.52)
[培养基]
mTeSR1(Cata #0580/05896，STEMCELL TECHNOLOGIES)
[培养环境]
37℃，5％CO2气氛下
[培养容器]
24孔板(Corning，Cat.No.3526)
[播种密度]
1.0×105个细胞/ml
[HA]
B型变异型HA复合体(标签(结合部位、种类)HA1：C末端FLAG、HA2：N末端FLAG、HA3：N末端Strep)
添加浓度：10nM
[观察装置]
IN Cell Analyzer(GEHealthcare)
作为对照，如图16所示，进行通过通常的传代培养法的iPS细胞的培养。即，不进行HA处理及培养开始后150小时及198小时的ROCK抑制剂处理，除此之外，与实施例7同样地进行iPS细胞的培养。将其结果的一例示于图17。
实施例7中，可以确认通过HA处理后的移液导致的细胞团块的分割和通过其后的培养导致的细胞团块的再凝集。如图17所示，实施例6及对照均确认了从培养开始24h后活细胞浓度增加、迅速增殖，但在培养开始144h附近，增殖速度平稳地减少，就不进行HA处理的对照而言，在144h以后，增殖(活细胞浓度的增加)变慢，在168h以后，活细胞浓度在1.5×106个细胞/ml附近，几乎不能确认增殖。另一方面，在培养开始144h后进行了HA处理的实施例6，暂时降低了的增殖速度再次恢复，在144h以后也确认细胞的增殖。另外，在培养开始192h后，进行第二次HA处理，结果可确认缓慢的增殖速度的恢复，实施例6中，培养216h后的最终的活细胞浓度为3.36×106个细胞/ml(对照为1.68×106个细胞/ml)。由以上得知：利用了基于HA处理的细胞分割操作法的培养法与通常的传代培养法相比，维持细胞增殖能力，可以进行iPS细胞的高密度培养。
(实施例8)
[A型变异型HA复合体给iPS细胞带来的影响]
制作下述表4所示的A型野生型HA复合体及A型变异型HA复合体。这些HA复合体基于T.Matsumura et al.,Nature Communications 2015 Feb 17；6:6255.doi:10.1038/ncomms7255而制作。予以说明，作为质粒制作时的各亚成分的蛋白质，HA1使用在C末端结合有FLAG标签的重组蛋白，HA2使用在N末端结合有FLAG标签的重组蛋白，HA3使用在N末端结合有Strep标签的重组蛋白。
[表4]
在饲养细胞上播种iPS细胞(day0)，每24小时用维持培养基进行培养基交换。在3天后(day3)，添加HA复合体(A型野生型HA复合体或A型变异型HA复合体)，孵育24小时，用PBS清洗2次，用维持培养基进行培养基交换(day4)。其后，每24小时用维持培养基进行培养基交换，至7天后(day7)。使用的细胞、培养基及培养条件如下所述。
[细胞]
iPS细胞：Tic(将用MEF维持的Tic进行传代并播种在SNL细胞上的细胞，NP13)
饲养细胞：SNL
[培养基]
iPS细胞：Repro Stem(商品名，ReproCELL公司制)、5ng/mLbFGF(ReproCELL公司制)
饲养细胞：DMEM(Sigma公司制)(7％FBS(GIBCO公司制)，1％Penicillin-streptomycin solution(NACALAI TESQUE公司制))
[容器]
12孔板(培养面积：3.8cm2/孔，Corning公司制)
[HA制备、添加方法]
在培养基(Repro Stem)中加入bFGF(终浓度5ng/ml)，准备稀释培养基。将上述表4所示的A型变异型HA复合体2～4使用稀释培养基进行稀释(终浓度：100nM)，将其添加于孔中。
[培养条件]
37℃、5％CO2气氛下
iPS细胞传代后，在3天后(day3)的培养基交换中，添加HA复合体，培养24小时。其后，在4天后(day4)的培养基交换中，更换为不添加HA复合体的培养基，继续进行培养。
[观察]
在day3、day4、day5及day7，用IN Cell Analyzer 2000(商品名，GE卫生保健生物科学公司制)观察培养细胞，取得图像。以倍数4倍进行拍摄。将得到的显微镜观察照片示于图18及19。图18～20中，将在上图中用实线包围的部分示于下图。
图18表示A型变异型HA复合体2(HA3 R528A)的显微镜照片，以及图19表示A型变异型HA复合体3(HA1 N285A/HA3 R528A)的显微镜照片。
作为比较例3，使用作为钙粘着蛋白结合活性消失变异体的A型变异型HA复合体4(HA3 K607A)，除此之外，与上述实施例同样地操作，进行iPS细胞的培养。作为对照，除不添加HA复合体以外，与实施例同样地操作，进行iPS细胞的培养。将得到的显微镜观察照片分别示于图20及21。
如图18及19所示，在使糖链结合活性缺失的任一种A型变异型HA复合体2及3中，自A型变异型HA复合体添加24小时后(day3)，集落中心的未分化逸脱细胞的细胞间粘附变得松弛，可以确认未分化逸脱细胞的细胞间粘附的抑制，同时确认细胞的剥离。特别是确认了：A型变异型HA复合体3(HA1 N285A/HA3 R528A)，与A型野生型HA复合体及A型变异型HA复合体2相比，细胞剥离的效果高。另一方面，不添加HA复合体的对照及作为钙粘着蛋白结合活性消失变异体的比较例3的变异型HA复合体4(HA3 K607A)，不能确认细胞间粘附的抑制及细胞的剥离(图20及21)。因此表明：通过使糖链结合活性缺失的A型变异型HA复合体2及3，可以进行局部的细胞-细胞间粘附的抑制，同时可以进行有效的未分化逸脱细胞的剥离。
(实施例9)
[A型变异型HA复合体给iPS细胞团块带来的影响]
在非粘附性培养容器60mm皿(Thermo：Nunclon Sphere)中播种iPS细胞(4.2×106个细胞/60mm皿)，进行培养，制作iPS细胞团块。每天进行培养基交换，至培养第4天(day4)。在培养第4天(day4)，将iPS细胞团块移至24孔板，拍摄HA添加前的照片之后，添加HA复合体(终浓度：40nM)。自HA添加6、12、18或24小时后，进行移液，在移液前后观察细胞团块，同时进行细胞团块是否分割的确认。移液后，进一步进行培养24小时，进行细胞团块的观察。使用的细胞、培养基、HA复合体及培养条件等如下所述。另外，A型野生型HA复合体及A型变异型HA复合体使用与实施例8中制作的物质同样的物质。
[细胞]
人iPS细胞(Tic(用iMatrix-511(nippi)维持的iPS细胞、NP19))
[培养基]
mTeSR1(STEMCELL Technologies)
[HA]
A型野生型HA复合体
A型变异型HA复合体1(HA1 N285A)
A型变异型HA复合体2(HA3 R528A)
A型变异型HA复合体3(HA1 N285A/HA3 R528A)
A型变异型HA复合体4(HA3 K607A)
[HA制备、添加方法]
将用PBS对HA复合体进行逐级稀释、进而使用培养基(mTeSR1)进行了稀释的物质(终浓度：100nM)添加于孔中。
[培养条件]
37℃、5％CO2气氛下
[观察]
对全视野使用In Cell Aanalyzer(商品名，GE卫生保健生物科学公司制)观察细胞团块。
作为对照，除不添加HA复合体以外，与上述同样地进行。
将以上的结果示于下述表5。
[表5]
[评价基准]
：可以将细胞团块分割成更小的块
◎：可以分割细胞团块
△：几乎不能确认细胞团块的分割
×：细胞团块没有分割
A型野生型复合体可以以与B型野生型HA复合体及B型变异型HA复合体1～3同样的水平将细胞团块进行分解。就A型变异型HA复合体1～3而言，在相同的浓度条件中进行的情况下，与A型野生型复合体、B型野生型HA复合体及B型变异型HA复合体1～3相比，可以分割成更小的块。另一方面，作为钙粘着蛋白结合活性消失变异体的比较例1的变异型HA复合体4(HA3 K607A)的添加中，几乎没有看到细胞团块的分割，在对照(HA复合体未添加)中，细胞团块没有进行分割。
序列号1：源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素的亚成分HA1
序列号2：源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素的亚成分HA2
序列号3：源自B型肉毒杆菌的野生型血凝素的亚成分HA3
序列号4：B型变异型HA1(HA1N286A)
序列号5：B型变异型HA3(HA3R528A)
序列号6：B型变异型HA3X(HA3K607A)
序列号7：FLAG标签
序列号8：Strep标签
序列号9～14：引物
序列号15：D4标签
序列号16：源自A型肉毒杆菌的野生型血凝素的亚成分HA1
序列号17：源自A型肉毒杆菌的野生型血凝素的亚成分HA2
序列号18：源自A型肉毒杆菌的野生型血凝素的亚成分HA3
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人大阪大学
<120> 变异型血凝素复合体蛋白、以及使用其的具有多能性的干细胞的培养方法
<130> H4322_G20150018
<150> JP2014-133364
<151> 2014-06-27
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 294
<212> PRT
<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 1
Met Glu His Tyr Ser Thr Ile Gln Asn Ser Leu Asn Asp Lys Ile Val
1 5 10 15
Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Thr Asp Leu Phe Phe Tyr Gln Val Pro
20 25 30
Gly Asn Gly Asn Val Ser Leu Phe Gln Gln Thr Arg Asn Tyr Leu Glu
35 40 45
Arg Trp Arg Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Ala Ala Tyr Lys Ile Lys
50 55 60
Ser Met Asn Ile Tyr Asn Thr Asn Leu Val Leu Thr Trp Asn Ala Pro
65 70 75 80
Thr His Asn Ile Ser Ala Gln Gln Asp Ser Asn Ala Asp Asn Gln Tyr
85 90 95
Trp Leu Leu Leu Lys Asp Ile Gly Asn Asn Ser Phe Ile Ile Ala Ser
100 105 110
Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asp Thr Val Ala Arg Asn
115 120 125
Leu Lys Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Ser Tyr Ile Lys Phe Ile Ile
130 135 140
Glu Asp Tyr Val Ile Ser Asp Phe Lys Asn Phe Thr Cys Arg Ile Ser
145 150 155 160
Pro Ile Leu Ala Gly Gly Lys Val Val Gln Gln Val Ser Met Thr Asn
165 170 175
Leu Ala Val Asn Leu Tyr Ile Trp Asn Asn Asp Leu Asn Gln Lys Trp
180 185 190
Thr Ile Ile Tyr Asn Glu Glu Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Phe Asn Lys
195 200 205
Ile Leu Ser Asn Gly Val Leu Thr Trp Ile Phe Ser Asp Gly Asn Thr
210 215 220
Val Arg Val Ser Ser Ser Ala Gln Asn Asn Asp Ala Gln Tyr Trp Leu
225 230 235 240
Ile Asn Pro Val Ser Asp Asn Tyr Asp Arg Tyr Thr Ile Thr Asn Leu
245 250 255
Arg Asp Lys Thr Lys Val Leu Asp Leu Tyr Gly Gly Gln Thr Ala Asp
260 265 270
Gly Thr Thr Ile Gln Val Phe Asn Ser Asn Gly Gly Asp Asn Gln Ile
275 280 285
Trp Thr Met Ser Asn Pro
290
<210> 2
<211> 146
<212> PRT
<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 2
Met Ser Ala Glu Arg Thr Phe Leu Pro Asn Gly Asn Tyr Asn Ile Lys
1 5 10 15
Ser Ile Phe Ser Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Pro Val Ser Gly Ser Leu
20 25 30
Thr Phe Ser Asn Glu Ser Ser Ala Asn Asn Gln Lys Trp Asn Val Glu
35 40 45
Tyr Met Ala Glu Asn Arg Cys Phe Lys Ile Ser Asn Val Ala Glu Pro
50 55 60
Asn Lys Tyr Leu Ser Tyr Asp Asn Phe Gly Phe Ile Ser Leu Asp Ser
65 70 75 80
Leu Ser Asn Arg Cys Tyr Trp Phe Pro Ile Lys Ile Ala Val Asn Thr
85 90 95
Tyr Ile Met Leu Ser Leu Asn Lys Val Asn Glu Leu Asp Tyr Ala Trp
100 105 110
Asp Ile Tyr Asp Thr Asn Glu Asn Ile Leu Ser Gln Pro Leu Leu Leu
115 120 125
Leu Pro Asn Phe Asp Ile Tyr Asn Ser Asn Gln Met Phe Lys Leu Glu
130 135 140
Lys Ile
145
<210> 3
<211> 626
<212> PRT
<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 3
Met Asn Ser Ser Ile Lys Lys Ile Tyr Asn His Ile Gln Glu Lys Val
1 5 10 15
Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val
20 25 30
Ser Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly
35 40 45
Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg
50 55 60
Val Asn Asp Asn Ala Ile Pro Tyr Tyr Tyr Pro Thr Pro Ser Phe Asn
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Ile Gln Thr Val Phe Ala Asn Phe Thr
85 90 95
Glu Ala Asn Gln Ile Pro Ile Gly Phe Glu Phe Ser Lys Thr Ala Pro
100 105 110
Ser Asn Lys Asn Leu Tyr Met Tyr Leu Gln Tyr Thr Tyr Ile Arg Tyr
115 120 125
Glu Ile Ile Lys Val Leu Gln His Glu Ile Ile Glu Arg Ala Val Leu
130 135 140
Tyr Val Pro Ser Leu Gly Tyr Val Lys Ser Ile Glu Phe Asn Pro Gly
145 150 155 160
Glu Lys Ile Asn Lys Asp Phe Tyr Phe Leu Thr Asn Asp Lys Cys Ile
165 170 175
Leu Asn Glu Gln Phe Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Thr Thr Lys Asn
180 185 190
Ile Pro Thr Asn Asn Ile Phe Asn Ser Lys Val Ser Ser Thr Gln Arg
195 200 205
Val Leu Pro Tyr Ser Asn Gly Leu Tyr Val Ile Asn Lys Gly Asp Gly
210 215 220
Tyr Ile Arg Thr Asn Asp Lys Asp Leu Ile Gly Thr Leu Leu Ile Glu
225 230 235 240
Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ile Gln Pro Arg Leu Arg Asn Thr Thr
245 250 255
Arg Pro Leu Phe Thr Thr Ser Asn Asp Ala Lys Phe Ser Gln Gln Tyr
260 265 270
Thr Glu Glu Arg Leu Lys Asp Ala Phe Asn Val Gln Leu Phe Asn Thr
275 280 285
Ser Thr Ser Leu Phe Lys Phe Val Glu Glu Ala Pro Ser Asn Lys Asn
290 295 300
Ile Cys Ile Lys Ala Tyr Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Glu Leu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Val Asn Lys Ala Glu Tyr Tyr Leu Pro Ser
325 330 335
Leu Gly Tyr Cys Glu Val Thr Asn Ala Pro Ser Pro Glu Ser Glu Val
340 345 350
Val Lys Thr Gln Val Ala Glu Asp Gly Phe Ile Gln Asn Gly Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Val Val Gly Val Ile Asp Pro Ser Glu Asn Ile Gln Glu
370 375 380
Ile Asn Thr Ala Ile Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Gly Ile
385 390 395 400
Val Asn Asn Asn Pro Phe Tyr Ile Leu Phe Thr Val Asn Thr Thr Gly
405 410 415
Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gln Asn Asn Leu Pro Ser Leu Lys Ile Tyr
420 425 430
Glu Ala Ile Gly Ser Gly Asn Arg Asn Phe Gln Ser Gly Asn Leu Cys
435 440 445
Asp Asp Asp Ile Lys Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Phe Asp Ser Pro
450 455 460
Asn Ala Lys Ser Tyr Leu Val Val Leu Leu Asn Lys Asp Lys Asn Tyr
465 470 475 480
Tyr Ile Arg Val Pro Gln Thr Ser Ser Asn Ile Glu Asn Gln Ile Lys
485 490 495
Phe Lys Arg Glu Glu Gly Asp Leu Arg Asn Leu Met Asn Ser Ser Val
500 505 510
Asn Ile Ile Asp Asn Leu Asn Ser Thr Gly Ala His Tyr Tyr Thr Arg
515 520 525
Gln Ser Pro Asp Val His Asp Tyr Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Ile Pro
530 535 540
Gly Asn Phe Asn Asn Lys Asp Thr Ser Asn Ile Arg Leu Tyr Thr Ser
545 550 555 560
Tyr Asn Gln Gly Ile Gly Thr Leu Phe Arg Val Thr Glu Thr Ile Asp
565 570 575
Gly Tyr Asn Leu Ile Asn Ile Gln Gln Asn Leu Asn Leu Leu Asn Ser
580 585 590
Thr Lys Ser Ile Arg Leu Leu Asn Gly Ala Ile Tyr Ile Leu Lys Val
595 600 605
Glu Val Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Asn Ile Lys Leu His Ile Asp Ile
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Thr Asn
625
<210> 4
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA1 N286A
<400> 4
Met Glu His Tyr Ser Thr Ile Gln Asn Ser Leu Asn Asp Lys Ile Val
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Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Thr Asp Leu Phe Phe Tyr Gln Val Pro
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Gly Asn Gly Asn Val Ser Leu Phe Gln Gln Thr Arg Asn Tyr Leu Glu
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Arg Trp Arg Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Ala Ala Tyr Lys Ile Lys
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Trp Leu Leu Leu Lys Asp Ile Gly Asn Asn Ser Phe Ile Ile Ala Ser
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Leu Lys Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Ser Tyr Ile Lys Phe Ile Ile
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Glu Asp Tyr Val Ile Ser Asp Phe Lys Asn Phe Thr Cys Arg Ile Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> HA3 R528A
<400> 5
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Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val
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Ser Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly
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Ser Asn Lys Asn Leu Tyr Met Tyr Leu Gln Tyr Thr Tyr Ile Arg Tyr
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Glu Ile Ile Lys Val Leu Gln His Glu Ile Ile Glu Arg Ala Val Leu
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Leu Asn Glu Gln Phe Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Thr Thr Lys Asn
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195 200 205
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Tyr Ile Arg Thr Asn Asp Lys Asp Leu Ile Gly Thr Leu Leu Ile Glu
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Thr Glu Glu Arg Leu Lys Asp Ala Phe Asn Val Gln Leu Phe Asn Thr
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Ser Thr Ser Leu Phe Lys Phe Val Glu Glu Ala Pro Ser Asn Lys Asn
290 295 300
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<220>
<223> HA3 K607A
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Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg
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<212> DNA
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cgtgtcgact taattagtaa tatctatatg c 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 15
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1
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<212> PRT
<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 16
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Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Asn Tyr Ile Lys Phe Ile Ile Glu Asp
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Tyr Ile Ile Ser Asp Leu Asn Asn Phe Thr Cys Lys Ile Ser Pro Ile
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<210> 17
<211> 146
<212> PRT
<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 17
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Lys Ile
145
<210> 18
<211> 626
<212> PRT
<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 18
Met Asn Ser Ser Ile Lys Lys Ile Tyr Asn Asp Ile Gln Glu Lys Val
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Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val
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Arg Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly
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625
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