用于肿瘤治疗之方法及抗体组成物与流程

本发明系关于双特异性抗体、靶向CD20和CD3抗原及杀死肿瘤之方法。本发明亦关于降低及/或控制可由与肿瘤治疗之抗体疗法有关之Fc结合所产生的效应子功能。

【先前技术】

双靶向抗体策略已应用于其中多因素调节系瞄准改善治疗效用的复合疾病。CD20为一表现在成熟B细胞之细胞膜上的非糖基化磷蛋白。CD20被视为B-细胞肿瘤相关抗原，因为有超过95％的B-细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和其他B-细胞恶性肿瘤表现CD20，但其在B-细胞前体、树突细胞和浆细胞中则无。以CD20为标靶之治疗癌症的方法已为本项技术所知。例如，嵌合的抗-CD20单株抗体利妥昔单抗(rituximab)已用于或建议用于治疗癌症，例如NHL、慢性淋巴性白血病(CLL)和小淋巴性淋巴瘤(SLL)。咸信抗-CD20抗体系藉由补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖的细胞媒介细胞毒性(ADCC)及/或引发细胞凋亡和对化学治疗的敏感性，杀死CD20-表现的肿瘤细胞，虽然某些病患已显示对抗-CD20治疗发生阻抗性或出现不完全反应(例如，对利妥昔单抗具抗性)。

CD3为一表现在与T细胞受体复合物(TCR)有关之T细胞上的同源二聚性或异源二聚性抗原，且为T细胞活化所需。功能性CD3系由四条不同链中的二条链二聚结合所形成：ε、ζ、δ和γ。能与CD3和目标抗原，例如CD20结合之双特异性抗体己被提出作为涉及针对组织和表现目标抗原细胞之T细胞免疫反应的治疗用途。

具有CD20-及结合臂和CD3-结合臂之双特异性抗体可提供增大抗肿瘤活性之必须的相互干扰(crosstalk)。在此双特异性抗体中的第三形式为Fc区。修改Fc结合性质可进一步增大治疗性抗体的抗肿瘤效力。

免疫球蛋白Fc区与其受体的结合产生了各种讯号传递及免疫反应。这些各种的「效应子功能」，例如CDC和ADCC，为G类(IgGs)免疫球蛋白在IgG的Fab区和目标抗原之间形成一复合物之结果，然而IgG的Fc区系在效应子细胞上与Fc受体结合。某些IgG的效应子功能系与抗原结合无关并包括例如循环血清量和转移Ig跨过屏障之能力的功能其他的效应子功能被视为用于免疫球蛋白治疗，例如癌症治疗所必须。特别是ADCC机制被视为市面上治疗性抗体，例如曲妥珠单抗(rastuzumab)(转移性乳癌)和利妥昔单抗(非何杰金氏淋巴瘤)之主要的抗肿瘤机制之一。

目前的治疗策略典型地系建议，降低效应子功能(或降低Fcγ受体结合)对于其目标为中和或抑制抗原之生物活性(例如抗体阻断剂或拮抗剂)，或活化或触发下游细胞讯号传递(例如抗体促效剂)的抗体可能为有用的。然而，具有降低的效应子功能之肿瘤靶向抗体的设计为违反直觉的，因为预料中降低标靶细胞的细胞毒性对于治疗疾病，亦即破坏肿瘤细胞或抑制肿瘤生长将不会有功效。

文中所描述的一策略系利用分化的Fc受体结合与双特异性抗原特异性结合标靶肿瘤标记组合，以及触发肿瘤-特异性T细胞致死。抗体的Fc区系设计用以小心控制Fc受体结合，以消除或降低细胞，如带有Fc受体之T细胞、中性杀手细胞和巨噬细胞之不欲的死亡。有关包括FcγRII受体结合相互作用，但缺乏FcγRI或FcγRIII相互作用之Fc受体相互作用的独特结合模式以描述于本项技术中供肿瘤-靶向的Ig治疗。

因此，具有降低与Fc受体结合之双特异性B细胞和T细胞靶向抗体的组合产生意想不到的有利治疗性质。与CD3和CD20二者结合之双特异性抗体特别可用于其中控制以特异性CD20为标靶及有效细胞毒性为所希望之临床状况。

技术实现要素：

在第一方面，本发明系提供结合人类CD3和CD20之具有改变的Fc结合区的双特异性抗体。根据本发明此方面之抗体可用于，其中包括，以表现CD3之T细胞为标靶，及用于刺激T细胞活化，例如于其中T细胞媒介的毒杀就针对特定细胞类型，例如抗-CD20肿瘤细胞之CD3-媒介T细胞活化的部分双特异性抗体为有利或所欲的之情况。此等抗体系进一步经工程化，以具有在免疫系统的天然库中未发现之特定效应子功能。

本发明之例示性抗-CD3/CD20抗体系列于文中的表1至表8中。表1系列出例示的双特异性抗体之重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)之氨基酸序列标识符。表2系列出编码例示的双特异性抗体之HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸分子之序列标识符组合。表3系列出包括HCVR、重链恒定区(CH)和LCVR组合之例示双特异性抗体的氨基酸序列标识符。表4系列出编码例示双特异性抗体之HCVR、重链恒定区(CH)和LCVR组合的核酸分子之核酸序列辨识码组合。

表5系描述本发明之重链实例的氨基酸序列辨识码，其中此双特异性抗体系包括一HCVR，而该HCVR系包含与本发明CH配对之表5的HCDR1、HCDR2和HCDR3。表6个别地系描述本发明之轻链实例的氨基酸序列辨识码，其中此双特异性抗体系包括一包含表6之LCDR1、LCDR2和LCDR3的LCVR。

本发明系提供包括一HCVR之抗体或其抗原结合片段，而该HCVR系包括一由表1所列的HCVR氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之实质上其类似序列。

本发明亦提供包括一LCVR之抗体或其抗原结合片段，而该LCVR系包括一由表1所列的LCVR氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之实质上其类似序列。

本发明亦提供包括一HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)之抗体或其抗原结合片段，而该HCVR和LCVR氨基酸序列对系包括一包含在表1所列的例示抗-CD3/CD20抗体中之氨基酸序列对。在特定的实施例，此HCVR/LCVR氨基酸序列对系由下列组成之群中选出：SEQ ID NO：2/18和10/18(例如，抗体1和抗体2)。

本发明亦提供包括一重链CDR1(HCDR1)之抗体或其抗原结合片段，而该重链CDR1系包括一由表1所列的HCDR1氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供包括一重链CDR2(HCDR2)之抗体或其抗原结合片段，而该重链CDR2系包括一由表1所列的HCDR2氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供包括一重链CDR3(HCDR3)之抗体或其抗原结合片段，而该重链CDR3系包括一由表1所列的HCDR3氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供包括一轻链CDR1(LCDR1)之抗体或其抗原结合片段，而该轻链CDR1系包括一由表1所列的LCDR1氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供包括一轻链CDR2(LCDR2)之抗体或其抗原结合片段，而该轻链CDR2系包括一由表1所列的LCDR2氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供包括一轻链CDR3(LCDR3)之抗体或其抗原结合片段，而该轻链CDR3系包括一由表1所列的LCDR3氨基酸序列中选出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供包括一HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)之抗体或其抗原结合片段，而该HCDR3和LCDR3氨基酸序列对系包括表1所列的HCDR3氨基酸序列与表1所列的任何LCDR3氨基酸序列配对，例如，由SEQ ID NO：8/16(例如，抗体1或抗体2)组成之群中选出的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。

本发明亦提供包括一组六个包含在表1中之CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施例中，此HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组为SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24；或12-14-16-20-22-24(例如，抗体1或抗体2)。

在一相关的实施例中，本发明系提供包括一组六个包含在如表1所列的例示性抗体所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对中之CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段。例如，本发明系包括含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组之抗体或其抗原结合片段，而该氨基酸序列组系包含在由SEQ ID NO:2/18(例如，抗体1或抗体2)组成之群中选出的HCVR/LCVR氨基酸序列对中。用于辨识HCVR和LCVR氨基酸序列中之CDR的方法和技术已为本项技术所熟知并可用于鉴别文中所揭示的特定HCVR及/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴别CDR界限之例示性习用法包括，例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义系以序列变异性为基准，Chothia定义系以结构环区域之位置为基准，而AbM定义为介于Kabat和Chothia法之折衷。参见，例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；及Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。亦可取得公开的数据库用以鉴别抗体内的CDR序列。

本发明亦提供编码抗体或其部分之核酸分子。例如，本发明系提供编码表1中所列的HCVR或LCVR氨基酸序列之核酸分子；在特定的实施例中，此核酸分子系包括由表2所列的HCVR/LCVR核酸序列中选出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供编码表1中所列的HCDR1或HCDR2或HCDR3氨基酸序列之核酸分子；在特定的实施例中，此核酸分子系包括由表2所列的HCDR1或HCDR2或HCDR3核酸序列中选出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供编码表1中所列的LCDR1或LCDR2或LCDR3氨基酸序列之核酸分子；在特定的实施例中，此核酸分子系包括由表2所列的LCDR1或LCDR2或LCDR3核酸序列中选出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供编码HCVR之核酸分子，其中该HCVR系包括一组三个CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中该HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组系如表1所列的例示性抗-CD3抗体所定义。

本发明亦提供编码LCVR之核酸分子，其中该LCVR系包括一组三个CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中该LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组系如表1所列的例示性抗-CD3抗体所定义。

本发明亦提供编码HCVR和LCVR二者之核酸分子，其中此HCVR系包括一表1中所列的HCVR氨基酸序列之氨基酸序列，及其中此LCVR系包括一表1中所列的LCVR氨基酸序列之氨基酸序列。在特定的实施例中，此核酸分子系包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中选出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之实质上其类似的序列，及由表2所列的LCVR核酸序列中选出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之实质上其类似的序列。在根据本发明此方面之特定的实施例中，此核酸分子系编码HCVR和LCVR，其中该HCVR和LCVR二者系衍生自表1中所列的相同抗-CD3抗体。

本发明亦提供包括重链恒定区(CH)之抗体或其抗原结合片段，而该重链恒定区(CH)系包括一选自表2所列的CH氨基酸序列之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供包括一重链恒定区(CH)之抗体或其抗原结合片段，而该重链恒定区(CH)系由选自表2所列的CH核酸序列之核酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列所编码。

本发明亦提供能表现包括抗-CD3抗体之重链或轻链可变区及抗-CD20抗体之重链或轻链可变区之多肽的重组表现载体。例如，本发明系包括重组的表现载体，该载体系包括任何上文所提之核酸分子，亦即编码表1和表2中所列的任何HCVR、LCVR及/或CDR序列，及/或CH序列之核酸分子。本发明之范围亦包括已导入此等载体之宿主细胞，以及藉由在得以产生抗体和抗体片段之条件下培养宿主细胞，并回收所产生的抗体和抗体片段来制造抗体或其部分之方法。

在另一方面，本发明系提供一治疗上有效量之专一与CD3和CD20结合的重组人类抗体或其片段，其中该抗体系包括一嵌合的Fc区及一医药上可接受载剂。在一相关的方面，本发明之特征为组合抗-CD3/CD20抗体和第二治疗剂之组成物。在一实施例中，此第二治疗剂为任何有利地与抗-CD3/CD20抗体组合之试剂。可有利地与抗-CD3/CD20抗体组合之例示性试剂包括(不限于)结合及/或活化CD3讯号之其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段等)，及/或不直接与CD3结合然而却活化或刺激免疫细胞活化作用，或增进肿瘤死亡之试剂。涉及本发明抗-CD3抗体之另外的组合治疗及共调配物系揭示于文中的他处。

根据另外的方面，本发明系提供与CD3和一目标抗原结合之双特异性抗原-结合分子，其中该分子系包括一如文中所述的嵌合Fc区。根据特定的例示性实施例，此双特异性抗原-结合分子系与CD3和CD20结合；此等双特异性抗原-结合分子在文中亦称为「抗-CD3/抗-CD20双特异性分子」。抗-CD3/抗-CD20双特异性分子之抗-CD20部分系用于以表现CD20之肿瘤细胞(例如B-细胞肿瘤)为标靶，而双特异性分子之抗-CD3部分系用于活化T-细胞。同时结合肿瘤细胞上的CD20和T-细胞上的CD3，藉由活化的T-细胞和结合嵌合Fc区之效应子细胞的帮助，媒介了定向性杀死标靶的肿瘤细胞(细胞裂解)。本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性分子因此可用于，其中包括，治疗与CD20-表现肿瘤或由其造成的疾病和病症(例如淋巴瘤和黑色素瘤肿瘤)。

本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性分子进一步系提供消退CD20-阳性肿瘤之方法。本发明因此系于一患者中提供治疗B细胞癌症之方法，此方法系包括投予一治疗上有效量之本发明抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中该量系足以在患者中降低肿瘤负荷，产生肿瘤消退或降低肿瘤发展。

本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性分子进一步系提供抑制或消退CD20-阳性(亦即CD20-表现)黑色素瘤之方法。本发明因此系于一患者中提供治疗CD20-阳性黑色素瘤之方法，此方法系包括投予一治疗上有效量之本发明抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中该量系足以在患者中抑制肿瘤生长，降低肿瘤负荷或降低肿瘤发展。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中治疗或改善癌症之用途，其中该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区，而此治疗或改善癌症系包括：(a)于患者中抑制肿瘤生长，(b)于患者中媒介B-系胞裂解，(c)于患者中治疗B-细胞癌症，(d)于患者中治疗CD20表现为阳性的癌症，或(e)于患者中治疗CD20-表现的黑色瘤癌症。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中抑制肿瘤生长之用途，其中该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区。在某些案例中，抑制肿瘤生长系包括：(a)于患者中抑制肿瘤生长，(b)于患者中降低肿瘤大小，或(c)于患者中降低肿瘤数目。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中媒介B-细胞裂解之用途，其中该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区。在某些案例中，此B-细胞为前-B淋巴细胞、成熟的B-淋巴细胞，或B-细胞非何杰金氏淋巴癌细胞。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中治疗B-细胞癌症之用途，其中该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区。在某些情况下，此B-细胞癌症系由下列组成之群中选出：滤泡型淋巴癌、B-细胞慢性淋巴性白血病、B-细胞淋巴母细胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、弥漫型大B细胞淋巴癌、边缘区淋巴癌、被套细胞淋巴癌、发样细胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，该患者系患有对(a)单独的抗-CD20单特异性治疗，或(b)利妥昔单抗单一治疗具抗性或不完全反应之肿瘤。在某些案例中，该患者在投予双特异性抗体之前，系接受一抗-CD20单特异性抗体治疗至少1天至1年。在某些案例中，此抗-CD20单特异性治疗系包括或由抗-CD20单特异性抗体所组成。在某些案例中，此抗-CD20单特异性抗体为利妥昔单抗(rituximab)。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中治疗B-细胞癌症之用途，其系包括：(a)选择患有对单独的抗-CD20单特异性治疗具抗性或不完全反应之癌症的患者；及(b)投予该患者一治疗量的双特异性抗体，而该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区。

在某些案例中，此患者系以具有对抗-CD20单特异性治疗具阻抗性、难以治疗或不完全反应之肿瘤为基准作选择。在某些案例中，此抗-CD20单特异性治疗系包括或由一抗-CD20单特异性抗体所组成。在某些案例中，此抗-CD20单特异性抗体为利妥昔单抗。在某些案例中，此B-细胞癌为淋巴癌。在某些案例中，此淋巴癌为非何杰金氏淋巴癌(NHL)。在某些案例中，此B-细胞癌为慢性淋巴性白血病(CLL)。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中治疗B-细胞癌症之用途，其中该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区，且其中该双特异性抗体系以足以于患者中降低肿瘤负荷，产生肿瘤消退、抑制肿瘤生长或降低肿瘤发展之量来给药。

在某些案例中，此B-细胞癌症系由下列组成之群中选出：滤泡型淋巴癌、B-细胞慢性淋巴性白血病、B-细胞淋巴母细胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、弥漫型大B细胞淋巴癌、边缘区淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤、发样细胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，该患者系患有对单独的抗-CD20单特异性治疗具阻抗性或不完全反应之肿瘤。在某些案例中，该患者系患有对利妥昔单抗单一治疗具阻抗性或不完全反应之肿瘤。在某些案例中，该患者在投予双特异性抗体之前，已接受一抗-CD20单特异性抗体治疗至少1天至1年。在某些案例中，此抗-CD20单特异性治疗系包括或由一抗-CD20单特异性抗体所组成。在某些案例中，此抗-CD20单特异性抗体为利妥昔单抗。在某些案例中，足以于患者中降低肿瘤负荷、产生肿瘤消退、抑制肿瘤生长或降低肿瘤发展之量系介于约0.001mg/kg至约1mg/kg。在某些案例中，足以于患者中降低肿瘤负荷、产生肿瘤消退或降低肿瘤发展之量为约0.4mg/kg。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中治疗CD20表现为阳性之癌症的用途，其系包括：(a)选择患有癌症及/或肿瘤之患者；及(b)从患者中收集一或多个生物样本；(c)鉴定一或多个样本中CD20-表现癌症或肿瘤；及(d)投予该患者一治疗量之双特异性抗体，而该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区。

在某些案例中，此患者系以具有对抗-CD20治疗具阻抗性、难以治疗或不完全反应之癌症或肿瘤为基准作选择。在某些案例中，此患者系以具有残存癌症为基准作选择。在某些案例中，此抗-CD20单特异性治疗系包括或由一抗-CD20单特异性抗体所组成。在某些案例中，此抗-CD20单特异性抗体为利妥昔单抗。在某些案例中，此癌症为淋巴癌或白血病。在某些案例中，此淋巴癌系由下列组成之群中选出：滤泡型淋巴癌、B-细胞淋巴母细胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、弥漫型大B细胞淋巴癌、边缘区淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤、发样细胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，此白血病为B-细胞慢性淋巴性白血病(CLL)。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体用于患者中治疗CD20-表现黑色素癌之用途，其系包括投予一治疗量之双特异性抗体，而该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区，其中此量系以足以于患者中降低肿瘤负荷、抑制肿瘤生长或降低肿瘤发展。

根据本发明之双特异性抗原结合分子系包括一专一结合人类CD3之第一抗原结合区，一专一结合CD20之第二抗原结合区，以及一嵌合的Fc区。本发明系包括抗-CD3/抗-CD20双特异性分子(例如，双特异性抗体)其中各抗原结合区系包括一重链可变区(HCVR)与轻链可变区(LCVR)配对。在本发明特定的例示性实施例中，抗-CD3抗原结合区和抗-CD20抗原结合区各包括不同、有区别、与共同LCVR配对之HCVR。例如，如文中实例2所示，建构双特异性抗体系包括专一结合CD3之第一抗原结合区，其中该第一抗原结合区系包括衍生自抗-CD3抗体之HCVR/LCVR对；及专一结合CD20之第二抗原结合区，其中该第二抗原结合区系包括衍生自抗-CD20抗体之HCVR与衍生自抗-CD3抗体之LCVR配对(例如，包括在抗-CD3抗原结合区内的相同LCVR)。换言之，在文中所揭示的例示性分子中，来自抗-CD20抗体之HCVR与来自抗-CD3抗体之LCVR的配对，产生专一结合CD20之抗原结合区(但不与CD3结合)。在此等实施例中，第一和第二抗原结合区系包括不同的抗-CD3和抗-CD20HCVR，但享有共同的抗-CD3LCVR。

本发明系提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中专一结合CD3之第一抗原结合区系包括表1或表2中所列的任何HCVR氨基酸序列。专一结合CD3之第一抗原结合区亦包括表1或表2中所列的任何LCVR氨基酸序列。根据特定的实施例，专一结合CD3之第一抗原结合区系包括表1或表2中所列的任何HCVR/LCVR氨基酸序列对。本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中专一结合CD3之第一抗原结合区系包括如表1或表2中所列的任何重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列，及/或如表1或表2中所列的任何轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列。

根据特定的实施例，本发明系提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中该专一结合CD3之第一抗原结合区系包括一重链可变区(HCVR)，其具有一包括SEQ ID NO:10之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中专一结合CD3之第一抗原结合区系包括一轻链可变区(LCVR)，其具有一包括SEQ ID NO:18之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中专一结合CD3之第一抗原结合区系包括一由SEQ ID NO：10/18组成之群中选出的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中专一结合CD3之第一抗原结合区系包括一重链CDR3(HCDR3)区，其具有一包括SEQ ID NO:16之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；及一轻链CDR3(LCDR3)区，其具有一包括SEQ ID NO:24之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

在特定的实施例中，此专一结合CD3之第一抗原结合区系包括一包含SEQ ID NO：16/24之HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中该专一结合CD3之第一抗原结合区系包括一重链CDR1(HCDR1)区，其具有一包括SEQ ID NO:12之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；一重链CDR2(HCDR2)区，其具有一包括SEQ ID NO:14之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；一轻链CDR1(LCDR1)区，其具有一包括SEQ ID NO:20之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；及一轻链CDR2(LCDR2)区，其具有一包括SEQ ID NO:22之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明之特定非限定、例示性抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子系包括专一结合CD3之含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3区的第一抗原结合区，其分别具有由下列组成之群中选出之氨基酸序列：SEQ ID NO:12-14-16-20-22-24。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中该专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一重链可变区(HCVR)，其具有SEQ ID NO：2之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中该专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一轻链可变区(LCVR)，其具有SEQ ID NO：18之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中该专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一轻链可变区(LCVR)，其具有SEQ ID NO：75之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一包含SEQ ID NO：2/18或SEQ ID NO:2/75之HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性分子，其中该专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一重链CDR3(HCDR3)区，其具有一SEQ ID NO:8之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；一轻链CDR3(LCDR3)区，其具有一包括SEQ ID NO:24之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

在特定的实施例中，专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一包含SEQ ID NO：8/24之HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中该专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一重链CDR1(HCDR1)区，其具有SEQ ID NO:4之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；一重链CDR2(HCDR2)区，其具有SEQ ID NO:6之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；一轻链CDR1(LCDR1)区，其具有SEQ ID NO:20之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列；及一轻链CDR2(LCDR2)区，其具有SEQ ID NO:22之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之实质上其类似的序列。

本发明之特定非限定、例示性抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子系包括专一结合CD20之含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3区的第二抗原结合区，其分别具有由下列组成之群中选出之氨基酸序列：SEQ ID NO:4-6-8-20-22-24(例如，抗体1或抗体2)。

在一实施例中，本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子系包括一专一结合人类CD3并包括三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2、A1-LCDR3)之第一抗原结合区(A1)，以及一专一结合人类CD20并包括三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)之第二抗原结合区(A2)；其中：(a)A1-HCDR1系包括SEQ ID NO:12之氨基酸序列；(b)A1-HCDR2系包括SEQ ID NO:14之氨基酸序列；(c)A1-HCDR3系包括SEQ ID NO:16之氨基酸序列；(d)A1-LCDR1系包括SEQ ID NO:20之氨基酸序列；(e)A1-LCDR2系包括SEQ ID NO:22之氨基酸序列；(f)A1-LCDR3系包括SEQ ID NO:24之氨基酸序列；(g)A2-HCDR1系包括SEQ ID NO:4之氨基酸序列；(h)A2-HCDR2系包括SEQ ID NO:6之氨基酸序列；(i)A2-HCDR3系包括SEQ ID NO:8之氨基酸序列；(j)A2-LCDR1系包括SEQ ID NO:20之氨基酸序列；(k)A2-LCDR2系包括SEQ ID NO:22之氨基酸序列；及(l)A2-LCDR3系包括SEQ ID NO:24之氨基酸序列。

在一相关的实施例中，本发明系包括抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中专一结合CD20之第二抗原结合区系包括一重链和轻链CDR区，其系包含在SEQ ID NO：2/18之重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)序列内。

在另外方面，本发明系提供编码文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子之任何HCVR、LCVR或CDR序列的核酸分子，其系包括：包含文中表2、7和8中所列之多核苷酸序列的核酸分子，以及包括二或多个如表2、7和8中所列之多核苷酸序列以其任何功能性组合或排列的核酸分子。携带本发明核酸分子之重组的表现载体，和已导入此等载体之宿主细胞亦涵盖在本发明中，以及藉由在得以产生抗体的条件下培养此等宿主细胞，并回收所产生的抗体来制造抗体之方法，亦涵盖在本发明中。

本发明系包括抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中任何专一结合CD3之前述抗原结合区系与任何专一结合CD20之前述抗原结合区组合、相连或另外结合，形成一结合CD3和CD20之双特异性抗原结合分子。

在另外方面，本发明系提供一双特异性抗体，其系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区，以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区。在一相关方面，此双特异性抗体能专一与人类FcγRIIA和人类FcγRIIB结合。本发明系提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其系专一与人类FcγRIIA和人类FcγRIIB结合并显现对人类FcγRI或人类FcγRIII极小或无结合亲和力。在一方面，此双特异性抗体，如活体外分析所测，能以高于结合人类FcγRIIB、人类FcγRI及/或人类FcγRIII之亲和力与专一人类FcγRIIA结合。本发明之双特异性抗体，如活体外分析所测，能以高于此抗体与人类FcγRI或人类FcγRIII结合之亲和力专一与人类FcγRIIA或人类FcγRIIB结合。在某些实施例中，其中与人类FcγRIIA和人类FcγRIIB二者专一结合之抗体，如活体外分析所测，对各人类FcγRI和人类FcγRIII具有低于1μM K_D之结合亲和力。

在其他方面，本发明系提供双特异性抗体，其包括各自包含嵌合Fc区之第一和第二重链多肽，其中该第一重链多肽系包括一结合人类CD3之抗原结合区，及其中该第二重链多肽系包括一结合人类CD20之第二抗原结合区。

在其他的实施例中，如活体外分析所测，此抗体，相对于其结合人类FcγRIIB，系对于人类FcγRIIA具有较高，亦即较强的结合亲和力。又在其他的实施例中，此抗体系与人类FcγRIIA结合且如活体外分析所测，相对于其与人类FcγRIIB之结合，系具有较低的K_D值。在某些实施例中，此抗体系与FcγRIIA结合，如活体外分析所测，在25℃具有介于10至30μM之K_D值。在某些实施例中，此抗体系与FcγRIIB结合，如活体外分析所测，在25℃具有介于100至250μM之K_D值。

在另外的实施例中，此抗体对于人类FcγRI，如活体外分析所测，具有极小或无可侦测的结合亲和力。在某些实施例中，此抗体对于人类FcγRIII，如活体外分析所测，具有极小或无可侦测的结合亲和力。

在某些实施例中，此活体外分析为表面电浆共振分析。

在某些实施例中，相较于包括野生型Fc区之抗体，此抗体如活体外细胞毒性分析所测，具有降低的抗体-依赖-细胞毒性(ADCC)。

在某些实施例中，此抗体具有极轻微或无可侦测的抗体-依赖-细胞毒性(ADCC)。

在某些实施例中，相较于包括野生型Fc区之抗体，此抗体如活体外细胞毒性分析所测，具有降低的补体依赖细胞毒性(CDC)。

在某些实施例中，如于活体外分析藉由测量细胞裂解测得，此抗体具有低于50％细胞毒性。

在某些实施例中，此抗体具有极轻微或无可侦测的补体依赖细胞毒性(CDC)。

在某些实施例中，相较于包括野生型Fc区之抗体，此抗体引发降低的T细胞媒介之杀死带有Fc受体细胞，例如NK细胞或巨噬细胞。

在特定的实施例中，相较于包括野生型Fc区之抗体，此抗体引发降低的由带有Fc受体细胞，例如NK细胞或巨噬细胞所媒介之杀死T细胞。

在某些实施例中，如于活体外分析由测量K_D所测定，此抗体展现对人类FcγRIIA之结合亲和力比其对人类FcγRIIB的结合亲和力更强，该对人类FcγRIIB的结合亲和力比该抗体对人类FcγRI的结合亲和力更强，该对人类FcγRI的结合亲和力比该抗体对人类FcγRIII的结合亲和力更强或相当。在其他的实施例中，如活体外分析所测，此抗体具有对人类FcγRIIA>人类FcγRIIB>人类FcγRI>＝人类FcγRIII之结合亲和力。

在某些实施例中，如于活体外分析由测量K_D所测定，此抗体展现对人类FcγRIIA之结合亲和力比其对人类FcγRIIB的结合亲和力更强，该对人类FcγRIIB的结合亲和比此抗体对人类FcγRIII的结合亲和力更强，该对人类FcγRIII的结合亲和力比此抗体对人类FcγRI的结合亲和力更强或相当。在其他的实施例中，如活体外分析所测，此抗体具有对人类FcγRIIA>人类FcγRIIB>人类FcγRIII>＝人类FcγRI之结合亲和力。

在某些实施例中，此人类FcγRIII为人类FcγRIIIA或人类FcγRIIIB。

在某些实施例中，此嵌合的Fc区系包括一嵌合的绞链。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体，其包括一第一抗原结合区、一第二抗原结合区及一嵌合的重链恒定(CH)区，其中(a)第一抗原结合区系与CD3结合，(b)第二抗原结合区系与CD20结合。在本发明特定方面，相较于包括野生型CH区之抗体，如活体外分析所测，此嵌合的CH区系以较高，亦即较强的亲和力与人类FcγRIIA和人类FcγRIIB结合。又在另外方面，相较于包括野生型CH区之抗体，如活体外分析所测，此嵌合的CH系以较低，亦即较弱或无亲和力与人类FcγRI和人类FcγRIII结合。

本发明系提供包括一嵌合绞链区之双特异性抗体。在某些方面，此嵌合绞链区系包括来自位置216至236之氨基酸序列残基(EU编号)。建构本发明之双特异性抗体，其中该嵌合的绞链区系包括来自位置228至236(EU编号)之人类IgG2下绞链氨基酸序列PCPAPPVA(SEQ ID NO:52)。在特定的实施例中，本发明之双特异性抗体系包括一嵌合的绞链及此嵌合绞链之上绞链部分系包括来自IgG1上绞链之位置216至227(EU编号)的氨基酸残基。在其他的实施例中，本发明之双特异性抗体系包括一嵌合的绞链及此嵌合绞链之上绞链部分系包括来自IgG4上绞链之位置216至227(EU编号)的氨基酸残基。

在一实施例中，此双特异性抗体系包括一嵌合的绞链氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:53)。在另外的实施例中，此双特异性抗体系包括一嵌合的绞链氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:54)。在特定的实施例中，此双特异性抗体系包括来自位置237至340(EU编号)之人类IgG4 CH2区氨基酸序列。在其他的实施例中，此双特异性抗体系包括一衍生自人类IgG1 CH3区或人类IgG4 CH3区之CH3区。又在其他的实施例中，此双特异性抗体系包括一人类IgG1 CH1区及一人类IgG1 CH3区。在更多的实施例中，此双特异性抗体系包括一人类IgG4 CH1区及一人类IgG4 CH3区。

本发明一方面系提供制造包括一嵌合恒定重链区之双特异性抗体的方法，该方法系包括：(a)以编码能结合CD3抗原之第一轻链的核酸分子转染宿主细胞，该核酸分子系包括一编码第一VL区之核苷酸序列和编码Ig之恒定CL区的核苷酸序列，其中该编码所选的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和该编码Ig之CL区的核苷酸序列系经操作上连接一起；(b)以编码能结合CD3抗原之抗体的第一重链之核酸分子转染步骤(a)的宿主细胞，该核酸分子系包括一编码VH区的核苷酸序列和一编码人类Ig之嵌合恒定CH区的核苷酸序列，其中该编码VH区的核苷酸序列和编码该Ig之CH区的核苷酸序列系经操作上连接一起；其中CH区系编码一或多个CH3区内的一或多个氨基酸修饰，其降低或消除了第二CH3区与蛋白A之结合；(c)以编码能结合CD20抗原之抗体的第二重链之核酸分子转染步骤(a)的宿主细胞，该核酸分子系包括一编码VH区的核苷酸序列和一编码人类Ig之嵌合CH区的核苷酸序列，其中该编码VH区的核苷酸序列和编码该Ig之CH区的核苷酸序列系经操作上连接一起；及(d)藉由在该宿主细胞中共表现(a)和(b)之核酸分子，制造该抗体。

在一实施例中，本发明系提供一制造双特异性抗体的方法，其系藉由：(a)以(i)一编码抗体轻链之核酸分子转染一宿主细胞，其中该核酸分子系包括一编码包括SEQ ID NO:18之LCVR的核苷酸序列及一编码Ig之恒定C_L区的核苷酸序列，其中该编码抗体之LCVR区的核苷酸序列系以操作上连接编码Ig之C_L区的核苷酸序列；(b)以(i)一编码该抗体第一重链之核酸分子转染步骤(a)之宿主细胞，该核酸分子系包括一编码包括SEQ ID NO:10之HCVR的核苷酸序列及一编码IgG之嵌合C_H区的核苷酸序列，其中该编码C_H区的核苷酸序列系包括编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32之核苷酸序列，其中该编码HCVR的核苷酸序列系以操作上连接编码C_H区的核苷酸序列；及以(ii)一编码该抗体第二重链之核酸分子转染步骤(a)之宿主细胞，该核酸分子系包括一编码包括SEQ ID NO:2之HCVR的核苷酸序列及一编码IgG之嵌合C_H区的核苷酸序列，其中编码C_H区的核苷酸序列系包括编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32之核苷酸序列，其中该编码HCVR的核苷酸序列系以操作上连接编码C_H区的核苷酸序列；及(c)藉由在该宿主细胞中共表现(a)和(b)之核酸分子，制造此抗体。在某些案例中，此方法进一步系包括培养步骤(b)宿主细胞之步骤，其中此抗体系分泌至细胞培养基中；并从细胞培养基中分离此抗体。

在某些方面，制造双特异性抗体之方法视需要系包括以编码能结合CD20抗原之第二轻链的核酸分子转染步骤(a)的宿主细胞，且该核酸分子系包括一编码第二轻链之VL区的核苷酸序列和一编码Ig之恒定CL区的核苷酸序列，其中该编码第二轻链之VL区的核苷酸序列和该编码Ig之CL区的核苷酸序列系经操作上连接一起。

在某些实施例中，第一重链系包括一包含H95R修饰(IMGT外显子编号；EU编号为H435R)的CH3区。在另外的实施例中，此第一重链区系包括一另外包含一Y96F修饰(IMGT；EU编号为Y436F)之CH3区。在更多的实施例中，此方法系包括使用蛋白分离此抗体。

本发明之另一方面系提供一双特异性抗体，其包括：(a)一第一重链，其包含能辨识和结合第一目标抗原之抗原结合区，(b)一第二重链，其包含能辨识和结合第二目标抗原之抗原结合区，及(c)能辨识和结合第一或第二目标抗原之共享的轻链抗原结合区，其中(a)或(b)之重链或(a)和(b)二者系包括重链恒定区(CH)，而该重链恒定区(CH)系包括一含有SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之氨基酸序列的嵌合绞链区。

在特定的实施例中，此重链恒定区(CH)系包括SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32之氨基酸序列。在某些实施例中，编码嵌合的CH之核苷酸序列系包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33。在其他的实施例中，此嵌合的CH核苷酸序列系编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、or SEQ ID NO:32之氨基酸序列。又在其他的实施例中，CH区之核苷酸序列系包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33之编码氨基酸序列的核苷酸序列。

在特定的方面，此双特异性抗体系包括一编码包含SEQ ID NO:35氨基酸序列之轻链的核酸分子。在其他方面，此双特异性抗体系包括一包含SEQ ID NO:34核苷酸序列之轻链编码核酸分子。

在特定的方面，此双特异性抗体系包括一编码包含SEQ ID NO:37氨基酸序列之重链的核酸分子。在其他方面，此双特异性抗体系包括一包含SEQ ID NO:36核苷酸序列之重链编码核酸分子。

在特定的方面，此双特异性抗体系包括一编码包含SEQ ID NO:40氨基酸序列之重链的核酸分子。在其他方面，此双特异性抗体系包括一包含SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39核苷酸序列之重链编码核酸分子。

在特定的方面，此双特异性抗体系包括一编码包含SEQ ID NO:42氨基酸序列之重链的核酸分子。在其他方面，此双特异性抗体系包括一包含SEQ ID NO:41核苷酸序列之重链编码核酸分子。

在特定的方面，此双特异性抗体系包括一编码包含SEQ ID NO:44氨基酸序列之重链的核酸分子。在其他方面，此双特异性抗体系包括一包含SEQ ID NO:43核苷酸序列之重链编码核酸分子。

在另外方面，本发明系提供一治疗上有效量之如文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子。在一相关的方面，本发明之特征为组合抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子和第二治疗剂之组成物。在一实施例中，此第二治疗剂为任何有利地与抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子组合之试剂。可有利地与抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子组合之例示性药剂系详细论述于文中的他处。

又在另一方面，本发明系提供使用本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子用于靶向/杀死表现CD20之肿瘤细胞的治疗方法，其中该治疗方法系包括将一治疗上有效量之包括本发明抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子的医药组成物投予有此需要之患者。在某些案例中，此双特异性抗原结合分子(例如，抗体)系与表现CD20的人类细胞结合或与人类B-细胞结合。

在另外方面，本发明系提供双特异性抗体，其中该抗体：系与表现人类CD3之人类细胞和表现猕猴CD3之猕猴细胞结合；系与人类T-细胞或猕猴T-细胞结合；系以介于1x10^-12M至1x10^-6M之EC₅₀值与CD3-表现的人类T-细胞结合；系以介于1x10^-9M至1x10^-8M之EC₅₀值与CD3-表现的人类T-细胞结合；系以介于1x10^-12M至1x10^-6M之EC₅₀值与CD20-表现的人类B-细胞结合；系以介于1x10^-9M至1x10^-8M之EC₅₀值与CD20-表现的人类B-细胞结合；或促进T-细胞媒介的人类B-细胞毒性，其中该B-细胞对于抗-CD20-媒介的细胞毒性系具阻抗性或难以用抗-CD20-媒介的细胞毒性治疗。

在本发明各种方法和用途中，以至少约0.01mg/kg的剂量单一投予双特异性抗体给病患，在双特异性抗体投予患者后约2天，造成患者中B-细胞数目降至可侦测量以下。在某些案例中，在以至少约0.01mg/kg双特异性抗体之单一剂量投予患者后至少直到约7天，B-细胞数目系维持在可侦测量以下。

本发明系包括本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子用于靶向/杀死表现CD20之肿瘤细胞的用途以及于制造医药品供治疗与CD20表现相关或由其所造成的疾病或病症之用途。在某些案例中，本发明之双特异性抗体系用于制造医药品供于患者中治疗或改善癌症，其中该双特异性抗体系包括一结合人类CD3之第一抗原结合区，一结合人类CD20之第二抗原结合区以及一拴住各第一和第二抗原区之嵌合Fc区，而此治疗或改善癌症系包括：(a)于患者中抑制肿瘤生长，(b)于患者中媒介B-细胞裂解，(c)于患者中治疗B-细胞癌症，(d)于患者中治疗CD20表现为阳性的癌症，或(e)于患者中治疗CD20-表现的黑色瘤癌症。

本发明亦包括一双特异性抗体，其系包括一第一抗原结合区、一第二抗原结合区及一嵌合的重链恒定(CH)区，其中：第一抗原结合区系与CD3结合，第二抗原结合区系与CD20结合，而此嵌合的CH区，相较于包括野生型CH区之抗体，系以较高，亦即较强的亲和力与人类FcγRIIA和人类FcγRIIB结合，此双特异性抗体供用于制造医药品。本发明系提供一双特异性抗体，其包括一结合CD3之第一抗原结合区，一结合CD20之第二抗原结合区，以及一嵌合的CH区，而该嵌合的CH区与人类FcγRIIA结合亲和力系高于，亦即强于其与人类FcγRIIB结合，供用于制造医药品。

从确认详细说明之论述中其他的实施例将变得显而易见。

【图式简单说明】

图1系说明用于嵌合绞链区之结构中的绞链氨基酸以及对应的氨基酸编号规则。

图2系代表人类IgG1重链恒定区，包括CH1、绞链、CH2和CH3区之氨基酸序列，如UniProtKB中之IGHG1/Swiss‐Prot登录号P01857(SEQ ID NO:45)所述。

图3系代表人类IgG2重链恒定区，包括CH1、绞链、CH2和CH3区之氨基酸序列，如UniProtKB中之IGHG2/Swiss‐Prot登录号P01859(SEQ ID NO:46)所述。

图4系代表人类IgG4重链恒定区，包括CH1、绞链、CH2和CH3区之氨基酸序列，如UniProtKB中之IGHG4/Swiss‐Prot登录号P01861(SEQ ID NO:47)所述。

图5A和5B：描述有关Daudi(图5A)和Raji(图5B)细胞在具有野生型或嵌合绞链区C_H之抗体的存在下，缺乏CDC活性之剂量‐反应曲线。(「对照」抗体4＝含野生型IgG1 C_H之双特异性Ab；抗体1；抗体2；IgG1同型对照组＝含野生型IgG1 C_H之非特异性Ab)。

图6A和6B：描述有关Daudi(图6A)和Raji(图6B)细胞在具有野生型或嵌合绞链区CH之抗体的存在下，缺乏ADDC活性之剂量‐反应曲线。(「对照」抗体4＝含野生型IgG1 CH之双特异性Ab；抗体1；抗体2；IgG1同型对照组＝含野生型IgG1 CH之非特异性Ab)。

图7A-7F系显示以皮下植入Raji肿瘤细胞和PBMC(或无PBMC对照-图7D)混合物之NSG小鼠，及在肿瘤植入后，投予本发明之CD3xCD20双特异性抗体(Ab1)或媒剂或对照抗体并在肿瘤植入同一天开始(第0天)治疗，及于研究期间所测量之随时间变化的肿瘤体积(以mm³表示)。图7A：以媒剂治疗并无任何小鼠显现肿瘤生长抑制；图7B：以0.4mg/kg对照Ab5(抗-FelD1Ab)治疗，5只小鼠中有1只(1/5)显现肿瘤生长抑制；图7C：以0.4mg/kg抗体1(Ab1)治疗，5/5小鼠显现肿瘤生长抑制；图7D：当无PBMC植入及以0.4mg/kg Ab1治疗时，0/5小鼠显现肿瘤生长抑制；图7E：以0.04mg/kg Ab1治疗，5/5小鼠显现肿瘤生长抑制；及图7F：以0.004mg/kg Ab1治疗，5/5小鼠显现肿瘤生长抑制。

图8A和8B系显示以皮下植入Raji肿瘤细胞和PBMC混合物，并以Ab1(CD3xCD20-嵌合Fc)治疗的NSG小鼠，相较于媒剂、有或无IgG添加(图8A)，或以Ab4(CD3xCD20-wtFc)治疗，相较于媒剂、有或无IgG添加(图8B)之随时间变化的肿瘤体积(以mm³表示)。在此模型中添加IgG之二种CD3xCD20双特异性抗体显示显著的肿瘤生长抑制。如图8A中所见，在此实验中，有或无添加IgG之CD3xCD20-嵌合Fc双特异性抗体(Ab1)在试验的期间显现完全的肿瘤生长抑制。

图9系说明在以CD3xCD20双特异性抗体治疗的NSG小鼠中，已建立的肿瘤在第14天消退(～200-400mm³)。NSG小鼠系在治疗前15天，以皮系植入Raji肿瘤细胞和PBMC，让肿瘤建立。随后以0.4mg/kg抗体1(CD3xCD20-嵌合Fc抗体)，或0.4mg/kg对照Ab5(抗-FelD1Ab)或媒剂对照组每周一次(第7天，第14天，第21天)治疗小鼠。

图10系说明在CD3xCD20双特异性抗体治疗的NSG小鼠中，已建立的肿瘤在第21天消退(～500-900mm³)。NSG小鼠系在治疗前15天，以皮系植入Raji肿瘤细胞和PBMC，让肿瘤建立。以0.4mg/kg抗体1(CD3xCD20-嵌合Fc抗体)或0.4mg/kg对照Ab5(抗-FelD1Ab)每周一次(第7天，第14天，第21天)治疗小鼠。

图11A和11B系藉由在研究第7天测量猕猴外围血液中CD20+B-细胞量或CD3+T-细胞量之变化，与单特异性抗体给药(利妥昔单抗)相比，描绘抗体1和抗体4CD3xCD20双特异性抗体给药之活体内效力。在第0天投予抗体或安慰剂。图11A：在所有样本中(安慰剂除外)外围血液中B-细胞量在第2天显著衰竭；图11B：于经双特异性抗体治疗的动物外围血液中在第2天观察到T-细胞过渡性丧失并在第4天恢复到基线量。在安慰剂或利妥昔单抗(Rituxan)组中并无观察到T-细胞丧失(基线以下)。

图12A和12B系藉由在一长期的研究(3个月)中测量猕猴外围血液中CD20+B-细胞量或CD3+T-细胞量之变化，描绘抗体1和抗体4CD3xCD20双特异性抗体给药之活体内效力。在第0天投予1.0mg/kg安慰剂(媒剂)或双特异性抗体。图12A：在所有样本中(安慰剂除外)外围血液中B-细胞量在第2天显著衰竭且在研究期间量持续衰竭；图12B：就经双特异性抗体治疗的动物在第2天观察到T-细胞过渡性丧失，然后T-细胞在第4天恢复到基线量并维持在大约基线值，如在整个研究期间(>80天)所测。在以安慰剂治疗的动物中并无观察到T-细胞过渡性丧失。

图13A和13B系藉由在一长期的研究(2个月)中测量猕猴外围血液中CD20+B-细胞量或CD3+T-细胞量之变化，描绘抗体1和抗体4CD3xCD20双特异性抗体低剂量给药之活体内效力。在第0天投予0.01mg/kg或0.001mg/kg(1μg/kg)的双特异性抗体。图13A：外围血液中B-细胞量在第2天显著衰竭且在研究期间量持续衰竭，与在经高剂量CD3xCD20双特异性抗体治疗的动物中所观察到的相类似(亦参见图11A或12A)；图13B：以非常低剂量(1μg/kg)双特异性抗体治疗的动物经历了相同的T-细胞过渡性丧失和恢复，如同在以较高剂量CD3xCD20双特异性抗体治疗的动物中所见到的(亦参见图11B或12B)。

图14系显示经CD3xCD20-嵌合Fc抗体1治疗的动物外围血液中B细胞丧失与抗体消失的相关性。当动物的血液循环中抗体暴露(开符号)随着时间衰退时，B-细胞群族(实心符号)开始恢复(例如在动物编号I06881第81天所观察到的(实心符号))。

图15系显示经CD3xCD20-嵌合Fc抗体2治疗的动物外围血液中B细胞丧失与抗体消失的相关性。当动物的血液循环中抗体暴露(开符号)随着时间衰退时，B-细胞群族(实心符号)开始恢复(例如在动物编号I06876第66天所观察到的(实心三角形)，及动物编号I06877第68天所观察到的(实心正方形))。

图16系显示经CD3xCD20-野生型Fc(Ab 4)双特异性抗体治疗的动物外围血液中B细胞丧失与抗体消失的相关性。当动物的血液循环中抗体暴露(开符号)随着时间衰退时，B-细胞群族(实心符号)开始恢复(例如在动物编号I06870第91天所观察到的(实心符号)，及动物编号I06872第64天所观察到的(实心正方形))。

图17A和17B系描述猕猴之脾脏(图17A)或肠系膜淋巴结(图17B)中，以更低剂量(0.01至1.0mg/kg剂量)投予双特异性组投予CD3xCD20双特异性抗体，与抗-CD20单特异性抗体相比较，所造成的组织B-细胞的衰退。此衰减在安慰剂对照动物组的二种组织中并未见到。二种CD3xCD20双特异性抗体(Ab1和Ab 4)在淋巴器官中造成剂量依赖的B-细胞衰减，且在剂量等于或大于0.1mg/kg时，此双特异性抗体比利妥昔单抗更有效地衰减B-细胞。

图18A和18B系说明在一活体外生物分析中CD3xCD20双特异性抗体引发人类PBMC(图18A)或猕猴PBMC(图18B)之增生，而对照的抗体5(-▲-；不特定于CD3xCD20)并未显现活性。

图19A和19B系说明在一细胞毒性分析中CD3xCD20-媒介的Raji标靶致死。抗体1分别以25.0ρM和9.10ρM之人类(图19A)和猕猴(图19B)T细胞的代表性EC₅₀值媒介了标靶细胞致死。抗体4分别以15.7ρM和1.73ρM之人类(图19A)和猕猴(图19B)T细胞的代表性EC₅₀值媒介了标靶细胞致死。并未观察到对照组(-▲-)之活性。

图20A和208B系说明CD3xCD20双特异性抗体藉由天然的T-细胞，媒介了细胞死亡。图20A系显示在抗体4最高试验浓度时之代表性FACS散布图。B16F10.9野生型细胞系以CFDA-SE标定，而B16F10.9/CD20细胞系以Violet Cell Tracker标定。效应子细胞未标定。图20A的第二个图系显示藉由以抗-CD3xCD20治疗消除CD20-表现细胞(四象限的右下)。图20B系显示在CD20xCD3抗体，亦即抗体4(野生型Fc)、抗体1(嵌合Fc)或对照Ab 5和PBMC的存在下48小时之后，存活的B16F10.9/CD20细胞比例。存活百分比系藉由将活的细胞群族中B16F10.9/CD20细胞与CD20阴性B16F10.9细胞之百分率作比较所测定。Ab4和Ab1在混合的细胞群族中系专一地仅引导人类T细胞杀死表现CD20的标靶细胞(图20B)。标靶细胞致死仅在双特异性抗体的存在下观察到，其中抗体4(EC₅₀ 12.8ρM)和抗体1(EC₅₀ 19.5ρM)(图20B)系以剂量-依赖的方式衰减B16F10.9/CD20细胞。在最高试验剂量时(10μg/mL)仅有低于5％的CD20-表现细胞存活。

图21系显示在以B16F10.9/CD20细胞为标靶的48-小时细胞毒性分析中，来自总CD2+效应子细胞中活化的(CD69+)细胞百分比，此活性作用系由任一CD20xCD3抗体，亦即抗体4(野生型Fc)或抗体1(嵌合Fc)所引发。

图22A和22B系说明CD3xCD20双特异性抗体经由其双特异性结合臂引发T-细胞与标靶细胞(CD20+细胞)之群集。效应子细胞系以CFSE染色而CD20+细胞系以Violet Cell Tracker染色，并以个别的象限控制。在以不相关的对照抗体(对照抗体5)培养后，在细胞混合物中并未出现群集(双重-染色)(图22A)。在以CD3xCD20双特异性抗体(Ab 4)培养后，细胞群集出现，因为其染上CFSE和Violet(参见图22B散布图上左上象限，如以粗黑方框所标出)。

图23系显示在以皮下植入Raji肿瘤细胞和PBMC混合物的NSG小鼠中之肿瘤体积(以mm³表示)研究，其中系将0.4mg/kg,2X/周(i.p)之本发明CD3xCD20双特异性抗体(Ab 1)，0.4mg/kg,2X/周(i.p)之不相关抗体对照Ab 6，或媒剂与8mg/kg,5X/周(i.p)之抗-CD20抗体利妥昔单抗、5X/周(i.v)之CD19xCD3BiTE作比较(就CD19xCD3BiTE，参见Nagorsen D,等人Pharmacol Ther.2012Dec；136(3):334-42,2012.)。给予带有已建立肿瘤(～100-500mm3)的小鼠治疗。数据系以平均值(SEM)来表示并用于ANOVA分析。在此活体内模型中，每周i.p.给剂2x之Ab1与5x/周i.v.给剂之CD19xCD3BiTE效力相当。

图24系显示在以皮下植入Raji/PBMC混合物的NSG小鼠中之肿瘤体积(以mm³表示)研究，类似于图23，然而提供Ab1、对照Ab6、利妥昔单抗和媒剂对照组之ANOVA分析。在抑制已建立的Raji肿瘤上，每周给剂2x之Ab1优于利妥昔单抗治疗(以8mg/kg；5x/周i.p.给剂)。

图25A和25B系说明当治疗系与hCD20/B16F10.9肿瘤转植同时开始或跟随其后时，在以CD3xCD20双特异性抗体治疗的人源化小鼠中之延迟肿瘤生长。图25A：将hCD3小鼠以皮下植入hCD20‐转导的B16F10.9黑色素瘤细胞并同时以0.004mg/kg或0.4mg/kg抗体1(CD3xCD20‐嵌合Fc抗体)或4mg/kg对照Ab5(抗‐FelD1Ab)，或媒剂对照组(i.p.每周2次)治疗。图25B：将hCD3小鼠以皮下植入hCD20/B16F10.9黑色素瘤细胞并在第10天治疗已建立的肿瘤及之后以抗体1(CD3xCD20‐嵌合Fc抗体)或对照组治疗。小鼠系以i.p.每周二次之0.4mg/kg或4mg/kg Ab1，或0.4mg/kg对照Ab5(抗‐FelD1Ab)或媒剂对照组治疗。

【实施方式】

在描述本发明之前，应了解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为此等方法和条件可改变。亦应了解，文中所用的术语仅作为描述特定实施例之目的，且不希望受限，因为本发明之范围将仅受限于所附的权利要求。

除非另有说明，否则所有文中所用的技术和科学术语系具有如本发明所属技术之一般技术者所正常理解之相同意义。如文中所用，术语「大约」当用于有关特定引述的数值时，系指该值可从该引述值做不大于1％的变化。例如，如文中所用，「约100」一词包括99和101及所有介于之间的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在施行或试验本发明时可使用任何该等与文中所述的方法和物质类似或相当者，但较佳的方法和物质为目前所述。

定义

「CD3」一词，如文中所用，系指表现在T细胞上作为多分子T细胞受体(TCR)之部分的抗原，且其系由下列四条受体链中的二条链所形成的同源二聚体或异源二聚体所组成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ及CD3-γ。除非明确地指出系来自非人类物种，否则所有关于文中之蛋白、多肽和蛋白片段希望系指人类版本的各蛋白、多肽和蛋白片段。因此，除非明确地指出系来非人类物种，例如「小鼠CD3」、「猴子CD3」等，否则「CD3」一词系指人类CD3。

如文中所用，「结合CD3之抗体」或「抗-CD3抗体」包括特异性辨识单一CD3亚单元(例如ε、δ、γ或ζ)之抗体及其抗原结合片段，以及特异性辨识二个CD3亚单元之二聚复合物(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚体)的抗体及其抗原结合片段。本发明之抗体及抗原结合片段可与可溶性CD3及/或细胞表面表现的CD3结合。可溶性CD3包括天然的CD3蛋白以及重组的CD3蛋白变体，例如，缺乏跨膜区或另外不与细胞膜结合之单聚和二聚CD3结构。

如文中所用，「细胞表面-表现的CD3」一词，系指一或多个CD3蛋白，其在活体内或活体外系表现在细胞表面，使得至少一部分的CD3蛋白系暴露于细胞膜的胞外侧且易接近抗体的抗原结合部分。「细胞表面表现的CD3」包括包含在细胞膜中之功能性T细胞受体环境内的CD3蛋白。「细胞表面表现的CD3」一词包括表现作为细胞表面上的同源二聚体或异源二聚体(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚体)之部分的CD3蛋白。「细胞表面表现的CD3」一词亦包括自我表现，在细胞表面上无其他CD3链类型之CD3链(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)。「细胞表面表现的CD3」可包括或由表现于正常表现CD3蛋白之细胞表面的CD3蛋白所组成。另外，「细胞表面表现的CD3」可包括或由表现于正常不会表现CD3蛋白在其表面上但经人工工程化表现CD3在其表面上之细胞表面的CD3蛋白所组成。

如文中所用，「抗-CD3抗体」一词，包括带有单一特异性之单价抗体，以及包括结合CD3之第一臂及结合第二(目标)抗原之第二臂的双特异性抗体，其中抗-CD3臂系包括任何如文中表1或表2中所列的HCVR/LCVR或CDR序列。抗-CD3双特异性抗体之实例系描述于文中之他处。术语「抗原-结合分子」包括抗体和抗体之抗原结合片段，其包括，例如双特异性抗体。抗-CD3双特异性抗体之实例亦描述于US 2007/0280945A1中；及2013年9月19日申请的PCT国际申请案号PCT/US13/60511中，其系以全文引用的方式并入本文中。

除非有说明系来非人类物种(例如「小鼠CD20」，「猴子CD20」等)，否则术语「CD20」，如文中所用，系指人类CD20蛋白。人类CD20蛋白具有如NCBI参考序列NP_690605.1之氨基酸序列。

如文中所用，「抗-CD20抗体」一词包括具有单一特异性之单价抗体，例如Rituxan(利妥昔单抗)，如US 7,879,984所述。例示性抗-CD20抗体亦描述于US 7,879,984和2013年9月19日申请的PCT国际专利申请案号PCT/US13/60511中，其各自系以引用的方式并入本文中。

术语「抗体」如文中所用，系指包括至少一个与特定抗原(例如CD3)专一结合或相互作用之互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语「抗体」系包括：包含藉由双硫键相连接的四条多肽链，二条重(H)链和二条轻(L)链之免疫球蛋白分子(亦即「全抗体分子」)以及其多聚体(例如IgM)。各重链系包括一重链可变区(文中缩写为HCVR或V_H)及一重链恒定区。此重链恒定区系包括三个区，C_H1、C_H2和C_H3。各轻链系包括一轻链可变区(文中缩写为LCVR或V_L)及一轻链恒定区。轻链恒定区系包括一个区(C_L1)。V_H和V_L区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守性区域，称为架构区(FR)。各V_H和V_L系由三个CDR和四个FR所组成，以下列顺序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明不同的实施例中，抗-CD3抗体(或其抗原结合部分)之FR可与人类生殖系序列相同，或经自然或人工修饰。氨基酸共有序列可以二或多个CDR之并排(side-by-side)分析为基准来定义。

术语「抗体」，如文中所用，亦包括全抗体分子之抗原结合片段。术语抗体之「抗原结合部分」、抗体之「抗原结合片段」等等，如文中所用，包括任何与抗原特异性结合形成一复合物之天然生成、酵素制得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗体之抗原结合片段可使用任何适合的标准技术，例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变区和(视需要)恒定区之DNA操作和表现的重组基因工程技术，衍生自例如全抗体分子。此DNA为已知的及/或可容易地从例如市面来源、DNA数据库(包括，例如噬菌体-抗体数据库)取得或可经合成。此DNA可用化学或藉由使用分子生物技术来定序和操作，例如将一或多个可变及/或恒定区排列成适合的组态，或导入密码子，产生半胱胺酸残基、修饰、增添或删除氨基酸等。

抗原结合片段之非限定实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区之氨基酸残基所组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如区域特异性抗体、单区抗体、区域删除抗体、嵌合抗体、CDR-嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、奈米抗体(例如单价奈米抗体、双价奈米抗体等)、小模块免疫医药(SMIP)及鲨可变IgNAR区，亦涵盖在文中所用的「抗原结合片段」之词语内。

抗体之抗原结合片段典型地将包括至少一可变区。可变区可为任何大小或氨基酸组成之区域且一般应包括与一或多个架构序列相邻或在其架构内之CDR。在具有V_L区与V_H区结合之抗原结合片段中，V_H和V_L区可以任何适合的排列位于彼此相对处。例如可变区可为二聚化并含有V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。另外，抗体之抗原结合片段可含有单体V_H或V_L区。

在特定的实施例中，抗体之抗原结合片段可含有至少一个可变区与至少一个恒定片段(Fc)区共价连接或另外与一Fc区拴在一起。术语「拴在一起」系指经由共价键、连接符多肽序列直接连接，将二种组份相结合，例如可变区与一恒定区拴在一起。因此，在特定的实例中，包括第一和第二抗原结合区之可变区，例如该等结合CD3和CD20形成一双特异性抗体者，系经由共价键或连接符氨基酸序列各自直接连接(或拴住)，例如(由N-端至C-端)全长或部分C_H1、嵌合绞链、C_H2和C_H3区。在本发明之抗体的抗原结合片段内可发现的可变区和恒定区之非限定、例示性组态包括：(i)V_H-C_H1-绞链-C_H2-C_H3；(ii)V_H-绞链-C_H2-C_H3；(iii)V_H-C_L；(iv)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(v)V_L-C_H2-C_H3；及(vi)V_L-C_L。在任何可变区和恒定区之组态中，包括上列任何的例示性组态，可变区和恒定区可直接彼此相连接或可藉由本发明之完整或部分的嵌合绞链，或藉由完整或部分的C_H1和嵌合绞链相连(拴住)。在某些案例中，多肽连接符(例如2至10个氨基酸)可连接(拴住)可变区和Fc区或可包括一带有完整或部分嵌合绞链及/或C_H1之另外的连接链。绞链区可由至少上绞链和下绞链氨基酸所组成，使其在单一多肽分子中于相邻的可变及/或恒定区之间产生柔性和半柔性连结。再者，在本发明之抗体的抗原结合片段可包括以非共价彼此相互连结及/或与一或多个单体V_H或V_L区相连结(例如以双硫键)之任何上列的可变区和恒定区组态之同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。

本发明之多特异性抗体模式，包括文中所揭示的例示性双特异性抗体，典型地系包括至少二个不同的可变区，其中各可变区能专一与个别的抗原结合。多特异性抗体模式，可使用本项技术中可取得的习用技术来改造，使其适用于本发明抗体之抗原结合片段状况。

本发明之抗体系经修饰以具有降低或无补体-依赖的细胞毒性(CDC)或抗体-依赖的细胞媒介之细胞毒性(ADCC)，如活体外所测。「补体-依赖的细胞毒性(CDC)」系指在补体的存在下藉由本发明之抗体裂解抗原-表现细胞。「抗体-依赖的细胞媒介之细胞毒性(ADCC)」系指细胞媒介的反应，其中表现Fc受体(FcR)之非特异性细胞毒性细胞(例如天然的杀手(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)辨识出目标细胞上的结合抗体并据此导致目标细胞的裂解。CDC和ADCC可使用本项技术所熟知及可取得的分析来测量。(参见，例如美国专利第5,500,362号和第5,821,337号，及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗体的恒定区(CH)对于抗体固定补体和媒介细胞-依赖的细胞毒性之能力很重要。因此，抗体之CH可依其是否为抗体媒介细胞毒性所需为基准加以选择。

在本发明特定的实施例中，本发明之双特异性抗体为人类抗体。术语「人类抗体」，如文中所用，希望系包括具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列之可变区和恒定区的抗体。本发明之人类抗体可包括非由人类生殖系免疫球蛋白序列所编码之氨基酸残基(例如藉由随机或活体外位点特异性突变所导入之突变或活体内体细胞突变)，例如在CDR中及特别是CDR3。然而，术语「人类抗体」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳动物物种(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人类架构序列上之抗体。

本发明之抗体，在某些实施例中可为重组的人类抗体。术语「重组的人类抗体」，如文中所用，希望包括由重组方法，例如使用重组的表现载体转染至宿主细胞(进一步详述于下)所制备、表现、产生或分离之所有人类抗体，由重组的组合人类抗体库(进一步详述于下)分离出之抗体，由经转殖人类免疫球蛋白基因之动物(例如小鼠)分离出的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或由任何其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列与DNA序列剪接之方法所制备、表现、产生或分离之抗体。此等重组的人类抗体具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列之可变区和恒定区。然而，在特定的实施例中，此等重组的人类抗体系在活体外经诱发突变(或当使用以人类Ig序列基因转殖之动物时，为活体内体细胞诱发突变)，且因此重组抗体之V_H和V_L区的氨基酸序列(当衍生自人类生殖系V_H和V_L序列或与其有关时)其可能并非天然存在于活体内人类抗体生殖系库中之序列。

人类抗体可以二种与绞链异质性有关之形式存在。第一种形式，包括约150-160kDa之安定的四链结构之免疫球蛋白分子，其中此二聚体系藉由链间重链双硫键聚集一起。第二种形式，二聚体并非经由双硫键相连接且此约75-80kDa之分子系由共价偶合的轻链和重链(半抗体)所组成。这些形式极难分离，即使在亲和纯化后。

在各种完整的IgG同型中，第二种形式出现的频率系因(但不限于)与抗体之绞链区同型有关之结构差异所致。在人类IgG4绞链之绞链区中的单一氨基酸取代可显著地降低第二种形式出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)至典型地使用人类IgG1绞链所观察到的程度。本发明系涵盖在绞链区中具有一或多个突变之抗体，该突变例如在制造上可能为所希望的，用以改善所欲的抗体形式之产率。

本发明之抗体可为分离的抗体。「分离的抗体」，如文中所用，系指经鉴定并从至少一种其天然环境之组成份分离及/或回收之抗体。例如，从至少一种生物体，或从组织或细胞之组成份分离或移出之抗体，其中就本发明之目的，该存在自然界或为自然产生的抗体为一「分离的抗体」。分离的抗体亦包括重组细胞内原位抗体。分离的抗体为历经至少一纯化或分离步骤之抗体。根据特定的实施例，分离的抗体可能实质上无其他细胞物质及/或化学物。

相较于可从其衍生抗体之对应的生殖系序列，文中所揭示的抗-CD3或抗-CD20可变区可在重链和轻链可变区之架构及/或CDR区中包括一或多个氨基酸取代、插入及/或删除。此等突变可藉由将文中所揭示之氨基酸序列与得自，例如公开的抗体序列数据库之生殖系序列相比较，而容易地确定。本发明包括由任何文中所揭示的氨基酸序列所衍生之抗体及其抗原结合片段，其中在一或多个架构及/或CDR区中的一或多个氨基酸系突变成衍生抗体之生殖系序列的对应残基，或另一种人类生殖系序列之对应残基，或对应生殖系残基之保守氨基酸取代(此等序列之改变在文中共同称为「生殖系突变」)。本项技术之一般技术者，由文中所揭示之重链和轻链可变区序列开始，可容易地制造许多包括一或多个个别的生殖系突变或其组合之抗体和抗原结合片段。在特定的实施例中，V_H及/或V_L区内的所有架构及/或CDR残基系突变回到衍生此抗体之原始生殖系序列中所发现的残基。在其他实施例中，仅特定的残基突变回到原始的生殖系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中发现突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现突变的残基。在其他的实施例中，一或多个架构及/或CDR残基系突变成不同生殖系序列之对应残基(亦即与最初衍生抗体之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本发明之抗体在架构及/或CDR区内可含有任何二或多个生殖系突变之组合，例如，其中特定的个别残基系突变成特定生殖系序列之对应残基，而与原始生殖系序列不同的其他残基系维持原样或突变成不同生殖系序列之对应残基。一旦得到后，含有一或多个生殖系突变之抗体和抗原结合片段可容易地检测其一或多种所欲的性质，例如改善结合特异性、增加结合亲和力、改善或增进拮抗或促效性生物性质(视情况而定)、降低致免疫力等。以此通用方法所得到的抗体和抗原结合片段系涵盖在本发明中。

本发明亦包括抗-CD3或抗-CD20可变区，其系包含任何具有一或多个保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列之变体。例如，本发明包括抗-CD3抗体，其相对于文中表1所述之任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列，系具有含例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少之保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列。

术语「表位」系指与抗体分子可变区中称为补位(paratope)的特定抗原结合位置相互作用之抗原决定位。单一抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原上的不同区域结合并可具有不同的生物效应。表位可为构型或线性。构型表位系由直链多肽链不同线段之空间上并列的氨基酸所产生。线性表位系由多肽链相邻的氨基酸残基所产生。在特定的情况下，表位可包括抗原上的醣类基团、磷酰基或磺酰基。

术语「实质上一致」或「实质上相同」当系指核酸或其片段时，系表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一核酸(或其互补股)优化对齐时，以任何熟知的序列相同度算法，例如下文所论述的FASTA、BLAST或Gap来测量，有至少约95％，及更佳地至少约96％、97％、98％或99％之核苷酸碱基具核苷酸序列相同度。与参照核酸分子具有实质上镶同度的核酸分子，在特定情况下，可编码一多肽，其与参照核酸分子所编码的多肽具有相同或实质上类似氨基酸序列。

如应用于多肽，术语「实质上类似」系指二个胜肽序列，当以GAP或BESTFIT程序使用内建缺位权重优化对齐时，享有至少95％序列相同度，甚佳地至少98％或99％序列相同度。较佳地，不同的残基位置系相差在保守性氨基酸取代。「保守性氨基酸取代」为其中一氨基酸残基系经另一带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(R基)之氨基酸残基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代实质上不会改变蛋白质的功能特性。在其中彼此有二或多个保守性取代之不同氨基酸序列的案例中，可调高序列相同度之百分比或类似程度以修正此保守性取代作用之性质。调整之方法已为熟习本项技术者所熟知。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有类似化学性质之侧链的氨基酸基团实例包括(1)脂系侧链：甘胺酸、丙胺酸、缬胺酸、白胺酸及异白胺酸；(2)脂系-羟基侧链：丝胺酸及苏胺酸；(3)含酰胺侧链：天门冬酰胺酸和麸酰胺酸；(4)芳香侧链：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)碱性侧链：离胺酸、精胺酸及组胺酸；(6)酸性侧链：天门冬胺酸和麸胺酸，及(7)含硫侧链有半胱胺酸和甲硫胺酸。较佳的保守性氨基酸取代基群有：缬胺酸-白胺酸-异白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、离胺酸-精胺酸、丙胺酸-缬胺酸、麸胺酸-天门冬胺酸及天门冬酰胺酸-麸酰胺酸。另外，保守性置换为在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250对数概似矩阵中具有正值之任何变化。「中度保守性」置换为在PAM250对数概似矩阵中具有非负值之任何变化。

多肽之序列类似性，其亦指序列相同度，典型地系使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至各种取代、删除和其他修饰作用(包括保守性氨基酸取代)之类似度量值配出类似的序列。例如，GCG软件含有例如Gap和Bestfit程序，其可使用内定参数，测定密切相关的多肽间，例如来自不同生物物种之同源多肽，或野生型和其突变蛋白间之序列同源性或序列相同度。参见，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用内定或建议参数，一种GCG Version 6.1内的程序，作比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜寻序列间最佳重迭区之比对和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。当本发明序列与含有较大量来自不同生物体的序列数据库作比较时，另一较佳的算法为使用内定参数之计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。

双特异性抗原-结合分子

本发明之抗体可为双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一目标多肽之不同的表位具特异性或可含有对一个以上的目标多肽具特异性之抗原结合区。参见，例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本发明之抗-CD3xCD2抗体可与另外的功能分子，例如另外的胜肽或蛋白相连结或共表现。例如，抗体或其片段可与一或多个其他的分子实体，例如另外的抗体或抗体片段功能性连接(例如以化学偶合、基因融合、非共价连结或其他)，产生带有另外的结合特异性之双特异性或多特异性抗体。

因此，本发明系包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白之一臂系与人类CD3结合，而免疫球蛋白之另一臂系对一目标抗原具特异性。与CD3双特异性抗体之另一臂结合的目标抗原可为任何表现在细胞、组织、器官、微生物或病毒上或在其邻近地区之抗原，而对抗此抗原的标靶免疫反应为所欲的。CD3-结合臂可包括如文中表1所列之任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。

在其中抗体的一臂系与CD3结合而另一臂系与目标抗原结合之本发明双特异性抗体的情况下，此目标抗原可为一肿瘤相关的抗原。特异性肿瘤-相关抗原之非限定实例包括，例如AFP、ALK、BAGE蛋白、BIRC5(survivin)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、cyclin-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如，GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、间皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Thompson-nouvelle抗原(Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶及uroplakin-3。

在其中抗体的一臂系与CD3结合而另一臂系与目标抗原结合之本发明双特异性抗体的情况下，此目标抗原可为一感染性疾病-相关的抗原。感染性疾病-相关的抗原之非限定实例包括，例如表现在病毒颗粒表面上，或优先表现在经病毒感染的细胞上之抗原，其中该病毒系由下列组成之群中选出：HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、埃-巴病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、伊科病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒疹、冠状病毒、呼吸道融合瘤病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、德国麻疹病毒、微小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革热病毒、乳突病毒、软疣病毒、小儿麻痹病毒、狂犬病病毒、JC病毒及虫媒病毒性脑炎病毒。另一种选择，目标抗原可为表现在细菌表面，或优先表现在经细菌感染的细胞上之抗原，其中该细菌系由下列组成之群中选出：衣原体(chlamydia)、立克次体(rickettsia)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎双球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)、淋病球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、退伍军人菌(legionella)、白喉菌(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱菌(cholera)、破伤风菌(tetanus)、肉毒杆菌(botulism)、炭疽病菌(anthrax)、瘟疫菌(plague)、钩端螺旋体(leptospira)及莱姆病菌(Lyme disease bacteria)。在特定的实施例中，此目标抗原可为表现在真菌表面，或优先表现在经真菌感染的细胞上之抗原，其中该真菌系由下列组成之群中选出：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Crytococcus neoformans)、麹菌(Aspergillus)(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲菌(niger)等)、毛霉目(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus)等)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。在特定的实施例中，此目标抗原可为表现在寄生虫表面，或优先表现在经寄生虫感染的细胞上之抗原，其中该寄生虫系由下列组成之群中选出：痢疾阿米巴原虫(Entamoeba histolytica)、结肠小袋绦虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴原虫(Acanthamoeba sp.)、梨型鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫(Cryptosporidium sp.)、阴道毛滴虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、枯西氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、弓浆虫(Toxoplasma gondii)、巴西鼠钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)、狐绦虫(Taenia crassiceps)及马来血丝虫(Brugia malayi)。特异性病原-相关抗原之非限定实例包括，例如HIV gp120、HIV CD4、B型肝炎糖蛋白L、B型肝炎糖蛋白M、B型肝炎糖蛋白S、C型肝炎E1、C型肝炎E2、肝细胞特异性蛋白、单纯疱疹病毒gB、巨细胞病毒gB及HTLV胞膜蛋白。

根据特定例示性实施例，本发明包括专一与CD3和CD20结合之双特异性抗原结合分子。此等分子在文中可称为，例如「抗-CD3/抗-CD20」或「抗-CD3/CD20」，或「抗-CD3xCD20」或「CD3xCD20」双特异性分子，或其他类似术语。

如文中所用，「抗原结合分子」一词系指与特定抗原专一结合之包括或包含至少一个互补决定区(CDR)单独或与一或多个另外的CDR及/或架构区(FR)组合之蛋白、多肽或分子复合物。在特定的实施例中，抗原结合分子为一抗体或抗体之片段，如该等术语于文中他处所定义。

如文中所用，「双特异性抗原结合分子」一词系指包括至少一第一抗原结合区和一第二抗原结合区之蛋白、多肽或分子复合物。与特定抗原专一结合之双特异性抗原结合分子内的各抗原结合区系包括至少单独一个CDR或与一或多个另外的CDR及/或FR组合。在本发明内文中，第一抗原结合区系与第一抗原(例如CD3)专一结合，而第二抗原结合区系与第二，不同的抗原(例如CD20)专一结合。

在本发明特定的例示性实施例中，此双特异性抗原结合分子为一双特异性抗体。双特异性抗体之各抗原结合区系包括一重链可变区(HCVR)和一轻链可变区(LCVR)。就包括第一和第二抗原结合区之双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)之情况，第一抗原结合区的CDR可以前缀「A1」来定名，而第二抗原结合区之CDR可以前缀「A2」来定名。因此，第一抗原结合区之CDR在文中可称为A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3；而第二抗原结合区之CDR在文中可称为A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3。

第一抗原结合区和第二抗原结合区可直接或间接彼此相连形成本发明之双特异性抗原结合分子(亦即双特异性ScFv)，进一步与Fc区结合。另一种选择，第一抗原结合区和第二抗原结合区可各自与个别的Fc区连接。本发明之双特异性抗原结合分子典型地将包括二个Fc区，其为个别抗体重链之各个别部份。除了在C_H3区具有一突变用来帮助或使异源二聚体(亦即双特异性)分子容易纯化外，第一和第二Fc区可为相同的序列。

本发明包括包含第一C_H3区及第二Ig C_H3区之双特异性抗原结合分子，其中第一和第二Ig C_H3区至少有一氨基酸互不相同，且相较于无此胺基差异之双特异性抗体，其中至少一氨基酸之差异降低了双特异性抗体与蛋白A之结合。在一实施例中，第一Ig C_H3区结合蛋白A而第二Ig C_H3区含有降低或消除蛋白A结合之突变，例如H435R修饰(EU编号；IMGT外显子编号为H95R)。第二C_H3可进一步包括Y436F修饰(EU编号；IMGT为Y96F)。在第二C_H3中可发现的另外修饰作用，就IgG1 C_H3区之情况而言系包括：EU编号D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I(IMGT为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I)；及就IgG4 C_H3区之情况为EU编号Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I(IMGT为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I)。

其他双特异性抗体格式或技术可用来制造本发明之双特异性抗原结合分子。例如具有第一抗原结合特异性之抗体或其片段可与一或多个其他的分子实体，例如具有第二抗原结合特异性之另外的抗体或抗体片段功能性连接(例如以化学偶合、基因融合、非共价连结或其他)，产生一特异性抗原结合分子。可用于本发明内文中之特定例示性双特异性模式包括(不限于)，例如scFv-为基础或双抗体双特异性模式、IgG-scFv融合、双可变区(DVD)-Ig、细胞杂交瘤(Quadroma)、knobs-into-holes、共同轻链(例如带有knobs-into-holes之共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab²双专一模式(参见，例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11及文中所引述的参考文献，作为前述模式之审视)。

在本发明之双特异性抗原结合分子的情况下，相较于无改变所欲功能之特定嵌合版本的Fc区，此Fc区可包括一或多个氨基酸变化(例如插入、删除或取代)。例如，本发明系包括在Fc区中包含一或多个修饰，造成经修饰的Fc区在Fc和FcRn之间具有修饰的结合交互作用(例如促进或减少)之双特异性抗原结合分子。在一实施例中，此双特异性抗原结合分子系包括C_H2或C_H3区中之修饰，其中该修饰增加了酸性环境中Fc区对FcRn之亲和力(例如在其中pH范围从约5.5至约6.0的核内体中)。此等Fc修饰之非限定实例包括，例如位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)之修饰；或位置428及/或433(例如L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)之修饰；或位置250及/或428之修饰；或位置307或308(例如308F、V308F)和434之修饰。在一实施例中，此修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；及307及/或308修饰(例如308F或308P)。

序列变体

相较于可从其衍生个别的抗原结合区之对应的生殖系序列，本发明之抗体和双特异性抗原结合分子可在重链和轻链可变区之架构及/或CDR区中包括一或多个氨基酸取代、插入及/或删除。此等突变可藉由将文中所揭示之氨基酸序列与得自，例如公开的抗体序列数据库之生殖系序列相比较，加以容易地确定。本发明之抗原结合分子可包括由任何文中所揭示的例示氨基酸序列所衍生之抗原结合区，其中在一或多个架构及/或CDR区中的一或多个氨基酸系突变成从其衍生抗体之生殖系序列的对应残基，或另一种人类生殖系序列之对应残基，或对应生殖系残基之保守氨基酸取代(此等序列之改变在文中共同称为「生殖系突变」)。本项技术之一般技术者，由文中所揭示之重链和轻链可变区序列开始，可容易地制造许多包括一或多个个别的生殖系突变或其组合之抗体和抗原结合片段。在特定的实施例中，V_H及/或V_L区内的所有架构及/或CDR残基系突变回到从其衍生此抗原结合区之原始生殖系序列中所发现的残基。在其他实施例中，仅特定的残基突变回到原始的生殖系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中发现突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现突变的残基。在其他的实施例中，一或多个架构及/或CDR残基系突变成不同生殖系序列之对应残基(亦即与最初从其衍生抗原结合区之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本发明之抗原结合区在架构及/或CDR区内可含有任何二或多个生殖系突变之组合，例如，其中特定的个别残基系突变成特定生殖系序列之对应残基，而与原始生殖系序列不同的其他残基系维持原样或突变成不同生殖系序列之对应残基。一旦得到后，含有一或多个生殖系突变之抗原结合区可容易地检测其一或多种所欲的性质，例如改善结合特异性、增加结合亲和力、改善或增进拮抗或促效性生物性质(视情况而定)、降低致免疫力等。以此通用方法所得到之包括一或多个抗原结合区的双特异性抗原结合分子系涵盖在本发明内。

本发明亦包括抗原结合分子，其中一或二个抗原结合区系包含任何具有一或多个保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明系包括包含抗原结合区之抗原结合分子，其具有相对于文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列，系带有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少之保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列。「保守性氨基酸取代」为其中一氨基酸残基系经另一带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(R基)之氨基酸残基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代实质上并不会改变蛋白质的功能特性。具有类似化学性质之侧链的氨基酸基团实例包括(1)脂系侧链：甘胺酸、丙胺酸、缬胺酸、白胺酸及异白胺酸；(2)脂系-羟基侧链：丝胺酸及苏胺酸；(3)含酰胺侧链：天门冬酰胺酸和麸酰胺酸；(4)芳香侧链：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)碱性侧链：离胺酸、精胺酸及组胺酸；(6)酸性侧链：天门冬胺酸和麸胺酸，及(7)含硫侧链有半胱胺酸和甲硫胺酸。较佳的保守性氨基酸取代基群有：缬胺酸-白胺酸-异白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、离胺酸-精胺酸、丙胺酸-缬胺酸、麸胺酸-天门冬胺酸及天门冬酰胺酸-麸酰胺酸。另外，保守性置换为在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250对数概似矩阵中具有正值之任何变化。「中度保守性」置换为在PAM250对数概似矩阵中具有非负值之任何变化。

多肽之序列类似性，其亦称为序列相同度，可使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至各种取代、删除和其他修饰作用(包括保守性氨基酸取代)之类似性度量值配出类似的序列。例如，GCG软件含有例如Gap和Bestfit程序，其可以内定参数用于测定密切相关的多肽间，例如来自不同生物物种之同源多肽，或介于野生型和其突变蛋白之序列同源性或序列相同度。参见，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用内定或建议参数，GCG Version 6.1内的程序来作比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜寻序列间最佳重迭区之比对和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。当本发明序列与含有较大量来自不同物种的序列数据库作比较时，另一较佳的算法为使用内定参数之计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402)。

pH-依赖结合

本发明包括具有pH-依赖结合特性之抗-CD3/抗-CD20抗体双特异性抗原结合分子。例如，本发明之抗-CD3抗体在酸性pH时，相较于中性pH，可能出现与CD3结合降低。另外，本发明之抗-CD3抗体在酸性pH时，相较于中性pH，可能出现与CD3结合增加。「酸性pH」一词系包括低于约6.2之pH值，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低。如文中所用，「中性pH」一词系指约7.0至约7.4之pH。「中性pH」一词系包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4之pH值。

在特定的情况下，「相较于中性pH，在酸性pH时.....结合降低」系藉由在酸性pH时抗体与其抗原结合之K_D值和在中性pH时抗体与其抗原结合之K_D值的比率(或反之亦然)来表示。例如，抗体或其抗原结合片段在酸性pH时，相较于中性pH，就本发明之目的，若抗体或其抗原结合片段出现约3或更大之酸性/中性K_D比率，可能被视为出现与CD3结合降低。在特定的例示性实施例中，本发明之抗体或其抗原结合片段的酸性/中性K_D比率可为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。

具有pH-依赖结合特性之抗体可，例如藉由在酸性pH时，相较于中性pH，针对与特定抗原之结合降低(或提高)，筛选一抗体群组来取得。另外，氨基酸层级之抗原结合区的修饰作用可能产生具有pH-依赖结合特性之抗体。例如，藉由将一或多个抗原结合区的氨基酸(例如在CDR内)以组胺酸残基取代，可得到相对于中性pH，在酸性pH时具有抗原结合降低之抗体。

Fc受体结合

系提供包括一嵌合的Fc区之本发明抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子及抗体，该嵌合的Fc区，例如系衍生自不同IgG同型及具有有关Fc受体结合和活化之独特性质的Ig重链之绞链-CH2-CH3恒定区。本发明之特定的Fc区系经工程化以包括一嵌合的绞链。

术语「嵌合的」如文中所用，系指由不同来源之部份所组成。「嵌合蛋白」一词包括第一氨基酸蛋白连接第二氨基酸蛋白，其并非天然正常地连接。氨基酸序列一般可以个别的蛋白存在或以不同的排列存在相同的蛋白上，并以新的排列共同聚集于一融合多肽中。嵌合蛋白可藉由各种本项技术已知的方法来制造，例如藉由化学合成或藉由制造一编码此嵌合蛋白(以所欲的排列)之氨基酸的多核苷酸。例示的嵌合蛋白包括连接IgG之重链区的嵌合绞链序列，以及经工程化用以制造本发明之人类抗体和抗原结合蛋白的融合蛋白。

文中所揭示的嵌合蛋白系设计用来最小化接合点中致免疫表位的产生，例如相较于野生型IgG Fc区。本发明之工程化蛋白因此具有降低的致免疫性，并对Fc受体展现降低的结合，以及不会降低对效应子功能。

术语「绞链」如文中所用，希望系包括连接免疫球蛋白之C_H1区C端与C_H2区N-端之连续的氨基酸残基区。由C_H2外显子所编码之C_H2区N-端的数个氨基酸，亦视为「下绞链」之部份。不受限于理论，IgG1、IgG2和IgG4之绞链区的氨基酸经定性为包括由不同绞链外显子所编码之12-15个连续氨基酸，及数个C_H2区之N端氨基酸(由C_H2外显子所编码)(Brekke,O.H.,等人Immunology Today 16(2):85-90(1995))。在另一方面，IgG3系包括由四个部份所组成之绞链区：1个与IgG1之绞链区相似的上绞链部份及3个IgG3特有的相同氨基酸重复之部份。

术语「嵌合绞链」如文中所用，希望系包括一包含衍生自一Ig分子之绞链区的第一氨基酸序列和衍生自不同种类或亚类Ig分子之绞链区的第二氨基酸序列。本发明之例示性嵌合绞链包括一衍生自人类IgG1绞链区或人类IgG4绞链区之第一氨基酸序列或「上绞链」，及一衍生自人类IgG2绞链区之第二氨基酸序列或「下绞链」。在特定的实施例中，第一或「上绞链」序列系包括来自EU编号之位置216至227的氨基酸残基。在某些实施例中，此第二或「下绞链」序列系包括来自EU编号之位置228至236的氨基酸残基。

就本揭示文之目的，「上绞链」区希望系包括EU编号之位置216至227的氨基酸残基(Kabat编号为位置226至240之氨基酸残基)(参见图1)。「下绞链」区希望系包括EU编号之位置228至236的氨基酸残基(Kabat编号为位置241至2499之氨基酸残基)(参见图1)。

为了本发明施行者之方便，在本揭示文中，人类IgG1、IgG2和IgG4之绞链区的氨基酸在本文中已藉由Kabat之EU编号系统标出(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版.US Department of Health and Human Services,NIH publication No.91-3242(1991))，亦称为「EU编号」或「EU索引」，如根据Scientific Chart,the international ImMunoGeneTics informationhttp://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html最近更新，创立：200年5月17日，最近更新2013年1月10日。

就人类IgG1、IgG2和IgG4绞链氨基酸之EU编号和IMGT独特区域编号，IMGT外显子编号，以及Kabat编号惯例(亦参见Kabat,E.A.等人,1991,前文)之间的对应性系描述于下表A至F中：

表A：IgG1绞链编号

表B：IgG1 C‐区绞链编号

表C：IgG2绞链编号

表D：IgG2 C‐区绞链编号

表E：IgG4绞链编号

表F：IgG4 C‐区绞链编号

由外显子剪接所形成的氨基酸系如括号中所示。

-系指无对应的编号提出

--系指在此位置为对应的氨基酸

^a根据最近更新的IMGT Scientific Chart编号

^b根据如Kabat,EA,等人1991中所提出的EU索引编号

亦参见，例如Lefranc,M.-P.等人,Devel Comp Immunol,29,185-203(2005)；及Edelman,G.M.等人PNAS USA,63:78-85(1969)。

术语「结合」就抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc蛋白与例如预先确定的抗原或与FcγR结合之情况，典型地系指最少二个实体或分子结构之间的相互作用或结合，例如抗体-抗原相互作用或含Fc-蛋白对FcγR。

例如，结合亲和力，当例如以表面电浆共振(SPR)技术于BIAcore3000仪器中使用抗原或作为配体及以抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc蛋白作为分析物(或抗配体)来测定时，典型地系相当于约10^-7M或更低，例如约10^-8M或更低，例如约10^-9M或更低之K_D值。因此，抗体或其他结合蛋白与预先决定的抗原或受体系以相当于比其与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合之亲和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少100,000倍之K_D值结合。

术语「K_D」(M)，如文中所用，系指特定的抗体-抗原相互作用之裂解平衡常数，或抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc蛋白与FcγR之裂解平衡常数。K_D和结合亲和力之间具有逆相关性，因此较小的K_D值，较高的，亦即较强的亲和力。因此，术语「较高的亲和力」或「较强的亲和力」系关于较高形成相互作用的能力且因此为较小的K_D值，而反之，术语「较低的亲和力」或「较弱的亲和力」系关于较低形成相互作用的能力且因此为较大的K_D值。在某些情况下，特定分子(例如抗体)与其相互作用的伙伴分子(例如受体X)之较高的结合亲和力(或K_D)，相较于此分子(例如抗体)与另外的伙伴分子(例如受体Y)之结合亲和力，可以较大K_D值(较低或较弱亲和力)除以较小K_D(较高或较强亲和力)所测定的结合比率来表示，或例如以大于5-倍或10-倍的结合亲和力来表示，视情况而定。

术语「K_d」(sec-1或1/s)，如文中所用，系指特定的抗体-抗原交互作用之裂解速率常数，或抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc蛋白与FcγR之裂解速率常数。

术语「K_a」(M-1x sec-1或1/M)，如文中所用，系指特定的抗体-抗原交互作用之结合速率常数，或抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc蛋白与FcγR之结合速率常数。

术语「K_A」(M-1或1/M)，如文中所用，系指特定的抗体-抗原交互作用之结合平衡常数，或抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc蛋白与FcγR之结合平衡常数。结合平衡常数系由k_a除以k_d所得来。

术语「EC50」或「EC₅₀」，如文中所用，系指半数最大有效浓度，其包括引发基线至一特定暴露时间后最大量间之半数反应的抗体浓度。EC₅₀基本上系代表其中观察到50％之其最大效用的抗体浓度。因此，随着EC₅₀或半数最大有效浓度值增加，会观察到结合降低。

在一实施例中，结合降低可定义为：能与半数最大量之目标细胞结合的EC₅₀抗体浓度增加。

在某些实施例中，细胞毒性活性，例如ADCC或CDC降低，可定义为能裂解半数最大量目标细胞之EC₅₀抗体浓度增加。细胞毒性测定为细胞毒性百分比，或裂解百分比其为在一钙黄绿素(calcein)释放分析中观察到裂解的总细胞群族之分量。细胞毒性百分比可如实例6中所述来测量。

在其他的实施例中，增生降低可定义为使半数最大量目标细胞增生之EC₅₀抗体浓度增加。

「效应子功能」一词，如文中所用，希望系包括由含Fc-蛋白因与FcγR结合所赋予的功能性能力。不受限于理论，Fc/FcγR复合物之形成招募了各种效应子细胞至结合抗原的位置，典型地在细胞内产生种种的讯号传递事件及重要的后续免疫反应。

本发明之含嵌合Fc抗原结合蛋白及抗体，相较于对应的含野生型Fc抗原结合蛋白或抗体，展现改变或降低的效应子功能，参见，例如2014年8月7日公开的PCT公开案号WO 2014/121087，其系以全文引用的方式并入。

在某些实施例中，降低或改变的效应子功能为一细胞毒性效应子功能，例如细胞毒性、补体-依赖细胞毒性(CDC)或抗体-依赖细胞毒性(ADCC)。在一实施例中，此降低或改变的效应子功能为补体-依赖细胞毒性(CDC)。在另外的实施例中，此降低或改变的效应子功能为抗体-依赖细胞毒性。在其他的实施例中，此降低或改变的效应子功能为目标细胞之细胞增生。

数种抗体效应子功能至少部份系由在特定免疫球蛋白的恒定区中(特别是CH2和CH3区)与抗体的Fc区结合之Fc受体(FcRs)所媒介。有许多对不同种类的免疫球蛋白，亦即IgG、IgE、IgA、IgM和IgD具特异性之Fc受体。人类IgG Fc受体家族系分成三组：FcγRI(CD64)，其能以高亲和力与IgG结合，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)二者为低亲和力受体。各FcγR亚类系由二或三个基因所编码，及替代的RNA剪接导致多重转录，因此有广泛多样性FcγR同型存在(例如FcγRIA(CD64；FCGR1A)，FcγRIB(CD64；FCRG1B)，FcγRIIA(CD32A；FCGR2A)，FcγRIIB(CD32B；FCGR2B)，FcγRIIC(CD32C；FCGR2C)，FcγRIIIA(CD16a；FCGR3A)和FcγRIIIB(CD16b；FCGR3B))。另外，FcRn或新生儿Fc受体(亦称为Fc受体转运子,α或FCGRT)能经由胎盘将IgG抗体从母体转移到胎儿。再者，Fc受体系表现在各种细胞，包括，例如B细胞、单核细胞、树突细胞、嗜中性细胞及特定的淋巴细胞。例如，U937细胞，一种人类单核细胞株系表现FcγRI和FcγRIIA二者(参见，例如Jones,等人J Immunol135(5):3348-53(1985)；及Brooks,等人J Exp Med 170:1369-85(1989年10月))。文中所指的各受体，包括任何已知功能形式的受体，其包括转录变体、同型和多形物。

Ig Fc与其受体结合将这些效应子细胞带到结合抗原的位置，最后产生各种讯号传递和免疫反应，包括B细胞活化、发炎反应、细胞毒性反应和吞噬细胞反应。如此一来，Ig Fc与其受体之降低或改变的结合可能造成效应子功能降低。

「抗体-依赖的细胞吞噬作用」或「ADCP」一词系关于藉由吞噬目标细胞而非引发细胞毒性来消除(或杀死)目标细胞之效应子功能。ADCP可能为活体内杀死肿瘤标之一重要的机制。ADCP可藉由双色荧光流式细胞仪方法来测量，例如利用，例如PKH2(绿色荧光染剂)及藻红素-接合的(红色)单株抗体对抗不同的细胞表面表面蛋白，用以分化受检测细胞之方法，从而测定吞噬细胞活性及吞噬作用的速率。ADCP测量已为本项技术所熟知。相对于FcγRIIB选择性FcγRIIA活化之治疗策略可能增进巨噬细胞吞噬活性(Richards,JO,等人2008Mol Cancer Ther 7(8):2517-27)。本发明之含嵌合的Fc区抗原结合蛋白和抗体系结合及活化人类FcγRIIA。在特定的情况下，本发明之抗原结合蛋白和抗体系以高于此抗体结合FcγRIIB之亲和力与人类FcγRIIA结合。在某些实施例中，此抗体展现对人类FcγRIIA之亲和力系比此抗体与人类FcγRIIB之结合亲和力强约5-倍，此亲和力值系以K_D表示。在其他的实施例中，此抗体展现对人类FcγRIIA之亲和力系比此抗体与人类FcγRIIB之结合亲和力强约6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-或20-倍。

抗体和双特异性抗原结合分子之生物特性

本发明系包括与人类CD3和CD20结合之抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括以低于约60nM之EC₅₀值与Jurkat细胞(CD3+)和Raji细胞(CD20+)结合之抗-CD3xCD20抗体，如藉由活体外结合分析，例如使用文中实例3所定义的分析模式(例如评估抗-CD3xCD20抗体与Jurkat细胞或Raji细胞之结合)或实质上类似的分析所测量。在特定的实施例中，本发明之抗体或抗原结合片段，如藉由活体外结合分析，例如使用文中实例4所定义的分析模式或实质上类似的分析所测量，系以低于约75nM，低于约70nM，低于约65nM，低于约60nM，低于约50nM，低于约40nM，低于约30nM，或低于约25nM之EC₅₀值与细胞(例如Jurkat细胞及/或Raji细胞)表面的CD3或CD20结合。

本发明包括能同时结合人类CD3和人类CD20之双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)。根据特定的实施例，本发明之双特异性抗原结合分子系专一与表现CD3及/或CD20之细胞相互作用。双特异性抗原结合分子与表现CD3及/或CD20之细胞结合的程度可藉由荧光活化的细胞分类(FACS)，如文中实例中所示来评估。例如，本发明系包括专一结合表现CD3之人类T-细胞株(例如Jurkat)、表现CD20之人类B细胞株(例如Raji)及灵长类T细胞(例如猕猴外围血液单核细胞[PBMC])之双特异性抗原结合分子。本发明系包括，如使用实例4中所述的FACS分析或实质上类似的分析所测量，以从约8.74x10^-6至约5.99x10^-8或更低之EC₅₀值与任何前述细胞及细胞株结合之双特异性抗原结合分子。

本发明亦包括与人类CD3结合及引发T-细胞媒介的杀死肿瘤细胞之抗体及其抗原结合片段。例如，本发明系包括抗-CD3xCD20抗体，其如活体外T-细胞媒介的杀死肿瘤细胞分析，例如使用文中实例5中所定义的分析模式(例如在抗-CD3抗体的存在下评估Raji肿瘤细胞被人类PBMC杀死之程度)或实质上类似的分析所测量，系以低于约60pM之EC₅₀值引发T-细胞媒介的杀死肿瘤细胞。在特定的实施例中，本发明之抗体或抗原结合片段，如活体外T-细胞媒介的杀死肿瘤细胞分析，例如使用文中实例5中所定义的分析模式或实质上类似的分析所测量，系以低于约56pM，低于约50pM，低于约45pM，低于约40pM，低于约35pM，低于约30pM，低于约25pM，低于约20pM，低于约15pM，低于约10pM，低于约5pM，或低于约1pM之EC₅₀值引发T-细胞媒介的杀死肿瘤细胞(例如PBMC-媒介的杀死Raji细胞)。

本发明亦包括与人类CD3/CD20结合及引发补体-依赖的细胞毒性(CDC)之抗体及其抗原结合片段，虽然比具有野生型IgG Fc区之抗体在程度上效低。例如，本发明包括，如活体外T-细胞媒介的肿瘤细胞致死分析，例如使用文中实例6中所定义的分析模式(例如，在补体及抗-CD3xCD20抗体的存在下，评估杀死目标细胞(Raji或Daudi)的程度)或实质上类似的分析所测量，以低于约50％之细胞毒性百分比(％细胞毒性或％系胞裂解)引发CDC杀死Raji或Daudi(CD20-表现)细胞之抗-CD3xCD20抗体。在特定的实施例中，本发明之抗体及抗原结合片段，如活体外补体-媒介的细胞致死分析，例如使用文中实例6中所定义的分析模式或实质上类似的分析所测量，系以低于约45％，低于约40％，低于约35％，低于约30％，低于约25％，低于约20％，低于约15％，低于约10％，低于约5％，低于约1％之细胞毒性百分比，低于背景细胞毒性或无可侦测的细胞毒性，引发CDC细胞致死(例如补体-媒介的杀死Raji或Daudi细胞)。

本发明亦包括与人类CD3/CD20结合，而相较于具有野生型IgG Fc区的抗体，不会显著引发抗体-依赖的细胞媒介细胞毒性(ADCC)之抗体及其抗原结合片段。例如，本发明系包括，如活体外NK细胞媒介的细胞致死分析，例如使用文中实例7中所定义的分析模式(例如，在NK细胞及抗-CD3xCD20抗体的存在下，评估目标细胞致死(Raji或Daudi)的程度)或实质上类似的分析所测量，带有低于约20％的细胞毒性百分比(％细胞毒性或％系胞裂解)不具有可感知杀死Raji或Daudi(CD20-表现)细胞的抗-CD3xCD20抗体。实质上类似的分析可包括NK细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞或其他FcγRIII-表现细胞，包括表现变体FcγRIII之细胞的存在。在特定的实施例中，本发明之抗体或抗原结合片段，如活体外FcγRIII-媒介的肿瘤细胞致死分析，例如使用文中实例7中所定义的分析模式或实质上类似的分析所测量，不具有可侦测的ADCC活性(例如，NK细胞或FcγRIII-媒介的杀死Raji或Daudi细胞)，带有低于约30％，低于约25％，低于约20％，低于约15％，低于约10％，低于约5％，低于约1％之细胞毒性百分比，低于背景细胞毒性或无可侦测的细胞毒性。

根据特定的实施例，本发明系包括，如表面电浆子共振，例如使用文中实例8所定义的分析模式所测量，以低于约23.5μM之K_D值与人类FcγRIIA(例如在25℃)结合之抗体及抗体之抗原结合片段。在特定的实施例中，本发明之抗体或抗原结合片段，如以表面电浆子共振，例如使用文中实例8所定义的分析模式(例如，mAb-捕捉或抗原捕捉模式)或实质上类似的分析所测量，系以低于约20.5μM，低于约20μM，低于约19.3μM，低于约18μM，低于约17μM，低于约16μM，低于约15μM，低于约10μM，低于约9μM，低于约8μM，低于约7μM，低于约6μM，低于约5μM，低于约4μM，低于约3μM，低于约2μM，低于约1μM，低于约900nM，低于约800nM，或低于约700nM之K_D值与FcγRIIA结合。

根据特定的实施例，本发明系包括，如表面电浆子共振，例如使用文中实例8所定义的分析模式所测量，以低于约233μM之K_D与人类FcγRIIB结合(例如于25℃)之抗体及抗体的抗原结合片段。在特定的实施例中，在特定的实施例中，本发明之抗体或抗原结合片段，如表面电浆子共振，例如使用文中实例8所定义的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或实质上类似的分析所测量，系以低于约200μM，低于约190μM，低于约180μM，低于约170μM，低于约160μM，低于约150μM，低于约140μM，低于约130μM，低于约125μM，低于约123μM，低于约120μM，低于约110μM，低于约100μM，低于约90μM，低于约80μM，低于约70μM，低于约60μM，低于约50μM，或低于约40μM之K_D值与FcγRIIB结合。

本发明亦包括，如表面电浆子共振于25℃或37℃，例如使用文中实例9所定义的分析模式或实质上类似的分析所测量，系以大于约8天的裂解半衰期(t1/2)与CD3xCD20结合之抗体及其抗原结合片段。在特定的实施例中，此抗体，如表面电浆子共振于25℃或37℃，例如使用文中实例9所定义的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或实质上类似的分析所测量，系具有大于约5天，大于约6天，大于约7天，大于约8天，大于约9天，大于约10天，大于约11天，大于约12天，大于约13天，大于约14天，大于约15天，或大于约20天之t1/2。

本发明亦包括，在一或多个由下列组成之群中选出的分析中不具有实质活性之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子：(a)活体外引发PBMC增生；(b)CDC细胞毒性(参见，例如文中实例6)；(d)ADCC(参见，例如文中实例7)。

本发明亦包括，在一或多个由下列组成之群中选出的分析中具有实质活性之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子：(a)在猕猴中去除B-细胞(例如，CD45+/CD20+B-细胞)(参见，例如文中实例10和11)；(b)在免疫缺陷小鼠模型中降低B-细胞肿瘤体积(例如Raji肿瘤体积)(参见，例如实例12A)；及(c)在带有已建立肿瘤的小鼠模型中消退肿瘤(参见，例如实例12B)。

本发明包括能于一患者中去除B细胞之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子(参见，例如实例10)。例如，根据特定的实施例，系提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中系将双特异性抗原结合分子单一投予一患者(例如以约1mg/kg，约0.9mg/kg，约0.8mg/kg，约0.7mg/kg，约0.6mg/kg，约0.5mg/kg，约0.4mg/kg，约0.3mg/kg，约0.2mg/kg，约0.1mg/kg，约0.08mg/kg，约0.06mg/kg，约0.04mg/kg，约0.03mg/kg，约0.02mg/kg，约0.01mg/kg或更低的剂量)，使此患者之B细胞数目下降(例如由此患者所采集的血液样本中)至可侦测量以下。在特定的实施例中，单一投予约0.1mg/kg剂量之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，系在将双特异性抗原结合分子投予此患者后约第7天、约第6天、约第5天、约第4天、约第3天、约第2天、约第1天，使此患者之B系胞数目下降至可侦测量以下。根据特定的实施例，单一投予约0.01mg/kg剂量之本发明抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，在投予后，直到至少约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天或更多天，使此B系胞数目仍在可侦测量以下。如文中所用，「可侦测量以下」一词系指从患者抽取的血液样本中，使用标准的B细胞侦测分析，例如文中实例10中所述之B细胞标记的FACS分析，无直接或间接侦测到B细胞。

本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，当投予一患者，其造成不超过一次过渡性T细胞降低。例如，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，当以约0.01mg/kg，或约0.1mg/kg，或约1mg/kg之剂量投予一患者时，在投予后第1天造成T细胞数目下降，但其中每微升血液之T细胞数目在之后的时间点即回复(例如在投予后约第2天、第4天、第7天、第14天、第28天或之后)。例如，本发明系提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中在投予约0.01mg/kg，或约0.1mg/kg，或约1mg/k剂量之抗原结合分子至一患者后约第4天至约第7天，如使用标准的T-细胞侦测分析，例如文中实例10中所述，用于T-细胞标记之FACS分析所测，从该患者抽出的每微升血液之T细胞，系等于或大于投予双特异性抗原结合分子之前由该患者抽出的每微升血液之T细胞数目。

表位定位及相关技术

与本发明抗原结合分子结合之CD3上或CD20上的表位可由3或多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多)CD3蛋白之氨基酸的单一连续序列所组成。另外，表位可由多数个CD3或CD20之非连续氨基酸(或氨基酸序列)所组成。本发明之抗体可与包含在单一CD3链(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)内的氨基酸相互作用，或可与二或多条不同CD3链上的氨基酸相互作用。术语「表位」，如文中所用，系指与抗体分子可变区中称为补位(paratope)的特定抗原结合位置相互作用之抗原决定位。单一抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可具有不同的生物效应。表位可为构型或线性。构型表位系由直链多肽链不同线段之空间上并列的氨基酸所产生。线性表位系由多肽链相邻的氨基酸残基所产生。在特定的情况下，表位可包括抗原上的醣类基团、磷酰基基团或磺酰基基团。

本项技术之一般技术者已知的各种技术皆可用于测定抗体之抗原结合区是否与多肽或蛋白内的「一或多个氨基酸交互作用」。例示的技术包括，例如习用的交叉阻断分析，例如描述于Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中，丙胺酸扫描突变分析、胜肽墨点分析(Reineke(2004),Methods Mol Biol 248：443-463)及胜肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化学修饰等方法(Tomer(2000)Protein Science9：487-496)。可用于辨识多肽内与抗体之抗原结合区相互作用之氨基酸的另外方法系以质谱侦测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法系包括以氘标定所指的蛋白，接着让抗体与氘标定的蛋白结合。接着，将蛋白/抗体复合物转置于水中，让除了受抗体保护的残基(其仍为氘标定)以外的所有残基发生氢-氘交换。裂解抗体后，将目标蛋白以蛋白酶裂解并以质谱分析，藉此找出氘标定残基，其系相当于与抗体交互作用之特定氨基酸。参见，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。抗原/抗体复合物之X-光晶体学亦可用于表位定位之目的。

本发明进一步系包括与任何文中所述之特定例示性抗体相同之表位结合的抗-CD3抗体(例如，包括如文中表1所述之任何胺基序的抗体)。同样的，本发明亦包括与任何文中所述之特定例示性抗体(例如，包括如文中表1所述之任何胺基序的抗体)竞争与CD3结合之抗-CD3抗体。

本发明亦包括双特异性抗原结合分子，其系包含专一与人类CD3结合之第一抗原结合区，及专一与人类CD20结合之第二抗原结合区，其中第一抗原结合区系与任何文中所述之特定例示性CD3-专一抗原结合区相同之CD3上的表位结合，及/或其中第二抗原结合区系与任何文中所述之特定例示性CD20-专一抗原结合区相同之CD20上的表位结合。

同样地，本发明亦包括双特异性抗原结合分子，其包含专一与人类CD3结合之第一抗原结合区，及专一与人类CD20结合之第二抗原结合区，其中第一抗原结合区系与任何文中所述之特定例示性CD3-专一抗原结合区竞争与CD3之结合，及/或其中第二抗原结合区系与任何文中所述之特定例示性CD20-专一抗原结合区竞争与CD20之结合。

在一方面，本发明系包括其中第一抗原结合区系与参照的抗原结合区竞争与人类CD3结合之双特异性抗体，其系包括三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3)及三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3)，其中(i)A1-HCDR1系包括SEQ ID NO：12之氨基酸列；(ii)A1-HCDR2系包括SEQ ID NO：14之氨基酸列；(iii)A1-HCDR3系包括SEQ ID NO：16之氨基酸列；(iv)A1-LCDR1系包括SEQ ID NO：20之氨基酸列；(v)A1-LCDR2系包括SEQ ID NO：22之氨基酸列；及(vi)A1-LCDR3系包括SEQ ID NO：24之氨基酸列。在某些案例中，双特异性抗体系包括与参照抗原结合区竞争和人类CD3结合之第一抗原结合区，其系包括(i)SEQ ID NO：10之重链可变区(HCVR)氨基酸序列，及(ii)SEQ ID NO：18之轻链可变区(LCVR)氨基酸序列。

在另外方面，本发明系包括其中第二抗原结合区系与参照的抗原结合区竞争与人类CD20结合之双特异性抗体，其系包括三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)及三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)，其中(i)A2-HCDR1系包括SEQ ID NO：4之氨基酸序列；(ii)A2-HCDR2系包括SEQ ID NO：6之氨基酸序列；(iii)A2-HCDR3系包括SEQ ID NO：8；(iv)A2-LCDR1系包括SEQ ID NO：20之氨基酸序列；(v)A2-LCDR2系包括SEQ ID NO：22之氨基酸序列；及(vi)A2-LCDR3系包括SEQ ID NO：24之氨基酸序列。在某些案例中，双特异性抗体系包括与参照抗原结合区竞争和人类CD20结合之第二抗原结合区，其系包括(i)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列之重链可变区(HCVR)，及(ii)包含SEQ ID NO：18氨基酸序列之轻链可变区(LCVR)。

在另外方面，本发明系包括一具有与参照的抗原结合蛋白竞争与人类CD3结合之第一抗原结合区的双特异性抗体，该第一抗原结合区系包括(i)一包含SEQ ID NO：10氨基酸序列之重链可变区(HCVR)，及(ii)一包含SEQ ID NO：18氨基酸序列之轻链可变区(LCVR)；并具有与参照的抗原结合蛋白竞争与人类CD20结合之第二抗原结合区，其系包括(iii)一包含SEQ ID NO：2氨基酸序列之重链可变区(HCVR)，及一包含SEQ ID NO：18氨基酸序列之轻链可变区(LCVR)。

藉由使用本项技术中已知的习用方法，可容易地测定特定的抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合区是否与本发明之参照抗原结合分子相同的表位结合或是与其竞争结合。例如，测定试验抗体是否与如同本发明参照的双特异性抗原结合分子之CD3(或CD20)上的相同表位结合，首先系让参照的双特异性分子与CD3蛋白(或CD20蛋白)结合。接着，评估试验抗体与CD3(或CD20)分子结合之能力。若试验抗体在与参照的双特异性抗原结合分子饱和结合后，能与CD3(或CD20)结合，则其可结论出，该试验抗体系与不同于参照的双特异性抗原结合分子的CD3(或CD20)表位结合。另一方面，若试验抗体在与参照的双特异性抗原结合分子饱和结合后，不能与CD3(或CD20)分子结合，则试验抗体可能与和本发明之参照的双特异性抗原结合分子结合的表位相同之CD3(或CD20)表位结合。然后可进行另外例行的实验(例如胜肽突变和结合分析)，以确定所观察到无试验抗体结合事实上是否系由于与和参照的双特异性抗原结合分子相同的表位结合所致，或是否系因立体阻断(或另外的现象)造成无观察到结合。此类实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或本项技术中可取得的任何其他量性或质性抗体-结合分析来进行。依照本发明特定的实施例，如于竞争性结合分析中所测，若例如一1-、5-、10-、20-或100-倍过量的抗原结合蛋白抑制另一抗体之结合至少50％，但较佳地75％、90％或甚至99％，则二种抗原结合蛋白系与相同(或重迭)的表位结合(参见，例如Junghans等人,Cancer Res.1990 50：1495-1502)。另外，若基本上降低或消除一抗原结合蛋白之结合的抗原中所有的氨基酸突变，系降低或消除另一种抗原结合蛋白之结合，则二种抗原结合蛋白被认为系与相同的表位结合。若仅一亚群的氨基酸突变降低或消除一抗原结合蛋白之结合或消除另一种抗原结合蛋白之结合，则二种抗原结合蛋白被认为具有「重迭的表位」。

为了测定一抗体或其抗原结合区是否与参照的抗原结合分子竞争结合，系以二个方向进行上述结合方法：第一个方向：让参照的抗原结合分子在饱和的条件下与CD3蛋白(或CD20蛋白)结合，接着评估试验抗体与CD3(或CD20)分子之结合。第二个方向：让试验抗体在饱和的条件下与CD3(或CD20)分子结合，接着评估参照的抗原结合分子与CD3(或CD20)分子之结合。若在二个方向中，仅有第一(饱和)抗原结合分子能与CD3(或CD20)分子结合，则结论出试验抗体和参照的抗原结合分子系竞争与CD3(或CD20)结合。本项技术之一般技术者应了解，与参照的抗原结合分子竞争结合之抗体可能不一定系与参照抗体相同之表位结合，但可能藉由与重迭或相邻的表位结合，在立体上阻断参照抗体之结合。

制备抗原结合区及建构双特异性分子

对特定抗原具特异性之抗原结合区可藉由任何本项技术中已知的抗体生产技术来制备。一旦获得后，对二种不同抗原(例如CD3和CD20)具特异性之二种不同的抗原结合区可以相对彼此适合的排列使用习用方法，产生本发明之双特异性抗原结合分子。(可用于建构本发明双特异性抗原结合分子之例示的双特异性抗体模式之论述系提供于文中他处)。在特定的实施例中，本发明之多特异性抗原结合分子的一或多个个别组份(例如重链和轻链)系衍生自嵌合、人源化或全人类抗体。制造此等抗体之方法已为本项技术所熟知。例如，可使用VELOCIMMUNE^TM技术制备一或多条本发明双特异性抗原结合分子之重链及/或轻链。使用VELOCIMMUNE^TM技术(或任何其他人类抗体生产技术)，起初先分离对特定抗原(例如CD3或CD20)具高亲和力之具有人类可变区和小鼠恒定区的嵌合抗体。将抗体定性并就所欲的性质来选择，包括亲和力、选择性、表位等。以所欲的人类恒定区置换小鼠恒定区产生本发明全人类抗体，及/或轻链其可并入本发明之双特异性抗原结合分子中。

基因工程动物可用于制造人类双特异性抗原结合分子。例如，可使用不能重排和表现内生性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列之基因改造小鼠，其中小鼠仅表现一或二个由人类免疫球蛋白序列操作上在内生性小鼠κ基因座连接小鼠κ轻链恒定基因所编码的人类轻链可变区。此基因改造小鼠可用于制造包括链接相同轻链之二种不同重链的全人类双特异性抗原结合分子，该轻链系包括衍生自二种不同人类轻链可变区基因片段其中一种之可变区。(参见，例如US 2011/0195454就此工程化小鼠详细论述及将其用于制造双特异性抗原结合分子)。

生物等效性

本发明系涵盖具有与文中所揭示的例示分子不同但保留与CD3及/或CD20结合能力之氨基酸序列的抗原结合分子。此等变体分子，当与亲代序列相比较时，可包括一或多个氨基酸之添加、删除或取代，但具有与所述的双特异性抗原结合分子实质上相当之生物活性。

本发明系包括与文中所述的任何例示性抗原结合分子为生物等效之抗原结合分子。二种抗原结合蛋白或抗体，若例如其为医药同等物或医药替代品，当于类似的实验条件下以单一剂量或多剂量之相同的莫耳剂量投予时，其吸收速率和程度并无显示显著的差异，则系视为生物等效的。某些抗原结合蛋白若其吸收程度相当但是吸收速率不同应可视为等效物或医药替代品，且仍可视为生物等效，因为此等吸收速率上的差异为故意的并反映在标示上，对于达到例如长期使用之有效体药浓度并非必要的，且就特定药物产品的研究上被视为无医疗上的显著性。

在一实施例中，二种抗原结合蛋白若在其安全性、纯度及效力上不具有临床上有意义的差异，则为生物等效的。

在一实施例中，若相较于无此变更之持续治疗，病患可在参照产品和生物产品间作一或多次变更而无预期的有害效应之风险增加(包括临床上致免疫性之明显改变或效用减低)，则二种抗原结合蛋白为生物等效的。

在一实施例中，若二种抗原结合蛋白系藉由共同的机制或作用机制作用于症状或所用症状，而达到此等机制已知的程度，则二者系为生物等效的。

生物等效性可藉由活体内和活体外方法来验证。生物等效性测量包括，例如(a)人类或其他哺乳动物之活体内试验，其中系测量血液、血浆、血清或其他生物体液中随时间变化之抗体或其代谢物浓度；(b)与人类活体内生物可利用性数据有相互关系及可合理预测此数据之活体外试验；(c)人类或其他哺乳动物之活体内试验，其中系测量随时间变化之抗体(或其目标)的适当急性药理效用；及(d)已建立抗原结合蛋白之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好对照的临床试验。

文中所述之例示性双特异性抗原结合分子的生物等效变体可藉由，例如制造各种残基或序列之取代，或删除生物活性不需要的末端或内部残基或序列来建构。例如，生物活性不需要的半胱胺酸残基可删除或以其他的氨基酸置换，以防止因变性而形成不必要或不正确的分子内双硫桥。在其他内容中，生物等效的抗原结合蛋白可包括文中所述之例示性双特异性抗原结合分子的变体，其系包含修饰分子之糖基化特性的氨基酸改变，例如消除或移除糖基化之突变。

物种选择性和物种交叉反应

根据本发明特定的实施例，系提供与人类CD3结合但不与其他物种CD3结合之抗原结合分子。亦提供与人类CD20结合但不与其他物种CD20结合之抗原结合分子。本发明亦包括与人类CD3及来自一或多种非人类物种之CD3结合的抗原结合分子；及/或与人类CD20及来自一或多种非人类物种之CD20结合的抗原结合分子。

根据本发明特定的例示性实施例，系提供与人类CD3及/或人类CD20结合，以及可或不可与(视情况而定)一或多种小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩CD3及/或CD20结合之抗原结合分子。例如，在本发明特定的例示性实施例中，系提供包括与人类CD3和猕猴CD3结合之第一抗原结合区及专一与人类CD20结合之第二抗原结合区的双特异性抗原结合分子。

免疫接合物

本发明涵盖与疗效成份，例如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素接合之抗原结合分子(免疫接合物)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害之试剂。用于形成免疫接合物之适合的细胞毒性剂及化疗剂实例已为本项技术所知(参见，例如WO 05/103081)。

治疗调配物及给药

如文中所用，术语「有效量」和「治疗上有效量」系指活性治疗剂之量，在无过份的有害副作用，例如毒性、刺激性或过敏反应下，足以产生所欲的治疗反应。特定的「有效量」明显地将依此等因子，例如所欲治疗之特定症状、病患的生理状况和所欲治疗的动物种类、治疗持续时间、同时治疗(若有)之性质和所用的特定调配物以及化合物结构或其衍生物而不同。在此情况下，若其造成下列一或多项(但不限)，则此量应视为治疗上有效的：(a)抑制肿瘤生长(例如，B-细胞癌症)；及(b)反转或安定B-细胞癌症。

投予病患之抗原结合分子的剂量可依照病患的年龄和体型大小、标的疾病、症状、给药路径及其类似因素而不同。较佳的剂量典型地系根据体重或体表面积来计算。当本发明之双特异性抗原结合分子系用于成人病患之治疗目的时，有利的一般可以静脉给予约0.01至约20毫克/kg体重，更佳地约0.02至约7，约0.03至约5，或约0.05至约3毫克/kg体重之单一剂量的本发明双特异性抗原结合分子。依照症状之严重度，治疗之频率和治疗持续时间可调整。给予双特异性抗原结合分子之有效剂量和时程可依经验来决定；例如可以定期评估来监看病患进步，并据此调整剂量。再者，物种间剂量之衡量可使用本项技术熟知的方法来进行(例如Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.8：1351)。

各种的递送系统已为所知并可用于投予本发明之医药组成物，例如包胶之微脂体、微粒、微胶囊、能表现突变病毒之重组细胞、受体媒介的内吞作用(参见，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。导入方法包括(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服路径。组成物可以任何方便的路径，例如以输注或团注、以经由上皮或黏膜层(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收来给药，并可与其他生物活性剂共同给药。给药可为全身性或局部的。.

本发明之医药组成物可以标准针或注射器由皮下或静脉内来递送。此外，就皮下递送而言，笔型递送装置可容易地用于递送本发明之医药组成物。此笔型递送装置可为重复使用型或抛弃型。可重复使用的笔型递送装置一般系利用含有医药组成物之可更换补充匣。一旦匣内的所有医药组成物投予后而补充匣变空，此空匣可容易丢弃并更换新的含医药组成物之补充匣。然后此笔型递送装置便可再使用。在抛弃型笔型递送装置中无可置换的补充匣。取而代之的，抛弃型笔型递送装置系预先填充医药组成物收藏在装置内的储槽中。一但医药组成物的储槽变空，整个装置便可丢弃。

许多可重复使用的笔型和自动注射器递送装置已应用于皮下递送本发明之医药组成物。实例包括(但不限于)AUTOPEN^TM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONIC^TM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25^TM笔、HUMALOG^TM笔、HUMALIN 70/30^TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN^TMI,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD^TM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅提出一些。用于皮下递送本发明医药组成物之抛弃型笔型递送装置之实例包括(但不限于)SOLOSTAR^TM笔(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)及KWIKPEN^TM(Eli Lilly)、SURECLICK^TM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLET^TM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRA^TM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅提出一些。

在特定的情况下，医药组成物可以控制释放系统来递送。在一实施例中，可使用帮浦(参见Langer,前文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另外的实施例中，可使用聚合物质；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。又在另外的实施例中，控制释放系统可放置在靠近组成物的目标处，因此仅需要全身剂量之一部分(参见，例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,前文,第2册,pp.115-138)。其他的控制释放系统系论述于Langer,1990,Science 249：1527-1533之评论中。

可注射的制备物可包括用于静脉内、皮下、皮内及肌肉内注射、点滴输注等之剂型。这些可注射制备物可由公开已知的方法来制备。例如，可注射制备物可，例如藉由将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于注射上习用的无菌水性媒剂或油性媒剂中来制备。注射用之水性媒剂有，例如生理食盐水、含葡萄糖之等张溶液和其他佐剂等，其可与适合的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子接口活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油之聚环氧乙烷(50莫耳)加合物)]等组合使用。油性媒剂，可使用芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等组合使用。由此所制备的注射液较佳地系填充于适当的安瓶中。

有利地，上述之口服或非经肠用途之医药组成物系制备成适合活性成份剂量之单位剂型。此等单位剂量之剂型包括，例如锭剂、片剂、胶囊、注射剂(安瓶)、栓剂等。所含的前述抗体之量一般每单位剂量之剂型为约5至约500毫克；特别是注射形式，较佳的前述抗体系含有约5至约100毫而其他剂型为约10至约250毫克。

抗原结合分子之治疗用途

本发明系包括：包含于一有此需要之患者中投予包括专一与CD3和目标抗原(例如CD20)结合之抗-CD3抗体或双特异性抗原结合分子的治疗组成物之方法。此治疗组成物可包括任何文中所揭示之抗体或双特异性抗原结合分子以及医药上可接受之载剂或稀释剂。如文中所用，「有此需要之患者」一词系指具有一或多种癌症之症候或适应症之人类或非人类动物(例如表现肿瘤或患有任何下文所指的癌症之患者)，或另外可从抑制或降低CD20活性或去除CD20+B细胞或消退CD20+B细胞肿瘤而得利者。

本发明之抗体及双特异性抗原结合分子(及包括彼等之治疗组成物)可用于，其中包括，治疗其中刺激、活化及/或以免疫反应为目标应为有利的疾病或病症。特言之，本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子可用于治疗、预防及/或改善任何与CD20表现或活性或CD20+B细胞增生有关或由其所媒介之疾病或病症。达成本发明治疗方法之作用机制系包括在效应子细胞的存在下杀死表现CD20之细胞，例如，藉由细胞凋亡、吞噬作用或藉由二或多种这些机制的组合或类似的细胞毒性机制。可使用本发明之双特异性抗原结合分子抑制或杀死之CD20表现细胞包括，例如致肿瘤B细胞。

降低肿瘤负荷或肿瘤消退包括在患者中一或多个肿瘤之部分或完全消失。请了解，肿瘤消退代表趋向较低的肿瘤负荷或较低的疾病严重状态之倾向。如此一来，消退为逐渐减弱性消除体内可测量的恶性肿瘤。降低肿瘤发展包括部分或完全抑制或压抑另外或新的肿瘤生长。

本发明之抗原结合分子可用于瞄准及治疗，例如发生于脑及脑膜、口咽、肺及支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附属件、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝及泌尿道和特定的感官器官例如眼睛之原生及/或转移肿瘤。在特定的实施例中，本发明之双特异性抗原结合分子可用于治疗一或多种下列癌症：肾细胞癌、胰脏癌、乳癌、头和颈癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、大肠直肠癌、胃癌(例如带有MET增幅之胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑液肉瘤、甲状腺癌或黑色素瘤。根据特定的例示性实施例，本发明之双特异性抗原结合分子可用于治疗B细胞癌(例如何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤[NHL]、前躯B细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴性白血病/小淋巴性淋巴瘤、B细胞前淋巴性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、外围区域B细胞淋巴瘤、毛状细胞白血病、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生病症、华氏(Waldenstrom′s)巨球蛋白血症及间变性大细胞淋巴瘤)。

本发明之抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子系以足以在患者中降低肿瘤负荷，产生肿瘤消退、抑制肿瘤生长或降低肿瘤发展之量来给药。在本发明某些例示的实施例中，投予的量系介于约0.001mg/kg至约1mg/kg之间。在其他的实施例中，投予的量为约0.4mg/kg。在其他的实施例中，投予的量为约0.04mg/kg。又在其他的实施例中，投予的量为约0.004mg/kg。

根据本发明特定的实施例，此抗原结合分子可用于治疗患有B-细胞淋巴瘤(例如NHL)，对单独的抗-CD20治疗具阻抗性或不完全反应(例如，对利妥昔单抗具抗性)之病患。根据本发明之其他相关的实施例，系提供包括将如文中所述的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子投予患有以抗-CD20治疗难以治疗之B-细胞淋巴瘤(例如NHL)的病患(例如，患有利妥昔单抗难以治疗之肿瘤或复发性或难治的B-细胞淋巴瘤之病患)之方法。本项技术中已知的分析/诊断方法，例如肿瘤扫描等，可用于确认病患是否隐藏有对单独的抗-CD20治疗具阻抗性或不完全反应或难以治疗之肿瘤。

本发明亦包括于一患者中治疗残余癌之方法。如文中所用，术语「残余癌」系指以抗癌疗法治疗后，在一患者中存在或持续留有一或多个癌细胞。

根据特定方面，本发明系提供治疗与CD20表现有关的疾病或病症(例如B细胞淋巴瘤)之方法，其包括在一患者已接受抗-CD20单一治疗后，将一或多种文中他处所述的双特异性抗原结合分子投予该患者(例如，在投予包括抗-CD20抗体如利妥昔单抗之医药组成物之后)。例如，本发明系包括治疗B细胞淋巴瘤之方法，其包括在一病患已接受抗-CD20单一治疗(例如，利妥昔单抗治疗或其同等性治疗)后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更久，将抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子投予该患者。

组合治疗及调配物

本发明系提供包括将包含文中所述之任何例示性抗体和双特异性抗原结合分子之医药组成物与一或多种另外的治疗剂组合给药之方法。可与本发明之抗原结合分子组合或组合给药之例示性另外的治疗剂包括，例如EGFR拮抗剂(例如抗-EGFR抗体[例如，西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR之小分子抑制剂[例如，吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])，另外的EGFR家族成员之拮抗剂，例如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4(例如抗-ErbB2、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性之小分子抑制剂)，EGFRvIII之拮抗剂(例如专一与EGFRvIII结合之抗体)，cMET拮抗剂(例如抗-cMET抗体)，IGF1R拮抗剂(例如抗-IGF1R抗体)，B-raf抑制剂(例如威罗菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)，PDGFR-α抑制剂(例如抗-PDGFR-α抗体)，PDGFR-β抑制剂(例如抗-PDGFR-β抗体)，VEGF拮抗剂(例如VEGF-Trap，参见例如US 7,087,411(文中亦称为「VEGF-抑制融合蛋白」)、抗-VEGF抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF受体之小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗剂(例如揭示于US 2009/0142354中之抗-DLL4抗体)、Ang2拮抗剂(例如揭示于US 2011/0027286中之抗-Ang2抗体，例如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如抗-FOLH1抗体)、PRLR拮抗剂(例如抗-PRLR抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如抗-STEAP1抗体或抗-STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗-TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗-MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗-CA9抗体)、尿溶蛋白(uroplakin)拮抗剂(例如抗-尿溶蛋白抗体)、抗-CTLA4抗体(例如，伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-010))、单价CD20拮抗剂(例如单价抗-CD20抗体，如利妥昔单抗)等。

可有利地与本发明之抗原结合分子组合之其他试剂包括免疫活化剂或抑制剂。特定的免疫活化剂或抑制剂为细胞激素活化剂或抑制剂，包括小分子化合物以及与细胞激素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其个别受体结合之抗体。本发明之医药组成物(例如包括如文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子之医药组成物)亦可作为包括一或多个治疗组合之疗法的部份来给药，而该治疗组合系选自「ICE」：异磷酰胺(ifosfamide)(例如，)、卡铂(carboplatin)(例如，)、依托泊苷(etoposide)(例如，VP-16)；「DHAP」：地塞米松(dexamethasone)(例如，)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如，阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、ara-C)、顺铂(cisplatin)(例如，)；及「ESHAP」：依托泊苷(例如，VP-16)、甲泼尼龙(methylprednisolone)(例如，)、高剂量阿糖胞苷、顺铂(例如，)。

本发明亦包括包含文中所提及之任何抗原结合分子与一或多种下列抑制剂之治疗组合：VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、uroplakin或任何前述的细胞激素，其中该抑制剂为一适配体、反义分子、核糖酵素、siRNA、肽体、奈米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab')₂片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程化分子，例如二抗体、三抗体、四抗体、微小抗体和最小识别单元)。本发明之抗原结合分子亦可与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇及/或NSAID组合给药及/或共调配。本发明之抗原结合分子亦可作为同时包括放射线治疗及/或习用化疗之治疗疗法的部分来给药。

另外的治疗活性组份可在投予本发明抗原结合分子之前、同时或之后不久给药(就本揭示文之目的，此等给药疗法系被视为本发明之抗原结合分子与另外的治疗活性组份「组合」给药)。

本发明系包括其中本发明之抗原结合分子系与一或多种如文中他处所述之另外的治疗活性组份共调配之医药组成物。

给药疗法

根据本发明特定的实施例，可于一定义的时程将多剂量的抗原结合分子(例如抗-CD3抗体或专一与CD20和CD3结合之双特异性抗原结合分子)投予一患者。根据本发明此方面之方法系包括先后将多剂量之本发明抗原结合分子投予一患者。如文中所用，「先后给药」系指各剂量之抗原结合分子系于不同的时间点投予该患者，例如以预计的间隔隔开之不同日(例如小时、日、周或月)。本发明系包括，包含将一单一起始剂量之抗原结合分子先后投予病患，接着一或多个第二剂量之抗原结合分子及视需要接着一或多个第三剂量之抗原结合分子之方法。

术语「起始剂量」、「第二剂量」和「第三剂量」系指投予本发明抗原结合分子之暂时顺序。因此，「起始剂量」为治疗疗法开始时所投予之剂量(亦称为「基线」剂量)；「第二剂量」为在起始剂量之后所投予之剂量；而「第三剂量」为在第二剂量之后所投予之剂量。起始、第二和第三剂量皆可含有相同量之抗原结合分子，但就给药的频率而言，一般可彼此不同。在特定的实施例中，然而，包含在起始、第二及/或第三剂量中之抗原结合分子之量，在治疗期间可互不相同(例如，若适当，经上调或下调)。在特定的实施例中，系在治疗疗法开始时投予二或多个(例如2、3、4或5个)剂量作为「承载剂量」，接着以较低频率为基础，投予后续剂量(例如「维持剂量」)。

在本发明一例示性的实施例中，各第二及/或第三剂量系紧接前面剂量之后的1至26周(例如1、1¹/₂、2、2¹/₂、3、3¹/₂、4、4¹/₂、5、5¹/₂、6、6¹/₂、7、7₁/²、8、8¹/₂、9、9¹/₂、10、10¹/₂、11、11¹/₂、12、12¹/₂、13、13¹/₂、14、14¹/₂、15、15¹/₂、16、16¹/₂、17、17¹/₂、18、18¹/₂、19、19¹/₂、20、20¹/₂、21、21¹/₂、22、22¹/₂、23、23¹/₂、24、24¹/₂、25、25¹/₂、26、26¹/₂或更久)给药。「紧接前面剂量」一词，如文中所用，系指在一多重给药之顺序中，抗原结合分子之剂量，在每个相邻接的剂量给药之前系以无插入剂量之顺序给药。

根据本发明此方面之方法可包括将任何数目之第二及/或第三剂量之抗原结合分子(例如抗-CD3抗体或专一与CD20和CD3结合之双特异性抗原结合分子)，投予一病患。例如，在特定的实施例中，仅将一单一第二剂量投予该病患。在其他实施例中，系将二或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量投予该病患。同样地，在特定的实施例中，仅将一单一第三剂量投予该病患。在其他实施例中，系将二或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量投予该病患。

在涉及多重第二剂量之实施例中，各第二剂量可与其他第二剂量相同的频率来给药。例如，各第二剂量可在紧接前面剂量后1至2周，投予该病患。同样地，在涉及多重第三剂量之实施例中，各第三剂量可与其他第三剂量相同的频率来给药。例如，各第三剂量可在紧接前面剂量后2至4周，投予该病患。另外，投予病患之第二及/或第三剂量的频率，在治疗疗法期间可不同。在治疗期间，给药频率亦可依照个别病患之需求在临床检查后由医师做调整。

抗体之诊断用途

本发明之抗-CD3xCD20抗体亦可用于侦测及/或测量样本中之CD3或CD3-表现细胞，例如供作诊断目的。例如抗-CD3xCD20抗体或其片段可用于诊断特征为CD3异常表现(例如过度表现，表现不足，无表现等)之症状或疾病。CD3之例示性诊断分析可包括，例如将得自病患的样本与本发明之抗-CD3xCD20抗体接触，其中该抗体系以可侦测的标记或受体分子标定。另外，未标定的抗-CD3xCD20抗体可与本身经可侦测标记标定之第二抗体组合用于诊断用途。可侦测标记或报导子分子可为放射性同位素，例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光或化学荧光基团，例如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明(rhodamine)；或酵素例如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶(luciferase)。可用于侦测或测量样本之CD3的特定例示分析包括酵素连结免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及荧光活化细胞分类(FACS)。

本发明之抗-CD3xCD20抗体可用于侦测及/或测量样本中之CD20或CD20-表现细胞，或诊断特征为CD20异常表现(例如，过度表现、低度表现或缺乏表现等)之症状或疾病，以此类推。

根据本发明可用于CD3或CD20诊断分析之样本系包括含有可侦测量之CD3及/或CD20蛋白或其片段，其系在正常或病理条件下由病患所得来之任何组织或液体样本。一般而言，起初系测量得自健康病患(例如未患有与异常CD3或CD20量或活性有关的疾病或症状之病患)之特定样本中CD3或CD20的量，建立一基线或标准的CD3或CD20量。然后可将此CD3或CD20之基线量分别与得自疑似患有CD3-或CD20-相关疾病或症状之个体的样本中所测量之CD3或CD20量作比较。

实例

提出下列实例以提供本项技术之一般技术者如何制造及使用本发明方法和组合物之完整揭示和说明，但不希望限制发明者所认为之发明范围。虽已尽力确保所用的相关数字(例如量、温度等)之正确性，但仍应考虑某些实验误差和偏差。除非另有指出，否则份数系为重量之份数，分子量为平均分子量，温度系以摄氏度数表示，而压力系为或接近大气压。

实例1.产生抗-CD3和抗-CD20抗体

已知有数种分离抗-CD3或抗-CD20抗体之方法。用于下列实例之全人类抗-CD3抗体，系如US 2007/0280945A1中所述，直接由未与骨髓瘤细胞融合之抗原-阳性的B细胞分离。

另外的抗-CD3抗体之实例可用于此方法中，且此等抗体之说明和此等抗-CD3抗体之生物特性系描述于2013年9月19日申请的PCT国际申请案号PCT/US13/60511中，其系以全文引用的方式并入本文中。例示的抗-CD20抗体和此等抗-CD20抗体之生物性质系描述于US 7,879,984和2013年9月19日申请的PCT国际申请案号PCT/US13/60511中，其各自系以引用的方式并入本文中。

抗-CD20抗体及制造用于建构本实例之双特异性抗体的方法系描述于US 7,879,984中。

用于建构双特异性抗体之抗-CD3抗原结合臂和抗-CD20结合臂的重链和轻链可变区及CDR之氨基酸序列标识符系列于表1中。对应的核酸序列标识符系列于表2中。

表1：氨基酸序列标识符(SEQ ID NO)

表2：核酸序列标识符(SEQ ID NO)

实例2.产生结合CD3和CD20的双特异性抗体

以上述序列使用标准方法建构包括抗-CD3-专一结合区和抗-CD20-专一结合区之双特异性抗体，其中系将来自抗-CD3抗体之重链和同源轻链与来自抗-CD20抗体的重链组合。

就此，依照本实例所制造的双特异性抗体系包括二个个别的抗原结合区(亦即结合臂)。第一抗原结合区系包括衍生自抗-CD20抗体("CD20-VH")之重链可变区，与衍生自抗-CD3抗体的轻链可变区("CD3-VL")配对。CD20-VH/CD3-VL配对制造出一个专一辨识CD20之抗原结合区。第二抗原结合区系包括衍生自抗-CD3抗体(「CD3-VH」)之重链可变区，与衍生自抗-CD3抗体的轻链可变区(「CD3-VL」)配对。此CD3-VH/CD3-VL配对制造出一个专一辨识CD3之抗原结合区。在此实例中所制造的所有双特异性抗体系使用相同的CD20-VH并命名为「CD20-VH-A」。

各重链之野生型重链恒定区(CH)系藉由重组技术以一嵌合的CH置换。一结合臂(例如抗-CD3结合臂)之CH系在CH的CH3区含有一突变，其促进分离此双特异性分子。

依照此实例所制造的各种双特异性抗体的组份部分汇整系列于表3和表4中。

表3：氨基酸序列标识符

表4：核酸序列标识符

表5和6系列出带有此实例双特异性抗体之其对应CDR的各种重链可变区(表5)和轻链可变区(表6)之氨基酸序列标识符。

表5：重链氨基酸序列标识符

表6：轻链氨基酸序列标识符

另外，表7和8系列出编码带有此实例双特异性抗体之其对应CDR的各种重链可变区(表7)、重链恒定区和轻链可变区(表8)之核苷酸序列标识符。

表7：重链核酸序列标识符

表8：轻链核酸序列标识符

除了上述的双特异性抗体外，在下列实例中所列的特定实验亦使用下列对照抗体：

对照抗体1：如中所US 4,361,549述，抗人类T-细胞表面抗原之单株抗体「OKT-3」并可得自杂交瘤CRL-8001(American Type Culture Collection,Manassas,VA).

对照抗体2：抗体「SP34」反应性抗人类T淋巴细胞上T3复合物之ε链，可得自BD Pharmagen，型号55052。

对照抗体3：抗-CD20治疗抗体，如US 5,736,137中所揭示，具有(利妥昔单抗)之重链和轻链序列。

对照抗体4：亦称为CD3xCD20抗体-野生型Fc(wtFc)，此抗体系类似上述方法所制造，具有一包括SEQ ID NO：2/18之HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗-CD20臂(SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列)，及野生型IgG1 CH区(SEQ ID NO：45)；及一包括SEQ ID NO：10/18之HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗-CD3臂(SEQ ID NO：12-14-16-20-22-24之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列)，及在CH3区带有2个氨基酸修饰使其容易分离之野生型IgG1 CH区(SEQ ID NO：48)。CD3xCD20抗体-wtFc(抗体4)可指具有野生型IgG1 Fc区之相配的对照抗体(亦即与本发明CD3xCD20-嵌合Fc抗体之抗原结合区相配)，作为与具有不同Fc区序列或结构之抗体相比较抗体效应子功能，或其他性质之目的。

对照抗体5：抗-FelD1单株抗体系与猫抗原结合，对人类CD20或CD3无交叉反应性。此IgG1非特异性抗体对照系藉由如2013年11月7日申请的PCT公开案号WO2013/166236所述之方法所得来。

对照抗体6：抗-FelD1抗原结合区，如PCT公开案号WO2013/166236中所述，如文中所述经工程化以含有一嵌合的IgG4 Fc区，类似Ab 1。对照Ab 6对于人类CD20或CD3无交叉反应性，但具有类似Ab 1的效应子功能。

实例3.嵌合的重链结构

产生嵌合重链，例如嵌合的CH IgG4(SEQ ID NO：26)和嵌合的CH IgG1(SEQ ID NO：30)，系使用标准的选殖技术来进行。首先，经由一2-步骤PCR增幅程序产生嵌合的IgG4 CH。使用含有野生型hIgG4 CH DNA之起始载体结构pR001，使用CH区分别侧接P1-P2和P3-P4的引子对，增幅二个PCR片段，片段1和2。参见下表9。引子将所欲的IgG2下绞链序列(其编码SEQ ID NO：52)和侧接的限制位置二者导入此等片段。然后使用PCR引子P2和P4连接这二个片段。将所产生的序列经由Xho1-Not1限制位置插入pR001，产生含有嵌合IgG4 CH(其具有一IgG2下绞链序列)之载体结构pR002。使用引子P10和P11确认此序列。

此外，经由多步骤PCR增幅产生嵌合的IgG1 CH。使用引子P2和P5(参见下表9)从模板pR85503(其含有一野生型人类IgG1 CH DNA)产生片段1a。以引子P6和P8使用pR002(含有嵌合的IgG4 CH DNA)作为模板，增幅片段2a。使用引子P7和P9从模板pR003(野生型hIgG1 CH DNA；SEQ ID NO：45)制造片段3。使用引子P2和P8连接片段1a和2a，其产生了片段4。使用引子P6和P9连接片段2a和3，产生了片段5。然后使用引子P2和P9将片段4和5融合。将所产生的序列经由Xho1-Not1限制位置插入pR001，产生结构pR004，其具有一带有IgG2下绞链和IgG4 CH2区之IgG1恒定区。使用引子P10和P11确认此序列。

表9：用于PCR产生嵌合C_H核酸结构之引子

实例4.相较于单特异性抗体，CD20x CD3双特异性抗体选择性结合Jurkat、Raji和猴子T-细胞

将CD3xCD20抗体-wtFc(对照抗体4)与单特异性对照抗体，如实例2中所述，经由FACS结合法，比较其结合Jurkat(CD3+、CD20-人类T-细胞株)、Raji(CD3-、CD20+人类B-细胞株)或猕猴PBMC(「mkT细胞」)之能力。

使用下列方法得到FACS数据：将每孔2x10⁵个细胞以连续稀释的抗体于冰上培养30min。培养后，清洗细胞及加入适当的二级(Jurkat、RAJI细胞)或二级抗体混合液(用于猕猴PBMC)并另再培养30分钟。培养后，清洗细胞，再悬浮于含1％BSA之冷的PBS中并以流式细胞仪于BD FACS Canto II上分析。将Jurkat和Raji细胞以侧散射和前散射闸控，而猕猴T细胞亦闸控CD2+CD4+群族。使用Prism软件以使用4-参数非线性回归分析所计算的值测定细胞结合滴定之EC₅₀。结果系如表10所示。

表10.单特异性与CD3xCD20双特异性抗体之EC50结合值(莫耳)

(+)EC₅₀值未测定，但有观察到结合；NB无结合；NT未测试

如表10所示，试验抗体的分格，依照其特异性，在各中细胞株上显现一范围的结合亲和力。双特异性对照抗体4显示与人类和猕猴目标细胞之结合能力。对照抗体4包括与本发明抗体1和抗体2相同的抗-CD3xCD20可变区，然而却具有野生型IgG1 CH区。抗-CD3对照1(OKT3)、抗-CD3对照2(SP34)和抗-CD20对照3分别与Jurkat、猕猴T细胞和RAJI结合。

实例5.带有野生型CH之CD20x CD3双特异性抗体在活化的T-细胞存在下引发对Raji细胞的细胞毒性

以一活体外细胞毒性分析检测CD20x CD3双特异性抗体重新引导T-细胞媒介杀死CD20-表现的Raji细胞之能力。此外，亦研究双特异性和亲代抗-CD3抗体二者经由Fc/FcR相互作用杀死U937细胞之能力。

钙黄绿素致死分析系使用下列方法来进行：分别于ficoll-Plaque上或经由Lympholyte哺乳动物细胞分离液分离人类和猕猴PBMC。将分离的PBMC于数天的期间内以含有重组的人类IL-2(30U/ml)和T-细胞活化的微珠之培养基活化(抗-CD3/CD28用于人类PBMC，抗-CD2/CD3/CD28用于猕猴PBMC)。

将目标细胞(Raji用于CD20媒介的致死而U937用于FcR媒介的致死)以钙黄绿素标定，并以活化的T细胞在10:1效应子：目标比率使用抗体的3-倍连续稀释液于37℃培养3小时的时间。培养后，将培养盘离心并将上清液转置于半透明黑色底部澄清的测定盘中进行荧光分析。使用Prism测定EC₅₀，其系定义为引发50％细胞毒性之双特异性抗体的莫耳浓度。使用4-参数非线性回归分析计算数值。结果系汇整于表10中。

表11.CD20x CD3-引发对Raji和U937细胞之细胞毒性的EC₅₀值

(*)数据为3次或更多次独立分析之平均值。无(*)之数据为1或2次独立分析之代表值/平均值。NA＝无活性

如表11所示，含有人类-特异性和猕猴交叉反应性抗-CD3臂及野生型IgG1 CH区之双特异性CD20xCD3抗体，在人类活化的T细胞之存在下能专一重新引导对Raji细胞的细胞毒性。在猕猴活化的T细胞之存在下，当其与具有活化猕猴T细胞之抗-CD3臂的对照Ab 4双特异性抗体培养时，杀死了Raji。双特异性抗体以及对照Ab1(抗-CD3mAb)二者在U937Fc/FcR依赖的致死分析中显现活性。此活性应可藉由于反应中加入阻断非特异性人类IgG来加以阻断(数据未显示)。

实例6.包括嵌合的CH区之CD20x CD3双特异性抗体在一CDC分析中显现降低的效应子功能

将带有嵌合CH区之CD20xCD3双特异性抗体(抗体1和抗体2)，如上文实例2中所述，工程化以改变或降低效应子功能。相较于包括同型IgG1之野生型(wt)重链恒定区的抗体(对照Ab 4)，CH区的取代可能阻碍Ig Fc与其受体结合之能力。因此，讯号传递和免疫反应，例如B细胞活化或吞噬作用，可能改变。检测CH区中的氨基酸修饰对于补体依赖的细胞毒性(CDC)(在此实例中)及抗体-依赖的细胞媒介细胞毒性(ADCC)效应子功能(参见实例7)之效应。

为了检测抗体1和抗体2对CDC效应子功能之效应，系在5％人类血清补充剂的存在下将CD20-表现Raji(目标)细胞(5000/孔)或Daudi细胞植入测定盘中。将抗体1、抗体2和对照抗体的连续稀释液，以100nM开始，于37℃加到细胞中历经4h。使用CytoTox Glo^TM套组(Promega)测定目标细胞裂解并计算细胞毒性百分比。

使用下列方程式计算细胞毒性百分比：

细胞毒性％＝((L_S-L_SR)/(L_MR-L_SR))*100％其中L_SR为基线发光而L_MR为经毛地黄皂苷(digitonin)裂解之细胞所释放的最大钙黄绿素。细胞毒性之EC₅₀系使用Prism软件(GraphPad)来测定。数值系使用4-参数非线性回归分析来计算并如表1表12以及图5A和5B所示。

相较于具有wt重链恒定区之对应抗体，抗体1和体2对抗Daudi和Raji细胞之CDC活性显著地减低。参见表12和图5A/B。观察到抗体1对抗Raji细胞之某些CDC活性，然而，整体的结果显示，嵌合的抗体在提升效应子反应上比wt IgG1 Fc对照抗体更弱。

表12：包括嵌合CH区之CD20xCD3双特异性抗体在测量效应子功能之CDC分析中展现降低的活性

NA：无活性

实例7.包括嵌合CH区之CD3xCD20双特异性抗体在ADCC分析中显现降低的效应子功能

为了检测抗体1和抗体2与带有野生型CH区(及相同可变区)之双特异性抗体对ADCC效应子功能之效应，系将新鲜分离的非刺激CD56‐阳性NK细胞或经工程化表现FcγRIIIA之较高亲和力V等位基因的NK92细胞在嵌合CH‐抗体(抗体1和抗体2)及wt‐CH对照抗体(对照抗体4)的存在下，置入含钙黄绿素‐标定的CD20‐阳性Raji或Daudi细胞的盘中。监测从目标细胞释放的钙黄绿素及测定细胞毒性百分比。如上文CDC分析所述，计算细胞毒性百分比和EC₅₀。结果系如表13及图6A和6B中所示。

嵌合的CH抗体、抗体1和抗体2并无媒介对抗Raji或Daudi细胞之ADCC活性(表13)。

表13：包括嵌合CH区之CD3x CD20双特异性抗体在测量效应子功能之ADCC分析中展现降低的活性

NA：无或性；#：背景细胞毒性～20％

实例8.嵌合抗体之表面电浆子共振衍生的结合亲和力和动力学常数

使用表面电浆共振(SPR)(Biacore)技术分析具有嵌合恒定重链区之抗‐CD3x抗‐CD20双特异性抗体，抗体1和抗体2，用以测定其与人类和猕猴Fcγ受体之动力学结合参数。以类似的方式检测同型对照组，亦即wt‐IgG1同型对照组和wt‐IgG4 CPPC同型对照组。

简言之，SPR实验系于25℃在Biacore T200仪器上运用一涂覆羧甲基葡聚醣(CM‐5)芯片来进行。使用标准的胺‐偶合化学将小鼠的单株抗‐五‐组胺酸抗体(GE Healthcare)固定在CM‐5感应芯片之表面上。将His‐标记的人类或猴子FcγR蛋白之140RU‐376RU捕捉至抗‐五‐组胺酸‐偶合CM‐5芯片并于捕捉的蛋白上以20μl/min注射抗体储存液历时2.5min。监测mAb结合反应，及，就低亲和力受体，计算稳态的结合平衡。藉由处理数据及使用Scrubber 2.0曲线拟合软件与1:1结合模型拟合，测定动力结合(k_a)和裂解(k_d)速率常数。从动力学速率常数计算结合裂解平衡常数(K_D)和裂解半衰期(t_1/2)：K_D(M)＝k_d/k_a；及t_1/2(min)＝(ln2/(60*k_d)。

表14：野生型(wt)和嵌合重链抗体之动力学结合参数

NB：无侦测到结合

如表14中的结果所示，相较于具有野生型(wt)hIgG1或hIgG4‐CPPC CH区之抗体，在SPR分析中抗体1和抗体2双特异性抗体并未显示与人类FcγRI结合。相较于带有wt hIgG1或hIgG4‐CPPC Fc序列之抗体，本发明之嵌合重链双特异性抗体对数种低亲和力人类FcRγ受体亦展现微弱至无结合(例如对人类FcRγIIA、FcRγIIB微弱结合，而对人类FcRγI、FcRγIIIA或FcRγIIIB则未侦测到结合)(下表15)。

表15：对野生型(wt)和嵌合重链抗体之稳态平衡结合

NB：无侦测到结合

实例9.嵌合抗体的药物动力学性质

抗体1和抗体2之毒理动力学性质系藉由从接受单一30-分钟IV输注的雄性猕猴得到血液样本(3只动物/治疗组)，接着12周的观察期来评估。用于血清中总药物浓度之毒理动力学分析的血液样本系于给剂前和给剂后5分钟和5、24、48、72和168小时，以及第14、21、35、49、66和84天所收集。将所得到的样本以直接的酵素结合免疫吸附分析(ELISA)分析，用以测定Ab 1或Ab 2之总药物浓度。使用非隔室分析(Phoenix WinNonLin)评估受试品项之毒理动力学，以测定药物动力学参数。结果系如表16所示(AUC＝浓度与时间曲线下面积；C_max＝实测的血清中最大浓度)。

表16：单一静脉内输注猕猴后，猕猴血清中嵌合抗体之药物动力学样貌

在猕猴中1.0mg/kg之Ab1和Ab2的单一静脉给剂后，观察到平均高峰浓度(C_max)分别为33.4和26.0μg/mL，及平均AUC_0-168h值分别为100和61.1天*ug/mL。表观最终半衰期预估系介于这二个分子之8.14-14.0天。数据显示，在所有的动物中就大多数12周观察期维持连续暴露于Ab1和Ab2且在各治疗组中为相当的。受试的品项并无观察到表观的致免疫性。Ab1和Ab2整体药物动力学样貌为给剂于猕猴之典型的单株抗体。

实例10.CD3xCD20双特异性抗体可用比单特异性抗体更低的剂量在猕猴中去除CD20+B-细胞

就测定抗体1和对照抗体4CD3xCD20双特异性抗体给药之活体内效力，系在给予抗-CD3xCD20双特异性抗体后，经由FACS检测猕猴外围血液CD20+B-细胞量的变化，与单特异性抗-CD20抗体(对照Ab 3)相比较。此研究系在编成8个给剂组，每个给剂组3只动物之雄性猕猴(长尾猕猴(Macaca fascicularis))中如下进行：第1组为安慰剂组(媒剂对照给药)；第2组接受30mg/kg之单特异性抗体(对照Ab 3；rituxan)(猴子中30mg/kg相当于375mg/m²之人类剂量，其被认为是最大临床剂量)；第3组为0.01mg/kg之双特异性CD3xCD20对照抗体4；第4组-0.1mg/kg之抗体4；第5组-1mg/kg之抗体4；第6组-0.01mg/kg之抗体1；第7组-0.1mg/kg之抗体1；及第8组-1mg/kg之抗体1。在给剂动物前第-7和-4天抽血。抗体药物或媒剂(安慰剂)之剂量系经由i.v.输注来给药，并于给剂后第2、4和7天抽血。以FACS就B细胞(CD20；表17)和T细胞(CD3，参见下文)标记分析血液样本并测定这些细胞类型的绝对数。

简言之，将100μl的血液以1.5ml RBC裂解缓冲液于Eppendorf试管中培养3分钟。将细胞以0.4xg离心5分钟，以FACS清洗液(PBS+3％FBS)清洗2x并于室温以Fc阻断试剂阻断10分钟。然后将细胞于4℃以直接接合hCD45和CD20荧光试剂的抗体培养30分钟。使用由CD45荧光染剂和侧散射特性(SSC)界定(CD45brightSSCdim)所组成之异源性闸控策略先进行B细胞子群(CD20)或T细胞子群(CD3)的定量测定，描绘白血液细胞(WBC)群族。然后经由使用适当荧光标定的抗体(CD20APC-Cy7)鉴别B细胞群族。染色后，清洗细胞二次，之后以FACSCanto细胞仪获得FACS，并以FlowJo软件分析。结果系如表17以及图11A和11B所示。

表17：治疗后猕猴外围血液之循环的CD45、CD20阳性细胞数目

如表17和图11A中所示，以第1个测量的时间点(第2天)，给予CD3xCD20双特异性抗体和抗-CD20单特异性抗体造成循环的B-细胞减少至基线量。此减少在安慰剂对照动物组中并未看到。在双特异性抗体之1mg/kg给剂后，双特异性组中B细胞去除维持1周，在0.01和0.10mg/kg剂量的双特异性组同样维持B细胞去除。

在此实验中亦以荧光标定的抗-CD3抗体监测T-细胞(CD3+)量。在双特异性抗体组(Ab4和Ab1；所有剂量)中于给剂后第2天观察到过渡性丧失循环的T-细胞。在媒剂(安慰剂)对照和对照Ab3(Rituxan)组中于测量的时间点并未观察到T细胞丧失。在双特异性抗体组中在第4天的时间点T-细胞量回到基线量，并维持在基线量直到实验结束(参见图11B)。

抗体1和抗体4CD3xCD20双特异性抗体之活体内效力系以一长期(3个月)研究于猕猴外围血液中测量CD20+B-细胞量或CD3+T-细胞量之变化，类似上述研究。在第0天投予1.0mg/kg之安慰剂(媒剂)或双特异性抗体。于二个双特异性抗体组中，外围血液中B-细胞量在第2天显著减少，且在所有的样本中(安慰剂除外)，于整个研究期内量维持减少(参见图12A)。于双特异性组中，第2天观察到过渡性T-细胞丧失，然后在第4天回复到基线量，且就经双特异性抗体治疗的动物，如整个研究(>80天)中所测，系维持大约的基线(图12B)。在以安慰剂治疗的动物中并无观察到过渡性T-细胞丧失。

就进一步测量低剂量给药之抗体1和抗体4CD3xCD20双特异性抗体的活体内效力，系以一长期(2个月)研究于猕猴外围血液中测量CD20+B-细胞量或CD3+T-细胞量之变化，类似上述实验。在第0天投予0.01mg/kg或0.001mg/kg(1μg/kg)之双特异性抗体。就二个CD3xCD20组，外围血液中B-细胞量在第2天显著减少，且于整个研究期内量维持减少(参见图13A)，与高剂量CD3xCD20双特异性抗体治疗的动物中所观察到的相类似(参见表17和图11A或12A)。以非常低剂量(1μg/kg)的双特异性抗体治疗的动物，如同以较高剂量CD3xCD20双特异性抗体治疗的动物中所见到的，历经相同的过渡性T-细胞丧失及恢复(参见图13B与图11B或12B相比)。

如在上述研究中所观察到的B-细胞丧失系与经CD3xCD20-嵌合Fc抗体1治疗的动物之外围血液中循环抗体的丧失相关(参见图14)。当动物循环中的抗体暴露随时间减少，B-细胞群族开始恢复(例如在动物编号I06881中第81天所观察到的)。

B-细胞丧失与外围血液中循环抗体丧失之相关性亦在经CD3xCD20-嵌合Fc抗体2治疗的动物中可看到(参见图15)，当动物循环中的抗体暴露随时间减少，则B细胞群族开始恢复，如在动物编号I06876中第66天，及在动物编号I06877中第68天所观察到的。类似的相关性在经CD3xCD20-wtFc(Ab 4)双特异性抗体治疗的动物中亦可看到(参见图16)。当动物循环中的抗体暴露随时间减少，B细胞群族开始恢复(参见图16，如在动物编号I06870中第91天，及在动物编号I06872中第64天所观察到)。

实例11.CD3xCD20双特异性抗体可用比单特异性抗体更低的剂量减少猕猴淋巴样组织中CD20+B-细胞

投予抗-CD3xCD20双特异性抗体(抗体1或抗体4)后，经由FACS检测猕猴淋巴样组织中CD20+B-细胞量的变化，与单特异性抗-CD20抗体(对照Ab 3-Rituxan)相比较。此研究系在编成8个给剂组，每个给剂组3只动物之雄性猕猴(Macaca fascicularis)中如下进行，系类似上文实例10之1-8组中所述。抗体药物或媒剂之剂量系经由i.v.输注来给药，及于给剂后第7天将动物安乐死并收集组织。就白血液细胞(CD45+)和特别是B细胞(CD20+)、标记以FACS分析组织样本，然后测定B细胞的体积％。

经由使用适当荧光标定的抗体(CD20APC-Cy7)鉴别B细胞群族并类似上述实例10之方法获得FACS。结果系如表18以及图17A和17B所示。

表18：在治疗后猴子肠系膜淋巴结和脾脏中CD20阳性细胞之百分比

如表18和图17A中所示，投予CD3xCD20双特异性抗体，相较于抗-CD20单特异性抗体，就双特异性组以低很多的剂量(0.01至1.0mg/kg剂量)造成脾脏中组织B细胞减少。此减少在安慰剂对照动物组中并未看到。

如表18和图17B中所示，投予CD3xCD20双特异性抗体，相较于抗-CD20单特异性抗体，就双特异性组以低很多的剂量(0.01至1.0mg/kg剂量)造成肠系膜淋巴结中组织B细胞减少，其中0.1mg/kg剂量和1mg/kg剂量的双特异性抗体比单特异性组产生更有效的B细胞减少。此减少在安慰剂对照动物组中并未看到。在CD20之免疫组织化学染色时(数据未显示)，在单特异性-治疗(30mg/kg)的淋巴结中侦测到残余的B-细胞。从0.1至1.0mg/kg双特异性抗-CD3xCD20抗体治疗组所收集的组织中并未侦测到残余的B细胞。这些数据验证了Ab1和Ab1具有比Ab3更强杀死B细胞之深度。

实例12.以CD3x CD20双特异性抗体治疗肿瘤

A.以CD20x CD3双特异性抗体治疗，抑制了NSG小鼠中Raji肿瘤生长

就评估选择的抗‐CD3xCD20双特异性抗体对降低Raji肿瘤生长的效力，系将购自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine,USA)之NSG小鼠(NOD/LtSz‐scid/IL2Rγ^null小鼠)以皮下共同植入2x10⁶个Raji肿瘤细胞和5x10⁵个人类PBMC(第0天)。在同一天，以抗体1或对照抗体5(不相关标靶之IgG1抗体)或对照媒剂之0.4、0.04或0.004mg/kg腹膜内剂量治疗每只小鼠(每组治疗组N＝5只小鼠)。由第0天开始，以药物或媒剂之腹膜内剂量每周二次治疗小鼠进行至其余的研究天数。使用光标尺每周测量肿瘤大小2次，且肿瘤体积系计算为体积＝(长x宽²)/2。利用GraphPad软件Prism 5.0(MacIntosh Version)进行统计分析。

藉由双因子ANOVA以杜凯氏多重比较事后测验(Tukey’s multiple comparisons post-test)测定统计显著性。将各读值之数据于治疗组间交叉比较。p<0.05之阀值视为统计上显著的。

结果系显示在图7A‐7F中。这些结果显示抗体1(CD3xCD20‐嵌合Fc)以共同植入人类免疫细胞之小鼠中Raji肿瘤为标靶，造成在受试剂量时完全抑制肿瘤生长(图7C：0.4mg/kg Ab1；图7E：0.04mg/kg Ab1；图7F：0.004mg/kg Ab1)。此实例验证了，在肿瘤植入时开始以CD3xCD20双特异性抗体1治疗对于抑制肿瘤生长为有效的。相对于对照组，在给予0.4、0.04或0.004mg/kg剂量的抗体1小鼠中，Raji肿瘤生长直到植入后23天仍完全受到抑制。于研究期间，在抗体1或对照抗体中皆未观察到对小鼠体重有显著的影响(数据未显示)。

以一类似的NSG小鼠模型(如上述)进一步试验CD3xCD20双特异性抗体的抗肿瘤效应，然而各NSG小鼠系在第-1天给剂1mg小鼠IgG(mIgG2a Fc)，之后每周一次。结果系如图8A-8B所示。

此实验验证了，在肿瘤植入时开始，在循环IgG的存在下以受试的双特异性Ab剂量之CD3xCD20双特异性抗体1(CD3xCD20-嵌合Fc)或CD3xCD20双特异性抗体4(CD3xCD20-wtFc)治疗对于抑制肿瘤生长为有效的(图8A-8B)。如图8A所见，于本实验中抗体1(CD3xCD20-嵌合Fc双特异性抗体)在有或无IgG1补充剂时，于受试的期间内展现完全的肿瘤抑制。

B.以CD3xCD20双特异性抗体治疗在NSG小鼠中缩小了已建立的肿瘤

评估选择的抗-CD3xCD20双特异性抗体在NSG小鼠(NOD/LtSz-scid/IL2Rγ^null小鼠)中降低已建立肿瘤之效力。NSG小鼠系购自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine,USA)并以皮下共同植入HLA-相合的Raji肿瘤细胞(2x10⁶)和人类PBMC(5x10⁵)(第-15天)。在治疗前让肿瘤于宿主中建立15天。在给药的前一天(第-1天)，小鼠各给剂5mg mIgG2a Fc之补充剂。随后将小鼠在实验期间以每周一次每只小鼠给剂5mg的mIgG2a Fc(第7天、第14天等)。在给药前根据肿瘤大小将小鼠分成2个实验组：第1组：～200-400mm³或第2组：～500-900mm³。

药物治疗后，于第0、3、6、10、14、17、21和28天监测各小鼠肿瘤大小并记录。每周二次使用光标尺测量肿瘤大小，并计算肿瘤体积为体积＝(长x宽²)/2。亦以触知测定肿瘤的存在。利用GraphPad软件Prism 5.0(MacIntosh Version)进行统计分析。将来自各读出值之数据于治疗组中交叉比较。结果系如图9和10中所示。

a.第1组：～200-400mm³肿瘤。在第0天开始，以所试剂量之药物或媒剂每周

一次(亦即第7天、第14天等)如下治疗各4或5只小鼠的数个小组：

i.对照：单独的媒剂

ii.对照抗体5，0.4mg/kg

iii.抗体1(CD20xCD3-嵌合Fc),0.4mg/kg

b.第2组：～500-900mm³肿瘤。在第0天开始，以所试剂量之药物或媒剂每周

一次(亦即第7天、第14天等)如下治疗各4只小鼠的数个小组：

i.对照抗体5，0.4mg/kg

ii.抗体1(CD20xCD3-嵌合Fc),0.4mg/kg

在投予0.4mg/kg抗体1(CD20xCD3-嵌合Fc)的小鼠于14天肿瘤完全消退。参见图9。

在带有较大已建立肿瘤之模型中(亦即，第2组，～500-900mm³)，抗体1(CD20xCD3-嵌合Fc)治疗(0.4mg/kg)在第21天所观察的肿瘤完全消除。参见图10，其验证了Ab1在治疗带有体积大于0.5cm及高达0.9cm之大淋巴瘤块(亦即CD20表现阳性之肿瘤)小鼠中的效用。

实例13.CD3xCD20双特异性抗体在活体外引发PBMC增生

选择的CD20xCD3双特异性抗体及对照组结构刺激外围血液单核细胞(PBMC)及引发增生作用之能力系使用ATP催化的定量分析(CellTiter)来评估。PBMC之活化造成细胞激素释放，其驱动细胞增生。

使用下列方法得到增生数据：将人类或猕猴衍生的PBMC(5x10⁵/孔)以3-倍连续稀释之抗-CD3xCD20或对照抗体及市售的抗-CD28抗体(人类：200ng/mL，猕猴：500ng/mL)于37℃培养72h。使用Cell Titer定量细胞并使用VICTOR X5多标定盘式判读仪(PerkinElmer)测量作为细胞存活读数之发光量，用以侦测活细胞。细胞存活(刺激与未刺激细胞之诱发倍率)系藉由将刺激细胞的发光除以未刺激细胞的基线发光并使用Prism软件作图来测定。结果系汇整于表19以及图18A和18B中。

表19.由抗-CD3x CD20双特异性抗体引发的人类和猕猴PBMC增生之EC₅₀

数据为3或多个独立分析之中位数。NA＝无活性。

如表19和图18A-18B中所示，本发明之二种CD20x CD3双特异性抗体引发了人类或猕猴PBMC之增生。抗体1以大约相等的效力引发人类和猕猴二者PBMC之增生。对照Ab5不具有活性。

实例14.CD20x CD3双特异性在活体外藉由活化的T-细胞媒介细胞致死

分别于ficoll-Plaque上或使用淋巴溶解素哺乳动物细胞分离液(Lympholyte Mammal cell separation media)分离人类或猕猴PBMC。将分离的PBMC(1x10⁶个细胞/mL人类PBMC或5x10⁶个细胞/mL猕猴PBMC)，于含有重组的人类IL-2(30U/mL用于人类PBMC，100U/mL用于猕猴PBMC)及T细胞活化微珠(抗-CD3/CD28用于人类PBMC，抗-CD2/CD3/CD28用于猕猴PBMC)之完全培养基(RPMI补充10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-麸酰胺酸)分别活化7和21天。将CD20表现的Raji细胞(2x10⁶个细胞/mL)于37℃以8μM钙黄绿素-AM标定30分钟并以培养基冲洗3次。将钙黄绿素-标定的标靶细胞(10,000-20,000个细胞/孔)于37℃置入200μL含有活化T细胞(效应子/标靶细胞比率10:1)及抗体1、Ab 4或对照Ab 5之连续稀释液(人类浓渡范围：2nM至0.00003nM；猕猴浓度范围：6.6nM至0.002pM)完全培养基中2小时。培养后，将培养盘离心并将上清液转置于半透明黑色底部澄清的盘中进行荧光分析。使用下列方程式计算细胞毒性百分比：

细胞毒性％＝((FS-FSR)/(FMR-FSR))*100％,

其中FS为从试验孔槽释放出的钙黄绿素，FSR为自发性钙黄绿素释放而FMR为经Triton-X裂解的细胞所释出之最大钙黄绿素。

使用Prism软件测定细胞存活的之EC₅₀(ATP催化性定量分析)。细胞裂解(细胞毒性)系藉由钙黄绿素释放作为最大释放的分数所测量。将所观察的释放与最大释放相比，计算细胞毒性百分比并测定EC₅₀值。结果系如表20及图19A(人类T-细胞)和19B(猴子T-细胞)中所示。

表20.CD3xCD20-引发对Raji细胞的细胞毒性之EC₅₀值

NA＝无活性；NT＝未测试

如表20中所示，抗体1分别以25.0ρM和9.10ρM对人类(图19A)和猕猴(图19B)T细胞之带表性EC₅₀值媒介了目标细胞致死。抗体4分别以15.7pM和1.73pM对人类(图19A)和猕猴(图19B)T细胞之代表性EC₅₀值媒介了目标细胞致死。对照组未观察到活性。

为了以流式细胞仪监测带有CD20的标靶细胞之特异性致死，系将B16F10.9亲代鼠科骨髓瘤细胞(不会表现CD20)及经工程化稳定表现人类CD20之B16F10.9细胞(B16F10.9/CD20)分别以1μM的荧光追踪染剂羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)和Violet Cell Tracker标定。标定后，将细胞以1:1比率混合，并于37℃放置隔夜。个别地，将人类PBMC以1x10⁶个细胞/mL置入补充的RPMI培养基并于37℃培养至隔夜，藉由去除黏附的巨噬细胞、树突细胞和某些单核细胞来丰富淋巴细胞。隔天，将标靶细胞与去除黏附细胞的天然PBMC(效应子/标靶细胞4:1比率)及试验的CD3xCD20双特异性抗体或IgG1对照抗体5的连续稀释液(浓度范围：66.7nM至0.25ρM)于37℃共培养48小时。使用无酵素细胞裂解缓冲液从细胞培养皿移出细胞，并以FACS分析。就FACS分析，系将细胞以死/活far red cell tracker(Invitrogen)染色。就评估致死之特异性，系将细胞闸控在活的Violet和CFDA-SE标定的族群上。记录各族群的百分比如下用于计算调整的存活：调整的存活＝(R1/R2)*100，其中R1＝[(B16F10.9/CD20)/旁观细胞(B16F10.9)]*100在无抗体之下，及R2＝相同的比率但在试验抗体的存在下。

表21.在B16F10.9/CD20细胞中标靶-特异性致死之EC₅₀值

NA＝无活性。

CD3xCD20-嵌合Fc(抗体1)和CD3xCD20-wtFc(抗体4)二者在细胞的混合群族中特异性引导人类T细胞仅杀死表现CD20之标靶细胞(图20A-B)。仅在双特异性抗体的存在下观察到标靶细胞致死，其中B16F10.9/CD20细胞系以剂量依赖的方式被抗体1(EC₅₀ 19.5ρM)和抗体4(EC₅₀ 12.8ρM)去除(图20B)。低于5％的CD20-表现细胞在受试的最高剂量(10μg/mL)时仍存活(图20B)。就对照Ab5，一种IgG1对照抗体，在亲代B16F10.9细胞群族或B16F10.9/CD20群组为观察到死亡证据。

实例15.在20小时FACS的活体外分析中CD3xCD20双特异性抗体上调了T细胞上之早期活化标记CD69

CD69+为其中一种指出T细胞已被活化之最早可诱发的细胞表面标记。T-细胞活化可藉由检验上调的特定细胞表面标记，例如CD69来测定。

CD3xCD20双特异性抗体上调全血中人类或猕猴T细胞上之早期活化标记CD69的能力系藉由20小时活体外FACS分析来测定。简言之，藉由将新鲜分离的人类或猕猴全血于平底96孔盘以5-倍(人类)或10-倍(猕猴)的抗体1、抗体4或对照Ab 5之连续稀释液(浓度范围50nM至0.0006nM)于RPMI+L-麸酰胺酸中在37℃培养20小时，来评估T细胞活化。培养后，将培养盘以1000rpm旋转5分钟并移除血浆。就测量T细胞上CD69上调，系将含直接接合CD2和CD69之抗体，以及CD45、CD4、CD8，和CD19(人类)或CD16(猕猴)之混合液，于4℃直接加到血液中历时30分钟。依照制造商的说明以1.5mL PharmLyse缓冲液溶离红血球。清洗细胞二次，悬浮于200μL冷的PBS+1％FBS中，并以流式细胞仪使用BD FACSCanto细胞计数器分析。以首先闸控在能生存的小CD45+淋巴细胞，然后闸控在CD19-/CD2+/CD4+T细胞(人类)或CD16-/CD2+/CD4+T细胞(猕猴)，鉴别CD4+T细胞。

记录总CD2+效应子细胞中活化的(CD69+)T细胞百分比。参见表22以及图21。结果显示，如早期活化标记CD69所侦测，CD3xCD20双特异性抗体显著地活化T细胞。

表22.B16F10.9/CD20细胞中标靶-特异性致死之EC₅₀值

NA＝无活性

实例16.CD3xCD20双特异性抗体引发T细胞与标靶细胞群聚

使用细胞群聚模式测定CD3xCD20双特异性抗体系经由其双特异性结合臂桥接T-细胞与标靶细胞(CD20+细胞)。将效应子细胞以CFSE预先染色，及以Violet Cell Tracker将CD20+细胞预先染色24小时，并以不相关的对照抗体(对照抗体5，不相关IgG1同型抗体)培养后闸控分开四象限。参见图22A，其系描绘对于以不相关抗体治疗的细胞混合物中无群聚(双重-染色)。以CD3xCD20双特异性抗体培养后，由于染上CFSE和Violet二者，则出现细胞群聚(参见图22B，在散射图之左上方象限以粗黑方框标出)。

实例17.CD3+细胞上Tim-3和PD-1标记之抑制表现

T细胞功能障碍或衰竭系发生在带有肿瘤之宿主中。已鉴别出Tim-3和PD-1受体为慢性疾病状态中T细胞衰竭的标记。根据研究人员Sakuishi,K.等人(J.Exp.Med.207(10):2187-2194,2010)，Tim-3和PD-1阳性(Tim-3+PD-1+TIL)之肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)，如无法增生和产生IL-2、TNF和IFN-γ所定义，具有最严重的衰竭表型。

由以皮下共植入HLA-相合Raji肿瘤细胞和人类PBMC之NSG小鼠的血液和肿瘤中萃取CD3-阳性细胞-参见上文实例12B。简言之，在治疗前让肿瘤在宿主中建立15天-然后将小鼠以肿瘤大小为基础分成二个治疗组(参见实例12B)。从各研究组在第9天由经治疗(双特异性Ab)和未经治疗的小鼠中萃取血液，亦即第1组～200-400mm³或第2组～500-900mm³。在实验结束时将具有达到1500mm³肿瘤未经治疗的小鼠安乐死并将这些肿瘤进行PD1和Tim-3表现之检测。

就循环的T细胞实验，系选择可存活的CD45+CD3+T细胞比率使用Tim-3或PD-1之直接标定抗体(可购自Biolegend)进行标记鉴定。Tim-3+PD-1+细胞在未治疗动物血液中循环T细胞占优势比率。然而，在经CD20xCD3双特异性抗体(Ab 1)治疗的动物血液中T细胞则展现较低的Tim-3+PD-1+细胞比率。

将来自未治疗宿主的肿瘤细胞分离并就存活性染色。就存活的单一细胞进行FACS分析，用以挑选出CD45+CD3+细胞比率，然后检测其Tim-3或PD-1表现。

吾等已发现，在实例12B所述的实验期间，抑制的受体Tim-3和PD-1系表现在未经治疗小鼠之NSG B细胞淋巴瘤的CD3+TIL上，而Tim-3+PD-1+细胞在T细胞浸润肿瘤占优势比率。

实例18.于带有已建立Raji肿瘤之NSG小鼠中以CD3xCD20双特异性抗体治疗比抗-CD20+抗体更有效

评估选择的抗-CD3xCD20双特异性抗体在降低NSG小鼠中已建立肿瘤之效力。将NSG小鼠(NOD/LtSz-scid/IL2Rγ^null小鼠；Jackson Laboratories)以皮下共植入Raji肿瘤细胞(2x10⁶)和人类PBMC(5x10⁵)(于第-14天)(类似上文中实例12B)。

在抑制已建立Raji肿瘤上，CD20xCD3双特异性Ab1(以0.4mg/kg；2x/周i.p.给剂)系与CD19xCD3BiTE(以0.5mg/kg；5x/周i.v.给剂)(图23)相当但优于利妥昔单抗治疗(以8mg/kg；5x/周i.p.给剂)(图24)，因此验证了Ab1在治疗患有体积大于0.5cm之大淋巴瘤块的动物为效的。

实例19.以CD3xCD20双特异性抗体治疗CD20+黑色素瘤

研究人员已测定出，在病患中特定的黑色素癌亚群，例如CD20+黑色素肿瘤细胞，可代表肿瘤起始特症及较高的疾病再发生风险(Pinc等人Mol Ther.20(5):1056-1062,2012,epub 2012Feb 21)。CD20xCD3双特异性抗体Ab1展现对抗表现CD20之B16F10.9肿瘤细胞的有效活性，因为其在免疫-适当的小鼠中显著地延缓hCD20-转导的B16F10.9(B16F10.9/CD20)肿瘤生长。

CD3之人源化小鼠(人源化CD3γε小鼠)系于CD20位置人源化，使得小鼠表现二种人源化蛋白。将人源化CD3/CD20小鼠以皮下植入2x10⁵个经人类CD20转导的B16F10.9黑色素瘤肿瘤细胞(K.Peters/Charles Lin；Duke University)。在第0天开始(肿瘤移植当天)，将小鼠以每周2次腹膜内之媒剂(PBS；n＝5)、0.4mg/kg对照Ab5(抗不相关抗原之抗体；n＝5)、0.4mg/kg的Ab1(N＝5)或0.004mg/kg Ab1(n＝5)治疗。所测量的肿瘤体积系如图25A中所示。当肿瘤达到大于1500mm³体积时，将小鼠安乐死。如图25A所示，当治疗系与肿瘤移植同时开始时，以Ab1治疗延缓了肿瘤生长。

在一分开的实验中，亦检测Ab1抑制已建立肿瘤之肿瘤生长的能力(图25B)。将人源化CD3/CD20小鼠以皮下植入2x10⁵个表现人类CD20之B16F10.9黑色素瘤肿瘤细胞。在肿瘤移植后的第10天，将小鼠以肿瘤大小为基础随机化并分成下列治疗组，每组5只小鼠：媒剂(PBS)、4mg/kg对照Ab5(抗不相关抗原之对照抗体)、4mg/kg的Ab1或0.4mg/kg Ab1。所有的小鼠系以1周2次i.p.治疗。当肿瘤达到大于1500mm³体积时，将小鼠安乐死。如图25B所示，以Ab1治疗延缓了肿瘤已建立肿瘤的生长，其验证了Ab1展现对抗表现CD20之B16F10.9黑色素瘤细胞地有效活性。

本发明并不希望被限制于文中所述的特定实施例之范围中。实际上，由前述说明及伴随的图示，各种本发明之修改对于熟习本项技术者将变得显而易见。此等修改系希望落在所附的权利要求内。