替格瑞洛的抗体及其使用方法与流程

本申请通过引用结合以文本文件与本申请一起提交的计算机可读形式的序列表，所述序列表名称为“Ticagrelor_SeqList_ST25.TXT”，创建于2014年10月1日，并且大小为33,900字节。背景替格瑞洛(Ticagrelor，倍林达TM(BRILINTATM或BRILIQUETM))是一种口服活性的环戊基三唑嘧啶，一种选择性和可逆结合的二磷酸腺苷(ADP)受体拮抗剂。在急性冠状动脉综合征(ACS)患者中，90mg每日两次的替格瑞洛结合低剂量阿司匹林被批准用于减少主要心血管(CV)事件。替格瑞洛通过介导抗血小板作用(P2Y12)和增强的腺苷反应(ENT-1)的双重途径起作用(卡塔内奥M(CattaneoM)等人，2014，美国心脏病学会杂志(JAmCollCardiol.)63(23):2503-9)。虽然适应症尚未批准，正在进行的和计划的研究正在评估替格瑞洛用于减少陈旧性心肌梗死、已确定的外周动脉疾病、和急性脑卒中患者，以及糖尿病和确定的冠状动脉粥样硬化的患者的主要心血管事件。替格瑞洛具有两种主要代谢物：替格瑞洛活性代谢物(TAM)和替格瑞洛无活性代谢物(TIM)(滕等人，2010，药物代谢与处置(DrugMetab.andDispos.)38:1514-1521)。TAM，也称为AR-C124910XX，是替格瑞洛的主要循环代谢物，并且在P2Y12拮抗剂活性中同样有效。TAM通常在服用倍林达(BRILINTA/BRILIQUE)的患者中以母体替格瑞洛浓度的约30％-40％存在。替格瑞洛和TAM的循环半衰期分别为8和12小时。TIM，也称为AR-C133913XX，对P2Y12无活性，构成母体替格瑞洛的不足10％，在8小时后检测不到，并且是通过尿排泄的主要代谢物。不考虑处理策略(药学或侵入处理)，与广泛的ACS患者群体(不稳定性心绞痛(UA)、非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)、ST段抬高心肌梗死(STEMI))中的氯吡格雷相比，血小板抑制和患者结果(PLATO)试验证实替格瑞洛的更大功效，不增加总的大出血。(瓦伦汀(Wallentin)等人2009，新英格兰医学期刊，361(11):1045-1057)。然而，与所有抗血小板剂一样，在使用替格瑞洛的患者中存在出血的可能性。如果双重抗血小板治疗(DAPT)患者出现严重出血，则存在有限的治疗选择。如果在DAPT患者中发生出血事件，可以使用血小板输注或凝血因子给予以试图增强止血。然而，目前没有临床数据可用于评价服用替格瑞洛的受试者的大出血事件之后或期间血小板输注或使用重组因子VIIa的止血有益性(达伦M(DalénM)等人，2013，心胸与血管麻醉杂志(JCardiothoracVascAnesth.)27(5):e55-7)。因此，解毒剂(例如替格瑞洛特异性中和抗体)的可用性将允许期望的抗血栓形成效应与出血控制之间的平衡的更好的临床管理。因为替格瑞洛是唯一的市售的可逆结合血小板抑制剂，所以抗体可以提供血小板抑制的逆转而不需要新鲜的血小板输注，从而避免与血小板输注相关的危险。克服与替格瑞洛和TAM相关的ADP诱导的血小板聚集的抑制的试剂的可用性将满足重要的未满足的临床需要，例如在经历大出血或需要紧急手术的患者中。披露概述在一个方面，本披露涉及一种抗体，该抗体特异性结合具有化学式(Ia)的环戊基三唑嘧啶化合物：其中R1选自下组，该组由以下各项组成：C1-C6烷氧基和C1-C6烷硫基；R2选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、和取代的C3-C6环烷基；且R3选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6烷醇。在一些实施例中，该抗体结合至如化学式(IIa)由括号标记的化合物的部分内的表位其中R1、R2、和R3是如上定义的。在其他的实施例中，该抗体结合至如化学式(IIIa)由括号标记的化合物的部分内的表位其中R2和R3是如上所定义的，R’1选自下组，该组由以下各项组成：C1-C4烷基。在其他的实施例中，该抗体结合至选自下组的化合物，该组由以下各项组成：替格瑞洛；替格瑞洛活性代谢物(TAM)；以及替格瑞洛无活性代谢物(TIM)。在上述方面和实施例的其他实施例中，该抗体或其片段包含重链可变区(VH)序列，所述序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72；和轻链可变区(VL)序列，所述序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77。在一些实施例中，该抗体包含VH和VL序列的组合，该组合选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:2和SEQIDNO:7；SEQIDNO:12和SEQIDNO:17；SEQIDNO:22和SEQIDNO:27；SEQIDNO:32和SEQIDNO:37；SEQIDNO:42和SEQIDNO:47；SEQIDNO:52和SEQIDNO:57；SEQIDNO:62和SEQIDNO:67；以及SEQIDNO:72和SEQIDNO:77。在其他实施例中，该抗体包含VH和VL的组合，该组合选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:52和SEQIDNO:57；SEQIDNO:62和SEQIDNO:67；以及SEQIDNO:72和SEQIDNO:77。在上述方面和实施例的其他的实施例中，该抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区的框架区(FR)和互补决定区(CDR)1、2和3，其中该重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列包含SEQIDNO:3(CDR1)、SEQIDNO:4(CDR2)和SEQIDNO:5(CDR3)；SEQIDNO:13(CDR1)、SEQIDNO:14(CDR2)和SEQIDNO:15(CDR3)；SEQIDNO:23(CDR1)、SEQIDNO:24(CDR2)和SEQIDNO:25(CDR3)；SEQIDNO:33(CDR1)、SEQIDNO:34(CDR2)和SEQIDNO:35(CDR3)；SEQIDNO:43(CDR1)、SEQIDNO:44(CDR2)和SEQIDNO:45(CDR3)；SEQIDNO:53(CDR1)、SEQIDNO:54(CDR2)和SEQIDNO:55(CDR3)；SEQIDNO:63(CDR1)、SEQIDNO:64(CDR2)和SEQIDNO:65(CDR3)；或SEQIDNO:73(CDR1)、SEQIDNO:74(CDR2)和SEQIDNO:75(CDR3)；并且其中该轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列包含SEQIDNO:8(CDR1)、SEQIDNO:9(CDR2)和SEQIDNO:10(CDR3)；SEQIDNO:18(CDR1)、SEQIDNO:19(CDR2)和SEQIDNO:20(CDR3)；SEQIDNO:28(CDR1)、SEQIDNO:29(CDR2)和SEQIDNO:30(CDR3)；SEQIDNO:38(CDR1)、SEQIDNO:39(CDR2)和SEQIDNO:40(CDR3)；SEQIDNO:48(CDR1)、SEQIDNO:49(CDR2)和SEQIDNO:50(CDR3)；SEQIDNO:58(CDR1)、SEQIDNO:59(CDR2)和SEQIDNO:60(CDR3)；SEQIDNO:68(CDR1)、SEQIDNO:69(CDR2)和SEQIDNO:70(CDR3)；或SEQIDNO:78(CDR1)、SEQIDNO:79(CDR2)和SEQIDNO:80(CDR3)。在其他的实施例中，该抗体包含CDR区的组合，该组合选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:53(VHCDR1)、SEQIDNO:54(VHCDR2)、SEQIDNO:55(VHCDR3)、SEQIDNO:58(VLCDR1)、SEQIDNO:59(VLCDR2)、和SEQIDNO:60(VLCDR3)；SEQIDNO:63(VHCDR1)、SEQIDNO:64(VHCDR2)、SEQIDNO:65(VHCDR3)、SEQIDNO:68(VLCDR1)、SEQIDNO:69(VLCDR2)和SEQIDNO:70(VLCDR3)；以及SEQIDNO:73(VHCDR1)、SEQIDNO:74(VHCDR2)、SEQIDNO:75(VHCDR3)、SEQIDNO:78(VLCDR1)、SEQIDNO:79(VLCDR2)、和SEQIDNO:80(VLCDR3)。在上述方面和实施例中，该抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链Fv(scFv)、单结构域抗体、Fab、F(ab’)2、单链双抗体，抗体模拟物和抗体可变结构域。在一些实施例中，该抗体包含scFv。在一些实施例中，该抗体包含Fab。在一些实施例中，上述抗体结合替格瑞洛或替格瑞洛活性代谢物(TAM)。在其他的实施例中，该抗体以约200nM或更低的IC50结合替格瑞洛或其代谢物或衍生物。在另外其他的实施例中，该抗体以约100nM至约1nM的IC50或以约10nM至约1nM的IC50结合替格瑞洛或其代谢物或衍生物。在其他的实施例中，该抗体以约50nM或更低的KD结合替格瑞洛或其代谢物或衍生物。在其他的实施例中，该抗体以约250pM至约1pM的范围内，或约100pM至约1pM的范围内的KD结合替格瑞洛或其代谢物或衍生物。在其他的实施例中，该抗体结合替格瑞洛或其代谢物或衍生物，并且不结合选自下组的化合物，该组由以下各项组成：非诺贝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加诺生、环噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。在实施例中，该抗体不抑制选自下组的化合物的活性，该组由以下各项组成：非诺贝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加诺生、环噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。在其他的实施例中，该抗体显示对于选自下组化合物的至少约1000μM的IC50，该组由以下各项组成：非诺贝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加诺生、环噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。在一些实施例中，该抗体具有约4-12小时的体内半衰期。在具体实施例中，该抗体具有约12小时的体内半衰期。在一些实施例中，该抗体中和替格瑞洛或替格瑞洛的活性代谢物的抗血小板作用。在其他的实施例中，该抗体在给予约60分钟内中和替格瑞洛或替格瑞洛的活性代谢物的抗血小板作用。在一些实施例中，该抗体对替格瑞洛或替格瑞洛的活性代谢物具有如下解离速率，该解离速率允许继续开始包含替格瑞洛的治疗。在其他方面，本披露提供了在需要治疗的患者中治疗急性出血的方法，该方法包括向该患者给予有效量的在此披露的抗体。在该方法的一些实施例中，患者已接受或正在接受外科手术并且已经给予了替格瑞洛。在该方法的一些实施例中，患者需要紧急护理和/或紧急创伤管理。本披露的其他方面提供了一种组合物，该组合物包含前述方面和实施例中任一个的抗体与药学上可接受的载体的组合。一些另外的方面提供了核酸分子，该核酸分子包含编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:16、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:31、SEQIDNO:36、SEQIDNO:41、SEQIDNO:46、SEQIDNO:51、SEQIDNO:56、SEQIDNO:61、SEQIDNO:66、SEQIDNO:71和SEQIDNO:76。本披露的其他方面提供了可以包含在此披露的至少一种核酸分子的组合物、载体和宿主细胞。在一些实施例中，组合物、载体和宿主细胞包含编码在此披露的一种或多种蛋白质的第一核酸分子和第二核酸分子。通过阅读下面的说明和示例的描述，其他方面对于本领域技术人员将是显而易见的。附图的简要说明出于说明本披露的目的，在附图中描绘了本披露的某些方面。然而，本披露不限于附图中所描绘的方面的精确安排和手段。图1描述了基于III期PLATO数据的替格瑞洛中和性Fab的PK/PD建模。在180mg负荷剂量和90mg每日两次替格瑞洛后，在时间零时添加中和性Fab。患者在第1天重新服用替格瑞洛。预测Fab快速中和替格瑞洛和TAM，从而在99％的患者中恢复血小板聚集。在第0天和第1天之间的“峰”代表在1％的替格瑞洛清除更缓慢的患者中来自其他组织的替格瑞洛的再分布。图2-半抗原和Fab特异性。(A)提供替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物(TAM)、替格瑞洛无活性代谢物(TIM)和腺苷的化学结构。独特的R基团(二氟苯基-环丙基和硫丙基取代基)用虚线突出显示。(B)TICA0072的特异性图谱。(C)TICA0212(MEDI2452)的特异性图谱。特异性图谱包括替格瑞洛、TAM、TIM、腺苷、ADP、ATP和图4的十二种相关化合物中的三种(为了清楚起见；在浓度高达0.1mM时，没有检测到十二种化合物任意一种的结合)。数据是三次重复的平均值和SEM。图3示出了与生物素化的接头替格瑞洛结合的scFv(x轴)与在50倍过量的未修饰的替格瑞洛中与生物素化的接头替格瑞洛结合的scFv(y轴)的相关性。在过量未修饰的替格瑞洛的存在下scFv结合的抑制用0％、50％、80％和90％抑制的线显示。图4显示了与替格瑞洛具有一定程度的2D、3D或静电相似性的化合物。图5提供了TICA0049Fab和TICA0072Fab的选择性研究。a-cTICA0049Fab通过所列化合物与生物素化替格瑞洛结合的竞争。d-fTICA0072Fab通过所列化合物与生物素化替格瑞洛结合的竞争。数据DMSO标准化。图6提供了母体TICA0072和优化的变体TICA0152Fab、TICA0162Fab和TICA0212Fab在第二代表位竞争测定中的竞争曲线。图7显示TICA0162Fab和TICA0212Fab的选择性研究的结果。a-cTICA0162Fab通过所列化合物与生物素化替格瑞洛的结合的竞争。d-fTICA0212Fab通过所列化合物与生物素化替格瑞洛的结合的竞争。数据DMSO标准化。图8显示替格瑞洛的TICA0212/MEDI2452或TICA0072浓度依赖性逆转的结果。(A)TICA0212/MEDI24521μM替格瑞洛(▲)或1μMTAM(●)介导的20μMADP诱导的聚集的抑制。(B)TICA0212/MEDI2452显示在1μM替格瑞洛存在下血浆中游离替格瑞洛浓度的降低。平均值(n＝5)±平均值的标准误差。(C)P2Y12信号传导的替格瑞洛和TAM抑制的TICA0072逆转。图9显示在对替格瑞洛处理的小鼠给药后，TICA0212(250mg/kg)离体介导ADP诱导的全血聚集的逆转的结果。图10显示TICA0072(A)和TICA0212/MEDI2452(B)与替格瑞洛的复合物的晶体结构的部分图。Fab以带状表示，其中来自替格瑞洛的内的氨基酸残基以棍状表示。为了清楚省略了一些主链原子。轻链以米色显示，重链以浅蓝色显示。来自两条链的CDR3都着绿色。VHCDR3不能在TICA0072结构中建模，并且临时位置绘制为虚线。橙色箭头指示与TICA0072相比在TICA0212/MEDI2452中观察到的VLCDR3的位移。残基遵循卡巴特(Kabat)编号，并且带有L或H前缀以指示轻链或重链。图11显示离体ADP诱导的全血聚集的逆转。(A)替格瑞洛输注停止后每个治疗组的个体数据。载体对照(■)，替格瑞洛单独(●)，替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452(○)和替格瑞洛+同种型对照(Δ)。条形图(Bar)表示平均数据(n＝4)。AU＝聚集单元。在15分钟时，仅收集替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452组的数据。(B)由TICA0212/MEDI2452诱导的逆转百分比，为平均数据(n＝4)±SEM图12显示替格瑞洛诱导的出血的逆转。(A)总失血和(B)总出血时间的个体数据。载体对照(■)，替格瑞洛单独(●)和替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452(○)。条形图表示平均数据(n＝12)。发明详细说明在继续进一步详细描述本披露之前，应当理解的是，本披露并不局限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以改变。必须注意的是，如本说明书和所附权利要求书中使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。除非另外定义，在此所用的所有技术和科学术语具有与本发明所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。例如，生物医学和分子生物学简明词典(ConciseDictionaryofBiomedicineandMolecularBiology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；细胞和分子生物学词典(DictionaryofCellandMolecularBiology)，第3版，1999，学术出版社(AcademicPress)；以及牛津生物化学和分子生物学词典(OxfordDictionaryOfBiochemistryAndMolecularBiology)，修订版，2000，牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典。氨基酸可以在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过它们的普遍公认的单字母代码而被提及。除非另有说明，否则抗体的可变结构域、互补决定区(CDR)以及框架区(FR)中的氨基酸编号遵循卡巴特定义，该定义如列出于卡巴特等人，具有免疫学重要性的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(1991)。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入该FR或CDR中的较少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特，残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特，残基82a、82b、以及82c等)。可以通过抗体序列与“标准”卡巴特编号序列在同源区的比对而针对给定的抗体确定残基的卡巴特编号。框架残基的最大比对常常需要在编号系统中的有待用于Fv区的“间隔”残基插入。另外，由于种间或等位基因差异，在任何给定的卡巴特位点编号处的某些单独残基的身份在抗体链之间可以不同。如在此使用的，术语“抗体(antibody和antibodies)”也被称为免疫球蛋白，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个不同表位结合片段形成的多特异抗体(例如，多特异抗体，如PCT公开WO2009018386、PCT申请号PCT/US2012/045229，将其通过引用以其全文结合在此)、双克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、展现出所希望的生物活性的抗体片段(例如，抗原结合部分)、二硫键连接的Fv(dsFv)，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明的抗体的抗Id抗体)、细胞内抗体，以及上述任一者的表位结合片段。在本文提供的具体实施例中，该抗体涉及抗体的活性结合片段，即含有至少一个抗原结合位点的分子，例如scFv和Fab。抗体还包括与抗体或其部分的肽融合物，例如与Fc结构域融合的蛋白质。免疫球蛋白分子可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm，如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b、或c)，Am，Em，以及Km(1、2或3))。抗体可以源自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等等，或其他动物，如鸟类(例如鸡)。如本文所使用的，C1-C6烷基是指具有一至六个碳原子的直链和支链烷基，并且包括甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基。如本文所使用的，C1-C6烷氧基是指在基团中具有氧的如上所述的烷基。在一些实施例中，氧原子位于将取代基附接到核心结构(即环结构)的位置处。如本文所使用的，C1-C6烷硫基是指在基团中具有硫的如上所述的烷基。在一些实施例中，硫原子位于将取代基附接到核心结构(即环结构)的位置处。如本文所使用的，C1-C6烷醇是指在取代基结构的末端具有羟基的如上所述的烷基。如本文所使用的，C3-C6环烷基是指环丙基、环丁基、环戊基和环己基。如本文所使用的，“取代的”C3-C6环烷基和C1-C6烷基是指在至少一个碳原子上被芳基(也被1-3个卤素基团取代)取代的上述烷基和环烷基。如本文所使用的，“替格瑞洛”是指可逆的P2Y12抑制剂((1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇)，并且具有以下化学结构：如本文所使用的，“替格瑞洛活性代谢物”或“TAM”是指替格瑞洛的主要活性代谢物，也称为AR-C124910XX，为一种可逆的P2Y12抑制剂，并且具有以下化学结构：如本文所使用的，“替格瑞洛无活性代谢物”或“TIM”是指替格瑞洛的非活性代谢物，也称为AR-C133913XX，并且具有以下化学结构：抗体在一般意义上，本披露提供结合具有化学式(Ia)的环戊基三唑嘧啶化合物的新颖抗体：其中R1选自下组，该组由以下各项组成：C1-C6烷氧基和C1-C6烷硫基；R2选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、和取代的C3-C6环烷基；并且R3选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6烷醇。在具体的实施例中，该抗体特异性结合选自下组的化合物，该组由以下各项组成：替格瑞洛；替格瑞洛活性代谢物(TAM)；以及替格瑞洛无活性代谢物(TIM)。在具体方面，本披露提供了结合替格瑞洛和TAM的抗体，该抗体具有以下特征中的任何一个或多个，这些特征包括高结合特异性、高结合亲和力、快速起效时间和快速停止时间(例如，允许选择性继续或共给予包含替格瑞洛的治疗)。在一些实施例中，该抗体结合替格瑞洛并中和替格瑞洛和TAM的抗血小板聚集活性，从而在替格瑞洛和TAM存在下恢复ADP诱导的血小板聚集。在一些实施例中，受试者中的抗体半衰期与替格瑞洛和TAM的半衰期大约相同。在一些实施例中，该抗体半衰期为约4-24小时(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时)。在一些实施例中，该抗体半衰期为约4-12小时(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12小时)。在一些实施例中，该抗体提供活性的快速起效。例如，在实施例中，该抗体起效时间或中和替格瑞洛和TAM介导的血小板抑制的时间为约15-120分钟，或约15-60分钟。在一些实施例中，起效时间小于60分钟。在一些实施例中，该抗体具有提供活性的快速停止的PK/PD图谱，使得例如已给予该抗体的受试者可以重新开始规定的替格瑞洛治疗。在一些实施例中，已经接受本文披露的抗体(例如通过静脉内输注)的受试者可以在给予抗体后二十四小时内接受或重新开始替格瑞洛治疗。如本文的某些实施例中所讨论和举例说明的，该抗体结合替格瑞洛或其代谢物，并且不结合其他结构相关的化合物或可以与替格瑞洛作为联合治疗给予的化合物。例如，合适地，该抗体不抑制选自下组的化合物的活性，该组由以下各项组成：非诺贝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加诺生、环噻嗪、氟氯氰菊酯、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格雷洛、泮托拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、2-MeS二磷酸腺苷和2-MeS三磷酸腺苷。本文所述的抗体可以包括仅含有抗体分子例如Fab、F(ab')2、Fab’、scFv、di-scFv、sdAb片段的选择部分的抗原结合片段，并且可以用作诊断或治疗剂。另外，可以改变可变结构域中的特定残基以改进抗体和抗体片段的结合特异性和/或稳定性。已经替换了不直接参与抗原结合的其他残基，以便“人源化”非人抗体的区域并降低抗体的免疫原性。在某些方面，该抗体是Fab片段，例如抗体的Fab片段或重组产生的抗原结合片段，其包含可变轻链(VL)、恒定轻链(CL)、可变重链(VH)和恒定重链部分(CH1)。任选地，Fab的轻链和重链可以通过一个或多个二硫键互连，例如通过合适的抗体铰链区。如本文所述，Fab结合口服活性剂的环戊基三唑嘧啶类化合物的表位。在一些实施例中，Fab结合替格瑞洛或其代谢物。在某些方面，Fab可以衍生自或基于抗体的序列，例如常规的鼠类、人源化或人抗体。在某些方面，Fab可以衍生自或基于一种或多种scFv，例如筛选和衍生自文库的scFv。在这样的实施例中，衍生自或基于常规抗体或scFv的序列的Fab保留常规抗体的一种或多种功能活性(例如保留至少80％或更多(80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)的功能活性)。例如，在某些方面，该Fab保留对抗原(例如替格瑞洛)的亲和力、抑制活性和/或抗体或scFv的选择性中的一种或多种。虽然该Fab片段可以包含结合环戊基三唑嘧啶的表位的序列，但是在某些实施例中，该Fab结合替格瑞洛。在一些方面，该Fab结合替格瑞洛的活性代谢物。在某些方面，该Fab可以结合替格瑞洛和替格瑞洛的活性代谢物两者。在一些实施例中，该Fab可以包含来自结合替格瑞洛或其活性代谢物的不同抗体的CDR区的组合。在某些方面，该Fab包含轻链部分(VL)，该轻链部分包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一个列出的氨基酸序列。在另外的实施例中，该Fab包含轻链部分，该轻链部分包含SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一个列出的氨基酸序列。在某些方面，该Fab包含重链部分(VH)，该重链部分包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一个列出的氨基酸序列。在其他的实施例中，该Fab重链部分，该重链部分包含何SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一个列出的氨基酸序列。在某些方面，该Fab由编码轻链部分(VL)的核苷酸序列和编码重链部分(VH)的核苷酸序列编码，例如核苷酸序列包含SEQIDNO:11、SEQIDNO:21、SEQIDNO:31、SEQIDNO:41、SEQIDNO:51、SEQIDNO:61或SEQIDNO:71中任一个列出的核酸序列；和核苷酸序列包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16、SEQIDNO:16或SEQIDNO:76中任一个列出的核酸序列。在某些方面，该抗体可以是scFv。应当理解，该scFv包括多肽链，该多肽链包含通过柔性多肽接头与可变轻链结构域(VL)连接的可变重链结构域(VH)。在一些方面，VH和VL之间的多肽接头包含蛋白酶切割位点。scFv的VH和VL结构域可以来自相同或不同的抗体。在一些方面，该scFv的VH或VL可包含一个或多个结合致感兴趣的靶标的CDR，而VH或VL结构域的其余部分衍生自不同的抗体或是合成的。在一些方面，该scFv包含抗体的至少一个CDR，例如对替格瑞洛或其代谢物具有结合活性的抗体。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少两个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少三个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少四个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少五个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少六个CDR。可以单独或组合使用几种方法以改进该scFv分子的稳定性。可单独使用或与一种或多种其他方法组合使用的一种方法是设计连接scFv结构域的接头的长度和/或组成以稳定scFv部分。可以单独使用或与本文所述的一种或多种其他方法组合使用的另一种可能的方法是通过将至少两个氨基酸取代(也称为修饰或突变)引入scFv的VH和/或VL结构域以促进二硫键形成(参见例如布林克曼(Brinkmann)等人，1993，美国科学院院报(PNAS)，90:7538-42；朱(Zhu)等人，1997，蛋白质科学(Prot.Sci.)6:781-8；赖特尔(Reiter)等人，1994，生物化学(Biochem.)33:5451-9；赖特尔等人，1996，自然(Nature)14:1239-45；罗(Luo)等人，1995，生物化学杂志(J.Biochem.)118:825-31；杨(Young)等人，1995，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLet.)377:135-9；格勒诺布尔等人，1990，生物化学29:1362-7)。在某些方面，将一个突变引入scFv的VH和VL结构域的每一个中，以在scFv表达时促进VH和VL结构域之间的链间二硫键形成。在另一方面，将两个突变引入链的相同结构域中。在某些方面，将两个突变被引入不同的链。在某些方面，引入这两个突变的多对以促进多个二硫键的形成。在某些方面，引入半胱氨酸以促进二硫键形成。可以突变为半胱氨酸的示例性氨基酸包括VH2的氨基酸43、44、45、46、47、103、104、105和106，以及VL2的氨基酸42、43、44、45、46、98、99、100和101。上述编号是基于卡巴特编号，其鉴定仅相对于scFv的VH2和VL2的位置(而不是相对于抗体全长序列中氨基酸的位置)。可以突变为半胱氨酸残基的氨基酸位置的示例性组合包括：VH44-VL100、VH105-VL43、VH105-VL42、VH44-VL101、VH106-VL43、VH104-VL43、VH44-VL99、VH45-VL98、VH46-VL98、VH103-VL43、VH103-VL44和VH103-VL45。在一些方面，VH的氨基酸44和VL的氨基酸100突变为半胱氨酸。可单独使用或与本文所述的一种或多种其他方法组合使用的另一种潜在方法是选择scFv的结构域的顺序。在某些方面，相对于VL结构域的VH结构域的取向被优化以达到稳定性。在某些方面，该scFv处于VH-接头-VL取向。在某些方面，该scFv处于VL-接头-VH取向。可以单独使用或与本文所述的一种或多种方法组合使用的另外的方法是通过突变scFv的一个或多个表面残基引入一个或多个稳定性突变。在一些方面，一个、两个、三个、四个、五个、六个或多于六个残基在scFv的VH和/或VL结构域的一者或两者中突变。在某些方面，仅在scFv的VH结构域中进行改变。在某些方面，仅在scFv的VL结构域中进行改变。在某些方面，在scFv的VH和VL结构域中进行改变。可以在每个结构域中进行相同数量的改变，或者可以在每个结构域中进行不同数量的改变。在某些方面，一个或多个变化是来自未修饰的母体scFv中存在的残基的保守氨基酸取代。在其他方面，一个或多个变化是来自未修饰的母体scFv中存在的残基的非保守氨基酸取代。当进行了多个取代时，在scFv的VH或VL结构域的一者或两者中，每个取代独立地是保守取代或非保守取代。在某些方面，所有取代是保守取代。在某些方面，所有取代是非保守的。在某些方面，至少一个取代是保守的。在某些方面，至少一个取代是非保守的。可单独使用或与本文所述的一种或多种额外方法组合使用的另一种方法是通过将存在于scFv的VH和/或VL结构域中的一个或多个残基突变以导入一个或多个取代，从而匹配已知的、经筛选的和/或经鉴定的抗体的VH和/或VL结构域的共有序列的所述特定位置处的最常见的残基。在某些方面，在scFv的VH结构域和/或VL结构域的一者或两者中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或多于六个位置处引入取代。可以在每个结构域中进行相同数量的改变，或者可以在每个结构域中进行不同数量的改变。在某些方面，与给定共有序列匹配的序列中的一个或多个变化是来自未修饰的VH和/或VL序列中存在的残基的保守氨基酸取代。在其他方面，一个或多个变化表示来自未修饰的VH和/或VL序列中存在的残基的非保守氨基酸取代。当进行了多个取代时，在scFv的VH或VL结构域的一者或两者中，每个取代独立地是保守取代或非保守取代。在某些方面，所有取代是保守取代。在某些方面，所有取代是非保守取代。在某些方面，至少一个取代是保守的。在某些方面，至少一个取代是非保守的。应当注意，描述为可用于修饰或稳定scFv部分的任何修饰可用于修饰Fab部分。例如，可以修饰Fab的可变结构域以改进稳定性，抗原结合等。此外，可以修饰Fab或scFv部分以降低免疫原性。在某些方面，抗体可以是包含可变轻链部分(VL)的scFv，该可轻链部分包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一个列出的氨基酸序列。在其他的实施例中，该scFv包含轻链部分，该轻链部分包含SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77中任一个列出的氨基酸序列。在某些方面，该scFv包含重链部分(VH)，该重链部分包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一个列出的氨基酸序列。在其他的实施例中，该scFv包含重链部分，该重链部分包含SEQIDNO:52、SEQIDNO:62和SEQIDNO:72中任一个列出的氨基酸序列。本文披露的抗体还可以包含一个或多个接头多肽。接头可以将重链结构域和轻链结构域(scFv)互连或将抗体或其抗原结合片段与另一种试剂(例如标记物、Fc结构域等)连接。接头可以在长度和序列上变化，并且是本领域通常已知的。可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来增加包含Fc区的抗体的血清半衰期。本文使用的术语“抗体半衰期”意指一种抗体的药物代谢动力学特性，它是抗体分子在它们的给予之后的平均存活时间的量度。抗体半衰期可以表示为从患者(或其他哺乳动物)的身体或其特定区室(例如，如在血清中测量的，即循环半衰期)，或在其他组织中消除50％已知量的免疫球蛋白所需要的时间。从一种免疫球蛋白或免疫球蛋白类别到另一种免疫球蛋白或免疫球蛋白类别，半衰期可以不同。通常，抗体半衰期的增加导致循环中所给予抗体的平均停留时间(MRT)的增加。半衰期的增加可以允许供给患者的剂量的减少以及给予频率的减少。为了增加抗体的血清半衰期，可以例如将补救受体结合表位并入到抗体(尤其是抗体片段)中，如在美国专利号5,739,277中所描述的。如在此使用，术语“补救受体结合表位”是指引起IgG分子的体内血清半衰期的增加的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)的Fc区的表位。可替代地，具有延长的半衰期的本披露的抗体可以通过对鉴别为参与Fc与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰而产生(参见例如美国专利号6,821,505和7,083,784；以及WO09/058492)。另外，可利用本领域中广泛使用的技术通过与PEG或白蛋白轭合来使本披露抗体的半衰期增加。落入本披露范围内的抗体可以通过本文鉴定的任何结构和/或功能特征来鉴定。例如，可以使用本文所示的任何技术或本领域已知的任何技术筛选抗体的特定结合特征(例如，K分离(Koff)、KD、IC50，对替格瑞洛和替格瑞洛代谢物的特异性/选择性)。标记物、轭合物和部分为了诊断和其他测定的目的，本披露的抗体可以轭合至标记物，在这些测定中可以检测抗体和/或其一个或多个靶标。标记物包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光性染料、叠层染料(tandemdye)、颗粒、半抗原、酶以及放射性同位素。在某些实施例中，该抗体轭合至荧光团。附接至抗体上的荧光团的选择将确定被轭合的抗体的吸收和荧光发射特性。可以用于抗体和抗体结合配体的荧光团标记物的物理特性包括但不限于：光谱特征(吸收、发射和斯托克斯位移)、荧光强度、寿命、极化以及光致漂白率、或其组合。所有这些物理特性可以用于将一个荧光团与另一个荧光团区分开，并且从而允许多元分析。荧光标记物的其他所希望的特性可以包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果将在细胞或模型生物体(例如，活体动物)中执行抗体的标记。在某些方面，酶是标记物并且轭合至抗体。因为可以获得可检测的信号的放大，从而得到提高的测定灵敏度，所以酶是合乎需要的标记物。酶自身不产生可检测的响应，但是当它被适当的底物接触时，起到分解底物的作用，这样使得被转化的底物产生荧光、比色或发光信号。因为标记试剂上的一种酶可以导致多个底物被转化成可检测的信号，所以酶将可检测的信号放大。选择酶底物以产生优选的可测量的产物，例如，比色、荧光或化学发光。这种底物广泛用于本领域并且是本领域技术人员熟知的，包括例如氧化还原酶如辣根过氧化物酶和底物如3,3’-二氨基联苯胺(DAB)；磷酸酶，例如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶以及底物例如5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)；糖苷酶，例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-葡糖苷酶以及底物如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)；另外的酶包括水解酶如胆碱酯酶和肽酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶、以及还原酶，对于这些酶适合的底物是已知的。酶以及其产生化学发光的适当底物适合于一些测定。这些包括但不限于天然和重组形式的荧光素酶和水母发光蛋白。磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物，如含有稳定的二氧杂环丁烷、鲁米诺、异氨基苯二酰肼以及吖啶酯的那些也是有用的。在另一方面，也利用如生物素的半抗原作为标记物。生物素是有用的，这是因为它可以在酶系统中起作用以进一步放大可检测的信号并且它可以充当一个有待在亲和色谱中使用用于分离目的标签。出于检测目的，使用对于生物素具有亲和力的酶轭合物，如抗生物素蛋白-HRP。随后添加一种过氧化物酶底物以产生可检测的信号。半抗原还包括激素、天然存在和合成的药物、污染物、过敏原、影响分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及相似物。在某些方面，荧光蛋白可以轭合至抗体作为标记物。荧光蛋白的实例包括绿色荧光蛋白(GFP)和藻胆蛋白以及其衍生物。荧光蛋白，特别是藻胆蛋白，对于产生叠层染料标记的标记物试剂尤其有用。出于获得较大的斯托克斯位移的目的，这些叠层染料包含荧光蛋白和荧光团，其中发射光谱从荧光蛋白的吸收光谱的波长发生更远的位移。在某些方面，标记物是放射性同位素。适合的放射性材料的实例包括但不限于：碘(121I、123I、125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(111In、112In、113mIn、115mIn)、锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(135Xe)、氟(18F)、153SM、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh以及97Ru。在一些方面，药物可以轭合至抗体。例如，包含scFv的抗体可以轭合至药物，用于治疗心血管疾病和/或急性冠状动脉综合征。在某些特征中，药物和其他分子可以通过位点特异性轭合靶向抗体。例如，抗体可以包含工程化半胱氨酸结构域(包括至结合单位和/或Fc结构域的一个或多个半胱氨酸)，这导致用于轭合反应的游离巯基。在某些方面，将抗体工程化以掺入特异性轭合位点。编码抗体的核酸分子本披露提供了编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子。本披露的一个方面提供编码本文具体描述的任何抗体的核酸分子。核酸分子可以编码抗体的重链和/或轻链可变区。在一些方面，该抗体是Fab或scFv，其中编码Fab或scFv的核酸部分包含编码VL结构域的核苷酸序列和编码VH的核苷酸序列，并且其中编码VL结构域的核苷酸序列任选地通过编码柔性多肽接头的核苷酸序列与编码VH结构域的核苷酸序列连接。另一方面提供了用本文所述的任何核酸分子转化的宿主细胞。在本披露的另一方面，提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含如本文所述的核酸分子。在一个方面，宿主细胞可以包含多于一种的载体。本披露涵盖编码本披露的任何抗体的核酸分子，以及抗体的轻链或重链。例如，本披露涵盖核酸分子，该核酸分子包括编码以下各项中的一个或多个的核苷酸序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:42、SEQIDNO:52、SEQIDNO:62、SEQIDNO:72、SEQIDNO:7、SEQIDNO:17、SEQIDNO:27、SEQIDNO:37、SEQIDNO:47、SEQIDNO:57、SEQIDNO:67和SEQIDNO:77。本披露进一步涵盖编码本披露的任何抗体的核酸分子，该核酸分子进一步包含另外的区域(例如，Fc或修饰的Fc)。在一些实施例中，核酸分子可以选自以下各项中的一个或多个：SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:16、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:31、SEQIDNO:36、SEQIDNO:41、SEQIDNO:46、SEQIDNO:51、SEQIDNO:56、SEQIDNO:61、SEQIDNO:66、SEQIDNO:71或SEQIDNO:76。在其他的实施例中，本披露提供一种载体，该载体包括选自以下各项中的一个或多个的核酸分子：SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:16、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:31、SEQIDNO:36、SEQIDNO:41、SEQIDNO:46、SEQIDNO:51、SEQIDNO:56、SEQIDNO:61、SEQIDNO:66、SEQIDNO:71或SEQIDNO:76。用于产生抗体、Fab和scFv的方法本披露提供了用于产生本文所述的抗体及其片段的方法。在一些方面，识别替格瑞洛的抗体的抗原结合片段和在此披露的替格瑞洛和/或TAM的特异性表位可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，Fab和F(ab’)2片段可由抗体通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生F(ab’)2片段)的免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解来产生。另外，如本文所述的包括scFv和Fab的抗体可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生。通常，在噬菌体展示方法中，将功能抗体域展示在噬菌体颗粒表面上，这些颗粒携带对其进行编码的多核苷酸序列。具体地说，编码VH和VL结构域的DNA序列是从动物cDNA文库(例如，淋巴组织的人或鼠类cDNA文库)来扩增。通过PCR将编码这些VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起，并且克隆至噬粒载体中。将该载体以电穿孔转至大肠杆菌中，并且用辅助噬菌体对该大肠杆菌进行感染。在这些方法中所使用的噬菌体可以是包括fd和M13的丝状噬菌体，并且这些VH和VL结构域可以与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。表达结合替格列洛和/或TAM的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或结合或捕获于固体表面或珠粒上的抗原。类似地，除了替格列洛和/或TAM之外，结合抗原/半抗原的结合结构域可以被鉴定用于去选择。可用于制作本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括在以下文献中披露的那些：布林克曼(Brinkman)等人，1995，免疫学方法杂志182:41-50；艾姆斯(Ames)等人，1995，免疫学方法杂志184:177-186；科托博洛(Kettleborough)等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24:952-958；帕斯克(Persic)等人，1997，基因(Gene)187:9-18；伯顿(Burton)等人，1994，免疫学进展(AdvancesinImmunology)57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/O1134；PCT公开号WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和WO97/13844；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743以及5,969,108；这些文献各自通过引用以其全部内容结合在此。如上文参考文献中所述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并且用于产生包括人类抗体的完整抗体或任何其他所希望的抗原结合片段(scFvs和Fab)，并且表达在任何所希望的宿主之中，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母以及细菌，例如如下文详细描述的。重组产生Fab、Fab’以及F(ab')2片段的技术还可以使用在本领域中已知的方法来加以利用，如在以下文献中披露的那些方法：PCT公开号WO92/22324；马利纳克斯(Mullinax)等人，1992，生物技术12(6):864-869；泽井(Sawai)等人，1995，美国生殖免疫杂志34:26-34；以及贝特尔(Better)等人，1988，科学(Science)240:1041-1043(所述参考文献通过引用以其全部内容结合在此)。在某些方面，可以将本文披露的核酸可操作地连接至表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列。编码抗体轻链和重链的核酸序列能以任何方向(例如，轻链在重链前面，或反之亦然)克隆在相同的表达载体中，或者可以克隆在两种不同的载体中。如果使用一种载体进行表达，则两种编码基因可以具有它们自己的遗传元件(例如，启动子、RBS、前导序列、终止、polyA等)，或者它们可以用一组遗传元件克隆，但与顺反子元件相连。调控核苷酸序列通常适合用于表达的宿主细胞。用于多种主宿主胞的许多类型的适当的表达载体和适合的调控序列是本领域已知的。典型地，所述一个或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活序列。本披露期望如本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或组合一个以上启动子组分的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体(例如质粒)上，或表达构建体可以插入染色体中。在某些方面，表达载体含有选择标记基因以允许转化的宿主细胞的选择。选择标记基因在本领域是熟知的并且将随着使用的宿主细胞而变化。在某些方面，本披露涉及包含核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列编码多肽并且可操作地连接至至少一个调控序列。调控序列是本领域公认的并且被选择为指导编码的多肽的表达。因此，术语调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性的非限制性调控序列描述于哥德尔(Goeddel)，基因表达技术：酶学中的方法(GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology)，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥市(1990)中。应当理解的是，表达载体的设计可以取决于这样的因素，如将要转化的宿主细胞的选择和/或希望表达的蛋白质的类型。而且，还应当考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和由所述载体编码的任何其他蛋白质(例如抗生素标记)的表达。用于产生本披露的抗体的方法可以包括例如用一种或多于一种表达载体转染的宿主细胞，所述表达载体编码抗体(例如，编码重链和轻链或其可变区的单一载体；或两个载体，一个编码重链，一个编码轻链或其可变区)，所述宿主细胞可以在适当的条件下培养以允许抗体的表达发生。可以从含有该抗体的细胞和培养基的混合物中分泌和分离抗体。可替代地，抗体可以保留在细胞质或细胞膜部分中并且收获、裂解细胞并分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。适合的用于细胞培养的培养基是本领域熟知的。可以使用本领域已知的用于纯化蛋白质、抗体及其抗原结合抗体片段的技术从细胞培养基、宿主细胞或二者中分离抗体，所述技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳和免疫亲和纯化。在某些方面，将抗体制备为包含重链和轻链可变区的抗体的抗原结合片段，其可以增加溶解度和促进纯化。可以通过将克隆基因或其部分连接至载体来产生重组核酸，所述载体适合在原核细胞、真核细胞(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达。用于产生重组多肽的表达载体包括质粒和其他载体。例如，适合的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞，例如大肠杆菌中表达的pBR322-衍生的质粒、pEMBL-衍生的质粒、pEX-衍生的质粒、pBTac-衍生的质粒以及pUC-衍生的质粒。在某些方面，哺乳动物表达载体含有促进载体在细菌中增殖的原核序列、以及在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体为适合用于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒(例如pBR322)的序列修饰，以促进在原核细胞和真核细胞中的复制和抗药性选择。可替代地，可以使用病毒的衍生物用于在真核细胞中暂时表达蛋白质，这些病毒如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)。在这些质粒的制备和宿主生物的转化中使用的多种方法是本领域熟知的。对于用于原核和真核细胞两者的其他适合的表达系统、以及通用重组程序，参见分子克隆实验指南(MolecularCloningALaboratoryManual)，第二版，萨姆布鲁克(Sambrook)，弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)编，(冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1989)第16和17章。在一些情况下，通过使用杆状病毒表达系统表达重组多肽可能是所希望的。这样的杆状病毒表达系统的实例包括PVL衍生的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(例如pAcUWl)和pBlueBac衍生的载体(例如含有β-gal的pBlueBacIII)。制备融合基因的技术是熟知的。本质上，根据常规技术进行对编码不同多肽/抗体序列的各种核酸片段的接合，采用用于连接、限制性内切酶消化的平端或交错端以提供适当的末端，酌情加入粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的接合和酶连接。在其他方面，可以通过常规技术，包括DNA自动合成仪来合成融合基因。可替代地，可以使用锚定引物对基因片段进行PCR扩增，这产生两个连续核酸片段之间的互补突出(complementaryoverhang)，所述连续基因片段可随后进行退火以产生嵌合基因序列(参见，例如，现代分子生物学实验技术(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，奥苏伯尔(Ausubel)等人编，约翰威利父子出版公司(JohnWiley&Sons)：1992)。在一些方面，表达本文所述的任何核酸的表达载体可用于在宿主细胞中表达抗体。例如，可以在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达抗体。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员已知的。一旦通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中，然后就通过常规技术培养转染的细胞以便产生抗体。因此，本披露包括含有编码抗体或其片段的多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸与异源启动子可操作地连接。在某些方面，重链和轻链两者和/或重链和轻链可变区可以在宿主细胞中共表达(来自相同或不同的载体)以表达整个抗体。在某些方面，抗体的重链和轻链两者均由单个启动子表达。在某些方面，抗体的重链和轻链由多个启动子表达。在某些方面，抗体的重链和轻链在单个载体上编码。在某些方面，抗体的重链和轻链在多个载体上编码。作为用于表达重组抗体的宿主可获得的哺乳动物细胞系是在本领域中已知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、人上皮肾293细胞、以及多种其他细胞系。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以便确保所表达的抗体或其部分的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器(cellularmachinery)的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性地产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。在一方面，通过使人淋巴细胞永生化而产生的人细胞系可以用来重组产生单克隆抗体。在一方面，可以使用人细胞系PER.C6.(库赛尔公司(Crucell)，荷兰)以重组方式产生单克隆抗体。可以用作表达重组抗体的宿主的另外的细胞系包括但不限于昆虫细胞(例如Sf21/Sf9，粉纹夜蛾(Trichoplusiani)Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(例如啤酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母属(Pichia)、US7326681；等)、植物细胞(US20080066200)；以及鸡细胞(WO2008142124)。在某些方面，本披露的抗体在细胞系中稳定表达。稳定表达可用于长期、高产量地生产重组蛋白、抗体及其抗原结合片段。例如，可以产生稳定表达抗体分子的细胞系。可以用包含表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标志基因的适当工程化的载体转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许将质粒稳定整合进其染色体中的细胞生长并且形成病灶，进而可以将其克隆并且扩增成细胞系。用于以高产量产生稳定细胞系的方法是在本领域中熟知的，并且试剂通常是可商购的。在某些方面，本披露的抗体在细胞系中瞬时表达。瞬时转染是这样一种方法：在该方法中引入细胞的核酸不会整合至该细胞的基因组或染色体DNA中。事实上该核酸被维持作为细胞中的染色体外元件，例如，作为附加体。附加体的核酸的转录过程不受影响，并且产生由附加体的核酸编码的蛋白质。稳定或瞬时转染的细胞系被维持在本领域中熟知的产生单克隆抗体的表达和产生的细胞培养基和条件中。在某些方面，哺乳动物细胞培养基是基于可商购的培养基配制品，包括例如DMEM或汉姆氏(Ham's)F12。在其他方面，将细胞培养基进行改良以便支持细胞生长和生物蛋白表达两者的增长。如在此所使用的术语“细胞培养基”、“培养基”、以及“培养基配制品”是指在一个多细胞有机体或组织以外的一个人工体外环境中用于细胞的维持、生长、繁殖、或扩增的营养液。可以将细胞培养基优化以用于特定的细胞培养用途，包括例如，被配制来促进细胞生长的细胞培养物生长培养基，或者被配制来促进重组蛋白产生的细胞培养物生产培养基。术语营养素、成分、以及组分(component)在此可互换地使用，是指组成细胞培养基的组分(constituent)。一旦分子已经产生，就可以通过本领域中已知的用于免疫球蛋白分子及其片段的纯化的任何方法将其纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力(特别是通过对于特定抗原的亲和力、蛋白A或蛋白G)，以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质、抗体、和/或抗体片段的纯化的任何其他标准技术。此外，本披露的分子或其片段可以融合至本文所描述的或者本领域中另外已知的异源多肽序列(在此称为“标签”，如组氨酸标签)，以便促进纯化。在使用重组技术时，分子可以细胞内、在周质间隙中产生，或直接分泌至培养基之中。如果分子是在细胞内产生，那么作为第一步，(例如)通过离心或超滤去除宿主细胞或溶解片段的颗粒碎片。卡特(Carter)等人，生物/技术(Bio/Technology)，10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间中的抗体的程序。在分子分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购的蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)对来自这类表达系统的上清液进行浓缩。蛋白酶抑制剂如PMSF可以被包括在任何前述步骤中以便抑制蛋白水解，并且抗生素可以被包括来防止外来污染物的生长。从细胞制备的组合物可以单独使用例如羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、渗析和/或亲和色谱或与其他纯化步骤组合来纯化。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于分子中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型并且将由本领域的技术人员理解。附接有亲和配体的基质最常为琼脂糖，但其他基质也是可用的。在机械上稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。取决于待回收的分子也可用其他蛋白质纯化技术，如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上色谱、肝素上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上SEPHAROSE色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。在任何一个或多个初步纯化步骤之后，包含感兴趣的分子和污染物的混合物可以经受低pH疏水性相互作用色谱，该色谱使用pH介于约2.5与4.5之间的一种洗脱缓冲液并且在低盐浓度(例如，从约0至0.25M盐)下进行。可以使用例如上文和/或实例中所述的任何一种或组合的技术制备和纯化抗体。不管抗体如何被纯化，为了证实本披露的抗体的功能性结合，可以进行结合测定(在纯化之前和/或之后)。例如，可以使用双重ELISA测定。在一些方面，将第一抗原(例如替格瑞洛或其竞争剂)包被在孔上，并且与该抗原的结合固定抗体，准备用于检测。药用配制品在某些方面，本披露提供药物组合物。这类药物组合物可以是包含编码抗体的核酸分子的组合物。这类药物组合物还可以是包含抗体、或抗体的组合、以及药学上可接受的赋形剂的组合物。在某些方面，本披露的药物组合物用作药剂。在某些方面，抗体或抗体的组合(或编码一种抗体或抗体组合的核酸分子)可以与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂一起配制成药物组合物。在某些方面，这类药物组合物适于使用本领域中已知的方法经由任何一个或多个给予途径来给予人或非人动物。如熟练的业内人士将理解，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。术语“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种无毒材料。此类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如“雷明顿药物科学与实践(Remington:TheScience&PracticeofPharmacy)”，第21版，利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins)(2005)以及“医师案头参考(Physician’sDeskReference)”，第60版，医药经济出版社(MedicalEconomics)，蒙特维尔(Montvale)，新泽西(2005)中所列出。可以选择对于所希望或所要求的给予方式、溶解度和/或稳定性来说合适的药学上可接受的载体。在此所述的配制品包含处于产生适用于所希望的剂量的w/v的浓度的活性剂(例如抗体或抗体片段，例如Fab或scFv)。在某些方面，活性剂在配制品中以约1mg/ml至约200mg/ml、约1mg/ml至约100mg/ml、约1mg/ml至约50mg/ml、或1mg/ml与约25mg/ml的浓度存在。在某些方面，活性剂以约25mg/ml的浓度存在。在某些方面，配制品中活性剂的浓度可以从约0.1重量％至约100重量％变化。在某些方面，活性剂的浓度的范围是0.003至1.0摩尔浓度。在一方面，本披露的配制品是基本上不含内毒素和/或相关热原物质的无热原配制品。内毒素包括限制在微生物体内并且仅当微生物破坏或死亡时才释放出来的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的诱导发热的热稳定的物质(糖蛋白类)。如果向人类给予这两种物质，会引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，即使低量的内毒素也必须从静脉内给予的药物溶液中去除。食品与药物管理局(“FDA”)已经针对静脉内药物给予，设置了在单个一小时内每公斤体重每剂量的5个内毒素单位(EU)的上限(TheUnitedStatesPharmacopeialConvention，PharmacopeialForum(美国药典委员会，药典论坛)26(1):223(2000))。在某些具体方面，组合物中的内毒性和热原水平是小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。当用于体内给予时，本披露的配制品应是无菌的。本披露的配制品可以通过各种灭菌方法来灭菌，这些灭菌方法包括无菌过滤、辐射等等。在一个方面，配制品用一个预先灭菌的0.22-微米的滤器来过滤灭菌。用于注射的无菌组合物可以根据“雷明顿药物科学与实践”，第21版，利平科特威廉斯威尔金斯出版公司(2005)中描述的常规药学实践来配制。本披露的治疗组合物可以配制用于特定的给予途经，如口服、经鼻、经肺、局部(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给予。如在此使用的措辞“肠胃外给予(parenteraladministration)”和“肠胃外地给予(administeredparenterally)”是指除了肠道和局部给予以外的给予方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。本披露的适合于局部或经皮给予的配制品包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂以及吸入剂。抗体可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合、并且与可能要求的任何防腐剂、缓冲剂、或推进剂混合(美国专利号7,378,110；7,258,873；7,135,180；美国专利号2004-0042972；以及2004-0042971)。这些配制品可以合宜地呈现为单位剂型，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。本披露的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化以便于获得有效实现对于具体的患者、组合物、以及给予方式来说希望的治疗应答而对患者无毒的量(例如，“治疗有效量的”)的活性成分。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的具体组合物的活性、给予途径、给予时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。合适剂量的范围可以是从约0.0001至约100mg/kg体重或更大，例如约0.1、1、10、或50mg/kg体重，其中约1至约10mg/kg体重是合适的。应注意，本披露类似地涵盖：还可以制备适于诊断和研究使用的配制品。这类配制品中的活性剂的浓度以及赋形剂和/或热原的存在或缺乏可以基于具体应用和预期用途来选择。用途本文披露的抗体可用于治疗方法，包括联合治疗，用于中和血小板活化、聚集和脱颗粒的抑制剂，血小板分解促进剂和抗血栓形成剂的活性。因此，本文所述的抗体可用于与替格瑞洛的给予(包括伴随方法)相关的许多应用中，并且适合用于中和替格瑞洛和/或替格瑞洛的一种或多种代谢物的作用。在这样的方法中，该抗体可以任选地可逆地减少、中和、消除或否则抑制替格瑞洛的活性，并治疗或预防与替格瑞洛给予相关的和/或由包含替格瑞洛的治疗产生的许多效应、病症和/或症状。抗体可以给予至正在接受治疗的患者，或者需要治疗或预防可治疗的适应症和/或具有适于替格瑞洛(倍林达)的适应症的患者，适应症包括例如不稳定心绞痛、动脉粥样硬化的原发性动脉血栓并发症如血栓形成性或栓塞性中风、短暂性缺血发作、外周血管疾病、伴有或不伴有溶栓的心肌梗死、由于动脉粥样硬化疾病的动脉并发症(例如血管成形术，包括冠状动脉血管成形术(PTCA)、内膜切除术、支架置入、冠状动脉和其他血管移植手术)、手术或机械损伤的血栓性并发症(例如意外或手术创伤后的组织补救、包括皮肤和肌肉瓣的重建手术)、具有弥散性血栓形成/血小板消耗组分的病症(例如弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、败血症的血栓形成并发症、成人呼吸窘迫综合征、抗磷脂综合征、肝素诱发的血小板减少症和先兆子痫/子痫)、或静脉血栓形成(如深静脉血栓形成)、静脉闭塞性疾病、血液病症(如骨髓增生性疾病，包括血小板增多症、镰状细胞疾病)；或预防体内机械诱导的血小板活化，例如心肺旁路和体外膜氧合(预防微血栓栓塞)，体外机械诱导的血小板活化，例如用于保存血液制品如血小板浓缩物、或分流阻塞例如肾透析和血浆置换、继发于血管损伤/炎症的血栓形成如血管炎、动脉炎、肾小球肾炎、炎性肠病和器官移植排斥、病症(如偏头痛)。在一些实施例中，本文披露的抗体可以给予至正接受或已经接受包含替格瑞洛的治疗的患者，以及需要治疗或即将需要治疗的患者，用于与冠状动脉旁路移植术(CABG)、心胸外科手术、纵隔再探查、术后中风、机械通气、在重症监护室长期停留、紧急非心脏手术(例如神经或眼科手术、脊柱手术、颅内手术，眼眶外科手术、整形外科手术、肾切除术、半结肠切除术等)相关的出血或潜在出血。因此，本文提供的方法可以包括将抗体作为与替格瑞洛的共治疗剂(同时)给予，或在替格瑞洛给予(例如，分钟，小时或天)后的一段时间内给予。例如，在一些实施例中，该方法可包括在替格瑞洛给予的10-120分钟内向已经给予替格瑞洛的患者给予抗体。在一些实施例中，该方法可包括在替格瑞洛给予的1-48小时内向已经给予替格瑞洛的患者给予抗体。在一些实施例中，将抗体给予至已经在不允许从受试者中代谢和消除替格瑞洛和/或其代谢物的时间量内给予替格瑞洛的受试者。在一些实施例中，本披露提供了抑制替格瑞洛或其活性代谢物对患者中的(P2Y12)受体的作用的方法。在一些实施例中，本披露提供了抑制替格瑞洛或其活性代谢物与患者体内的P2Y12受体结合的方法。在一些实施例中，本披露提供了在已经给予替格瑞洛的患者中激活ADP诱导的血小板聚集的方法。本披露的抗体，例如实例中举例说明的那些，也可用于诊断目的。例如，可在受试者的组织或细胞中检测一种或多种靶向因子(替格瑞洛或其代谢物)，以确定或筛选受试者中替格瑞洛的循环量。诊断试剂盒可以包含一种或多种抗体，以及用于指示抗体与替格瑞洛或其代谢物(如果存在的话)的反应的检测系统。因此，本披露涵盖抗体的许多用途，包括治疗、诊断和研究用途。诊断和研究用途可以是体内的或离体的。试剂盒本披露的另一方面是试剂盒。在一个方面，试剂盒包含上述核酸、抗体、表达载体或宿主细胞的任何组合物或药物组合物，以及指导适当使用或给予的说明书或标签。任选地，试剂盒还可以包括一个或多个容器和/或注射器或其他装置以便于递送或使用。本披露考虑用于进行研究测定、诊断测定和/或用于给予治疗有效量的组分的全部或任何子集可以封装在试剂盒中。类似地，试剂盒可以包括通过例如在合适的条件下培养表达编码本披露的抗体的核酸的宿主细胞来制备抗体的说明书。作为另外的实例，本披露的抗体的治疗性给予的试剂盒可以包含含有抗体的药物配制品的溶液或抗体的冻干制剂，以及用于将该组合物给予至向对其有需要的患者的说明书，和/或用于重构冻干产物的说明书。在某些实施例中，试剂盒还包含以适于给予至受试者的处于配制品中的替格瑞洛(例如，倍林达TM(BRILINTATM，BRILIQUETM))。在这样的实施例中，试剂盒还可以包括向需要用抗体、替格瑞洛或抗体和替格瑞洛两者治疗的患者给予抗体和替格瑞洛配制品的说明书。本披露还涵盖完成包装的并且带标签的药物产品。这种制造物品包括在适当器皿或容器(例如，玻璃小瓶或其他密封容器)中的适当的单位剂型。在适于肠胃外给予的剂型的情况下，活性成分，例如上述抗体和/或替格瑞洛配制品是无菌的，并且适于作为无颗粒溶液给予。在某些方面，所述配制品适合于可注射的给予途径。在一些实施例中，该给予是皮下给予。在一些实施例中，该给予是静脉内给予。因此，考虑包括注射或输注给人或动物的给予途径。在特定的方面，将本披露的配制品配制为在单剂量小瓶中的无菌液体。示例性的容器包括但不限于小瓶、瓶子、预填充注射器、IV包、泡罩包装(包含一个或多个药丸)。任选地，与这样一个或多个容器相关的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映针对人类诊断和/或给予的政府机构对制造、使用或销售的许可。与任何药物产品一样，包装材料和容器被设计为在储存和装运期间保护产品的稳定性。此外，本披露的产品包括建议医师、技术员或患者关于如何适当预防或治疗所讨论的疾病或病症的使用说明书或其他信息材料。换句话说，制造物品包括指示或建议给药方案(包括但不限于实际剂量、监测程序、等)，以及其他监测信息的说明书工具。用于诊断测定的试剂盒可以包含本披露的含有抗体的溶液或抗体的冻干制剂，以及用于检测这样的抗体的试剂，其中该抗体特异性结合替格瑞洛和/或其代谢物。抗体可以根据本领域已知的和本文描述的方法标记，包括但不限于例如小分子荧光标签、蛋白质例如生物素、GFP或其他荧光蛋白，或表位序列例如his或myc的标记物。类似地，用于检测抗体的一抗可以包括在试剂盒中。一抗可以针对抗体上的序列或针对标记的抗体的标记物、标签或表位。一抗可以进而被标记用于检测，或者如果需要进一步扩增信号，则一抗可以通过二抗检测，二抗也可以包括在试剂盒中。也考虑用于研究用途的试剂盒。这样的试剂盒可以例如类似于旨在用于诊断或治疗用途的试剂盒，但还包括指定试剂盒及其使用仅限于研究目的的标签。实例缩写列表缩写说明ACN乙腈br宽峰BSA牛血清白蛋白CV柱体积d二重峰dd双二重峰DCM二氯甲烷DMFN,N-二甲基甲酰胺DMSO二甲基亚砜DPBS杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水EDC1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EtOAc乙酸乙酯FA甲酸HOAc乙酸HPLC高效液相色谱HRMS高分辨率质谱HTS高通量筛选均相时间分辨荧光助滤剂，煅烧的助熔剂，用碳酸钠处理Hz赫兹J偶联常数LC液相层析法m多重峰MS质谱NMR核磁共振OAc乙酸盐Pd/C钯炭pM皮摩尔PK/PD药代动力学/药效学KF氟化钾q四重峰r.t.室温s单峰sat.饱和的scFv单链片段变量t三重峰TFA三氟乙酸TEA三乙基胺TBME叔丁基甲醚THF四氢呋喃TIM替格瑞洛无活性代谢物TLC薄层色谱术TR-FRET时间分辨荧光共振能量转移实例1：半抗原的制备和表征本实例描述了用于产生如本文所述的示例性抗体的几种半抗原的合成、优化、分离和表征的方法。该半抗原包括替格瑞洛、替格瑞洛代谢物(TAM和TIM)、生物素化替格瑞洛和生物素化的腺苷(参见例如图2的非生物素化形式的半抗原化学结构)。如国际专利申请WO2000/034283(盖尔(Guile)等人，2000)中所述合成替格瑞洛，且如国际专利申请WO1999/005143(盖尔(Guile)等人，1999)中所述合成TAM，将其各自通过引用以其全文结合在此。使用Biotage硅胶40S、40M、12i或Merck硅胶60(0.063-0.200mm)进行直相色谱法。使用标准玻璃柱或塑料柱或在BiotageHorizon系统上进行快速色谱法。用溶剂作为内标，以ppm给出化学位移。仅在NMR中检测时报告杂原子如NH和OH质子上的质子，因此该质子可能缺失。实例1.1：生物素化替格瑞洛N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,3-二羟基环戊基)氧基)乙基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.1)(i)2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氢-3aH-环戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)氧基)乙基甲烷磺酸盐(1.a)的制备将甲磺酰氯(0.086mL，1.10mmol)在0℃下逐滴添加至2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氢-3aH-环戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)氧基)乙醇(参见斯普朗索普(Springthorpe)，B.等人，生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，2007,17,6013-6018)(0.563g，1.0mmol)和TEA(0.209mL，1.50mmol)在DCM(5mL)的溶液中。将混合物从0℃至5℃经3h搅拌。将该反应混合物用DCM(30mL)稀释，并且用水(5mL)洗涤。将混合物通过穿过相分离器干燥。蒸发溶剂并从甲苯共蒸发，得到标题化合物(1.a)(714mg，111％)，为黄色粘稠油状物，其未经进一步纯化而直接以粗制品使用。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.02-1.47(m,1H),1.55-1.72(d,2H),2.20-2.71(m,1H),2.97(dd,2H),3-3.19(m),3.57-3.68(m,1H),3.69-3.79(m,1H),4.02-4.24(m,1H),4.78(s,3H),5.13(s,3H),5.57(d,2H),6.50(d,2H),7.03(s,1H),7.07(s,1H)。19FNMR(376MHz,CDCl3)δ-141.37(J＝21.3),-138.10(J＝21.3)。(ii)3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-叠氮乙氧基)-2,2-二甲基四氢-3aH-环戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.b)的制备将2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氢-3aH-环戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)氧基)乙基甲烷磺酸盐(1.a)(0.641g，1mmol)和叠氮化钠(0.070mL，2.00mmol)在DMF(7mL)中的混合物加热至60℃，并在氮气环境下保持15.5h。形成白色沉淀。添加水(20mL)，产物用TBME(100+40mL)萃取两次。将有机相经Na2SO4干燥。将有机相过滤且在减压下除去溶剂。残余物通过快速色谱法在2×8cm硅胶柱上纯化，使用庚烷/EtOAc1/1作为洗脱剂(TLC使用庚烷/EtOAc1/1(Rf产物＝0.5))。收集相关馏分并蒸发溶剂，得到透明稠油状的标题化合物(1.b)(514mg，87％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.00-1.46(m,2H),1.42(q,1H),1.59-1.73(m,1H),2.17(dd,2H),2.68(t,2H),2.96(s,3H),3.19-3.33(m,4H),3.52-3.63(m,1H),3.72(s,3H),4.03(s,1H),4.79(d,1H),5.13(s,1H),5.54(d,2H),6.43(s,1H),6.96(d,2H)。(iii)中间体3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-氨基乙氧基)-2,2-二甲基四氢-3aH-环戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.c)的制备将在EtOH(99.5％)(2mL)中的3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-叠氮乙氧基)-2,2-二甲基四氢-3aH-环戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.b)(62.0mg，0.11mmol)添加至Pd/C(5％Pd，50wt％Pd/C，22.46mg，5.28μmol)并且混合物在标准大气压下氢化2h。将反应混合物通过过滤，并用EtOH(99.5％)进一步冲洗塞子。在减压下除去溶剂，将残余物再溶解于DCM(2×2mL)中，并在减压下除去溶剂。残余物通过快速色谱法在2×8cm硅胶柱上纯化，使用在MeOH95/5中的DCM/NH3(饱和的)作为洗脱剂。收集相关馏分，得到标题化合物(1.c)(41mg，69％)。1HNMR(400MHz；CDCl3):δ0.98(d,3H),1.28(d,3H),1.54(t,3H),1.621.81(m,1H),2.15(s,3H),2.48(dt,1H),2.81(d,1H),3.07(d,1H),3.34(dd,1H),3.53(d,1H),3.99(dd,1H),4.79(dd,1H),5.12(dd,1H),5.52(d,1H),7.02(t,1H),7.09-7.67(m,2H),7.23(s,1H)。19FNMR(376MHz,CDCl3)δ-141.43(J＝21.3),-138.13(J＝21.3)。(iv)中间体(1S,2S,3S,5R)-3-(2-氨基乙氧基)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)环戊烷-1,2-二醇(1.d)的制备将已预冷的、冰/水浴温度的TFA(8mL，103.84mmol)和水(0.88mL，48.85mmol)的混合物添加至已预冷的盛有3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-氨基乙氧基)-2,2-二甲基四氢-3aH-环戊烷并[d][1,3]二氧-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.c)(340mg，0.61mmol)的烧瓶中。在0℃-5℃下将该反应混合物搅拌1h。在减压下除去溶剂，并且将残余物溶于DCM(100mL)中，用NaHCO3(饱和的，10mL)进行洗涤。将盐水(5mL)添加至水相中，并用EtOAc(30mL)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥。过滤，然后蒸发溶剂，得到粗产物，为灰白色固体。将该化合物通过制备型HPLC在XBridgeC18柱(10μm250x50IDmm)上使用梯度为于H2O/ACN/MeCN/AcOH95/5/0.2缓冲液中的35％-75％ACN，经20分钟以100mL/min的流速进行纯化。将这些化合物通过UV在298nm处检测。将峰馏分在减压下蒸发至干。将残余物溶于DCM中，并且通过相分离器过滤。在减压下除去溶剂，得到标题化合物(1.d)(213mg，67.5％)。LC/MS:m/z522.3[M+H]+。(v)化合物N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,3-二羟基环戊基)氧基)乙基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺的制备。(1.1)将2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酸盐(21.77mg，0.04mmol)添加至(1S,2S,3S,5R)-3-(2-氨基乙氧基)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)环戊烷-1,2-二醇(20mg，0.04mmol)在干DMF(1.0mL)的溶液中，并将混合物置于氮气环境下并且室在温下搅拌6h。将溶剂在减压下在40℃下去除。将该化合物通过制备型HPLC在KromasilC18柱(10μm250x20IDmm)上使用梯度为于H2O/ACN/FA95/5/0.2缓冲液中的20％-60％ACN，经20分钟以19mL/min的流速进行纯化。将这些化合物通过UV在298nm处检测。收集峰馏分，浓缩，并冷冻干燥，得到标题化合物(1.1)(21.4mg，57.3％)。1HNMR(600MHz,DMSO)：存在两种旋转异构体(比例5:1)，来源于主要旋转异构体的信号为δ0.81(t,3H),1.15-1.64(m,20H),2.03(ddd,7H)ddd,1H),2.57(d,1H),2.59-2.67(m,1H),2.77-2.89(m,2H),2.93(dd,1H),2.96-3.01(m,4H),3.05-3.12(m,1H),3.15(td,1H),3.18-3.25(m,2H),3.39-3.46(m,1H)1H),4.08-4.14(m,1H),4.30(dd,1H),4.54(dd,1H),4.95(q,1H),5.06(s,1H),5.13,1H),6.42(s,1H),7.07(d,1H),7.31(ddt,2H),7.71(dt,2H),7.82(t,1H),9.36(d,1H)。所选择的、来自次要旋转异构体的信号为δ0.98(CH3),8.95(ArNH)。HRMS计算为[[C45H65F2N11O7S2]+974.4556；发现值：974.4585(M+H)+实例1.2：生物素化的腺苷N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.2)(i)N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.e)的制备在室温下，将DMF(2mL)添加至2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酸盐(55.6mg，0.10mmol)和9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(氨基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(30mg，0.10mmol)中(参见奥斯汀(Austin)、D.J.和刘(Liu)、F.四面体快报(Tetrahedr.Lett.)2001,3153-3154)，并且将反应混合物置于氮气环境下，搅拌1小时45分钟，得到(1.e)。随后将溶剂在减压下除去。以粗制品使用，无需进一步纯化。LC/MS:m/z＝759[M-H]-,757[M+H]+。(ii)最终化合物N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.2)的制备将TFA(1.8ml，23.36mmol)和水(0.2mL，11.10mmol)的混合物添加至粗的N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(1.e)(76mg，0.1mmol)并且将反应混合物在0℃下搅拌1小时25分钟。在减压下除去溶剂并且将残余物溶解于DMSO中。将该化合物通过制备型HPLC在XBridgeC18柱(10μm250x19IDmm)上使用梯度为于H2O/ACN/NH395/5/0.2缓冲液中的5％-45％ACN，经20分钟以19mL/min的流速进行纯化。将这些化合物通过UV在259nm处检测。将峰馏分浓缩并冷冻干燥，得到标题化合物(1.2)(50mg，69.6％)，为白色蓬松固体。1HNMR(600MHz,DMSO,40℃)δ1.17-1.26(m,4H),1.27-1.4(m,6H),1.43-1.54(m,7H),1.62(ddt,1H),1.99-2.06(m,4H),2.12(t,2H),2.58(d,1H),2.82(dt,1H),2.96-3.05(m,4H),3.05-3.14(m,1H),3.36(dt,1H),3.44(dt,1H),3.96(dd,1H),4.04(dd,1H),4.11-4.15(m,1H),4.29-4.33(m,1H),4.67(dd,1H),5.16(d,1H),5.38(d,1H),5.84(d,1H),6.29(s,1H),6.33(d,1H),7.25(s,2H),7.64(dt,2H),8.11(t,1H),8.16(s,1H),8.31(s,1H)。HRMS计算值为[[C32H50N10O7S]+719.3657；发现值：719.3667(M+H)+实例2：抗替格瑞洛/TAM抗体的分离和鉴定该实例说明了可用于生产替格瑞洛及其代谢物的抗体的策略和技术，所述化合物与ATP具有结构相似性并且含有腺苷样核心(斯普朗索普(Springthorpe)等人，2007，生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)17:6013-6018))。替格瑞洛/替格瑞洛活性代谢物(TAM)和替格瑞洛无活性代谢物(TIM)的化学结构示于图2中。如上讨论的，本文披露和产生的抗体可以结合并中和替格瑞洛和TAM，并且可以结合TIM，但不结合或显著抑制其他结构相关的化合物例如腺苷。虽然对TIM的结合活性是在此披露的抗体的任选特征，但是预期显示对TIM的结合活性的抗体不影响所需的抗体/解毒剂的剂量，因为TIM通常代表替格瑞洛代谢物的小的或不显著的馏分。靶向共同的表位，即替格瑞洛和TAM的独特的R基团(二氟苯基-环丙基和硫丙基取代基)，以赋予这些化合物抗体结合特异性和选择性。感兴趣的表位由图2中的虚线包围。使用实例1中描述的半抗原将抗体表位指向二氟苯基-环丙基和硫丙基取代基。如实例1所述，生物素化半抗原(生物素化替格瑞洛和生物素化的腺苷)的接头位于二醇基团上。该策略允许产生对未修饰的二氟苯基-环丙基和硫丙基具有结合特异性的抗体，用于生物素化替格瑞洛/TAM，并且还能够筛选和去选择结合腺苷的抗体文库。使用已知技术，使用人scFv噬菌体展示文库来产生scFv抗体，并且在对生物素化替格瑞洛的一系列重复选择循环中以及对生物素化腺苷的一系列重复去选择循环中从文库中分离特异性scFv，基本上如下所述：劳埃德(Lloyd)等人，2009，蛋白质工程设计和选择(PEDS)22:159-168，将其通过引用并入本文。选择来自第2轮和第3轮选择输出的许多个体克隆，scFv在细菌周质中表达并在三个平行生物化学测定中筛选特异性。针对以下各项筛选测试：i)结合生物素化替格瑞洛(测定1)，ii)结合生物素化的腺苷(测定2)和iii)在50倍过量的未修饰的替格瑞洛存在下结合生物素化替格瑞洛(测定3)，以确定替格瑞洛而不是生物素化接头的特异性。使用相同的一般技术和策略进行测定1、2和3。简言之，用于结合生物素化替格瑞洛或生物素化腺苷的粗周质scFv样品的HTS使用测定技术进行。(均相时间分辨荧光)基于TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)的原理。简言之，TR-FRET利用能量从供体荧光团(在这种情况下是铕的穴状化合物)转移到受体荧光团(在这种情况下是XL665)。如果供体和受体荧光团足够接近(约<10m)，则铕的穴状化合物供体的激发(337nm)导致能量转移至XL665受体，接着在665nm发射荧光信号。该技术可以用于敏感地测量生物分子相互作用，其通过在特定相互作用中将供体和受体荧光团(直接或间接)附接到每个结合配偶体。用于scFv与生物素化替格瑞洛结合的HTS格式(测定1)如下所示，并且依赖于生物素化替格瑞洛和his标签标记的周质scFv两者上的化学标签的存在：铕螯合物链霉亲和素：生物素化替格瑞洛：scFv-His：抗His-XL665在包含DPBSPh7.4(Gibco14190-086)、KF(VWR103444T)(0.4M)和Tween20(SigmaP9416)(0.05％)的缓冲液中进行该测定，测定容量为10μl，使用黑色浅孔384孔测定板(Corning/Costar3676)。通过添加5μl生物素化替格瑞洛(60nM，终浓度为30nM)、2μl周质scFv样品(终浓度为20％)和3μl含有铕的穴状化合物标记的链霉亲和素(CisBio610SAKLB)(4.2nM，终浓度为1.26nM)和XL665标记的抗His抗体(CisBio61HISXLB)(40nM，终浓度为12nM)两者的溶液设置测定。设置阴性结合对照孔，其含有上述所有测定组分，除了添加2μl测定缓冲液代替周质scFv。将测定板在室温下孵育4小时，然后使用标准HTRF读取方案在Envision板读数器上读数，其中样品在337nm处激发，并且在620nm和665nM处测量时间分辨荧光发射。原始665nm和620nm计数首先转换成665nm/620nm比值，并且随后结果表示为ΔF(％)值。根据以下等式计算ΔF：ΔF(％)＝{((样品665/620比)-(阴性665/620比))/(阴性665/620比)}×100(阴性比获得自阴性结合对照孔)。提供大于100％的ΔF值的scFv被定义为在该测定中的命中。使用与上述相同的方案进行粗周质scFv样品的HTS以结合生物素化腺苷(最终测定浓度30nM)。测定2的格式可以描述如下：铕螯合物链霉亲和素：生物素化腺苷：scFv-His：抗His-XL665测定3使用与上述相同的方案进行HTS，其鉴定出在过量游离未修饰的替格瑞洛存在下显示减少的与生物素化替格瑞洛的结合的粗周质scFv样品。该方案修改自测定1，因为测定3在50倍摩尔过量的游离的未修饰的替格瑞洛(1500nM)的存在下进行。命中被定义为与生物素化替格瑞洛的结合(测定1中的ΔF>100％)、不结合生物素化的腺苷(测定2中ΔF<25％)和在过量游离的未修饰的替格瑞洛存在下与生物素化替格瑞洛的结合减少>50％。来自测定1和3的数据的示例性相关性显示在图3中。许多scFv在过量游离未修饰的替格瑞洛的存在下显示有限的抑制，这意味着它们与替格瑞洛的一些组分和接头具有结合相互作用。鉴定了scFv的一个子集，其中在过量游离未修饰的替格瑞洛的存在下抑制与生物素化替格瑞洛的结合(>50％)。scFv的分级基于在测定3与测定1中观察到的结合的％抑制(50％-80％、80％-90％、>90％)进行，其中给出>90％抑制的scFv(包括TICA0072)在进一步表征中优先。将序列独特的scFv命中转化为Fab，并使用标准技术在CHO细胞中表达。Fab表达和纯化分离的HC和LC表达质粒用于瞬时转染，基于波西卡(Persic)等人于1997年描述的表达载体。将载体修饰成含有EBV复制起点(OriP)。Fab(HC)载体仅含有恒定区1(CH1)和铰链区，去除CH2和CH3。根据制造商的建议将HC和LCDNA添加至150mMNaCl和25-kDa线性PEI(欧洲聚合物科学(PolysciencesEurope)，德国，23966)中。然后将DNA-PEI复合物添加至来自适于悬浮培养的来源于CHOK1细胞系(ECACCNo：85051005)的中国仓鼠卵巢野生型(CHOwt)细胞(达瑞莫O(DaramolaO)等人，2014)。7天后，通过离心并过滤上清液收获细胞。使用纯化器(GE医疗集团)将含有Fab蛋白的细胞培养上清液以5mL/min的流速直接加载到填充有5mlCaptureSelectIgG-CH1(美国卡尔斯巴德市生命技术公司)的色谱柱上。将柱平衡并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.2洗涤，并根据树脂制造商的说明书用20mM柠檬酸钠、150mM氯化钠，pH3.5(CaptureSelectIgG-CH1)洗脱。将洗脱的Fab调节至pH5.5，并在分析前过滤(0.22μmSteriflip，美国密理博EMD公司(MilliporeEMD))。使用DU520UV/vis分光光度计(美国布雷亚贝克曼库尔特有限公司)，通过280nm处的吸光度测定蛋白质浓度。使用以1.0ml/min运行的TSKgelG3000SWx1柱(日本东京东曹生命科学事业部(TosohBioscience))和1100HPLC系统(美国圣克拉拉市安捷伦科技有限公司)测定样品纯度。实例3：抗替格瑞洛/TAMFab查询含有市售药物的结构数据库(“DrugsDB”，欧普拉(OpreaTI)等人，2011，分子发明(Mol.Inv.)30(2-3),100-111，通过引用并入本文)，以鉴定与替格瑞洛具有一定结构相似性的分子。一旦鉴定，这些结构相似的分子可用于测试Fab超过腺苷及其磷酸化形式(例如，ADP和ATP)的结合特异性。基于替格瑞洛x射线和NMR结构，查询数据库中与替格瑞洛具有2D指纹相似性、3D形状和静电相似性的分子。从该计算机分析中，选择一组12种化合物，其包括六种潜在的联合药物。这些化合物的结构显示于图4中。在竞争结合测定格式中研究特异性，其中测试每种测试化合物竞争性抑制生物素化替格瑞洛与相关Fab的相互作用的能力。使用如下所述竞争测定格式，其中目标是通过一组测试化合物测量与每个His-Fab结合的生物素化替格瑞洛的竞争：铕螯合物抗His抗体：测试His-Fab：生物素化替格瑞洛：XL665标记的链霉亲和素。这种基本测定格式用于评价来自先导分离和先导优化阶段二者结束的前导Fab的选择性图谱，并且出于这些研究的目的，使用His-Fab表达载体产生Fab。在包含DPBSpH7.4(Gibco14190-086)、KF(VWR103444T)(0.4M)和BSA(PAAK05-013)(0.1％)的缓冲液中以20μl的测定体积在黑色浅孔384孔测定板(Corning/Costar3676)上进行测定。测定设置包括添加5μl生物素化替格瑞洛，5μl每种测试选择性化合物的滴定，5μl相关His-Fab和5μl含有铕的穴状化合物标记的抗His抗体(CisBio61HISKLB)(5.33nM，终浓度为1.33nM)和XL665标记的链霉亲和素(CisBio611SAXLB)(40nM，终浓度为10nM)两者的组合溶液。设置总结合对照孔，其含有上述所有测定组分，除了添加5μl测定缓冲液代替测试选择性化合物的添加。设置阴性结合对照孔，其含有包含在总结合对照孔中的所有测定组分，除了添加5μl测定缓冲液代替His-Fab的添加。测试化合物连续滴定为1/2或1/3，取决于具体实验，并且基于化合物特异性优化顶部最终测定化合物浓度。在单独的实验中基于Fab特异性来优化生物素化替格瑞洛和His-Fab的浓度。对于在先导分离阶段结束时研究的四种Fab(TICA0010、TICA0049、TICA0053和TICA0072)，所用的最终测定试剂浓度列于下表1中：表1抗体ID[抗体](nM)[生物素化替格瑞洛](nM)TICA003916.0139.9TICA004916.037.9TICA005316.070.7TICA00728.017.6对于在先导优化阶段结束时研究的两种Fab(TICA0162和TICA0212)，在两种情况下使用的最终测定试剂浓度为5nM生物素化替格瑞洛和1nMHisFab。将在这些实验中使用的几种测试选择性化合物溶解于100％DMSO中，并且测定信号中与载体相关的下降可以在高于约1％DMSO的浓度下开始发生。为了使随后的数据标准化以校正任何这样的载体相关效应，单独的DMSO的平行滴定包括在大多数实验中，其中最终测定DMSO浓度相反测试化合物系列稀释物。在设置程序结束时，将测定在室温下孵育3小时，然后使用标准读取方案在Envision读板器上读数。对于随后的数据分析，首先将原始665nm和620nM计数转换成665nm/620nm比值，然后根据测定1中所述的等式用上述比值计算％ΔF值。在计算％ΔF中使用的阴性比值来自阴性结合对照孔。然后使用％ΔF值根据以下等式计算％特异性结合值：特异性结合(％)＝{(样品ΔF-阴性结合ΔF)/(总结合ΔF-阴性结合ΔF)}×100对于％特异性结合的标准计算，总结合ΔF从总结合对照孔中获得，对照孔包含该测定的所有上述组分但不包括任何竞争测试化合物。在应用DMSO标准化的那些实验中，基本上根据上述等式计算DMSO标准化的％特异性结合，除了在这种情况下从含有总结合对照孔中的所有组分的孔中获得总结合ΔF，以及从相关样品孔中获得浓度相当的DMSO。这种类型的初始实验的结果总结在表2中。在所研究的四种初始Fab中的三种(TICA0010，TICA0049和TICA0053)中，化合物坎格雷洛显示Fab与生物素化替格瑞洛的结合的竞争性抑制。在TICA0049的情况下，泮托拉唑和利奈唑胺显示部分竞争性抑制。如表2所示，TICA0072Fab对十二种化合物中的十一种未表现出抑制，其中对泮托拉唑显示弱的部分抑制。针对该第一系列实验中测试的所有四种Fab都观察到了未修饰的替格瑞洛和TAM的抑制，IC50值落在0.1μM至0.5μM的范围内。四种Fab中的两种(TICA0049和TICA0072)对TIM检测出竞争性抑制，然而，IC50值>50μM，表明相对于未修饰的替格瑞洛和TAM，TIM的亲和力大大降低。基于表2中的结果，TICA0072被鉴定为具有最有利的选择性图谱。基于该Fab在剩余的三种Fab中显示最少结合坎格雷洛的标准，TICA0049被鉴定为潜在的备用物。表2.12种测试化合物中每一种(图4)以及未修饰的替格瑞洛、TAM和TIM对生物素化替格瑞洛与每种测试Fab的结合的抑制的相对IC50值。NI表示没有抑制。在第二系列实验中，对于TICA0049和TICA0072Fab产生进一步的选择性数据，其中图4中列出的12种化合物中的4种的子集与替格瑞洛、TAM和TIM以及几种腺苷相关化合物一起重新测试。在这里，在表2中的早期研究的细化中，设计实验以便能够标准化百分比特异性结合值以校正由于DMSO引起的任何非特异性载体相关效应。来自该第二系列实验的示例性绘图数据以及表3中制成表的IC50值显示在图5中。表3.图4中列出的十二种化合物中四种的子集、替格瑞洛、TAM、TIM和几种腺苷家族化合物在竞争结合选择性研究中(DMSO标准化)的实例IC50结果化合物TICA0049TICA0072腺苷NINIADPNINI2MeSADPNINIATPNINI2MeSATPNINI布拉地新864.9NI利奈唑胺902.0NI坎格雷洛188.4NI泮托拉唑243.51546.0替格瑞洛0.3680.356TAM0.3660.483TIM74.8119.5与早期实验一样，TICA0072显示了最有利的选择性图谱，其中只有泮托拉唑在所测试的四种化合物内显示弱的部分抑制(IC50>1500μM)。在TICA0049的情况下，观察到坎格雷洛和泮托拉唑的显著抑制，观察到利奈唑胺和布拉地新的弱抑制。应当注意，对于某些测试化合物，第一和第二系列实验之间的绝对IC50值的微小差异不会从根本上改变总体结论。这样的差异可能源于这样的事实，即DMSO标准化被结合到第二系列实验中，结合在如下事实，即在一些情况中，我们试图测量非常弱的抑制。对于TICA0049和TICA0072两者，替格瑞洛和TAM的测量的IC50值在0.3μM至0.5μM的范围内，TIM的IC50值在74.8μM和119.5μM处分别是2log值更高的。对于TICA0049和TICA0072Fab两者，观察到腺苷、ADP、ATP和后两种化合物的甲基-硫代衍生物的痕量抑制，然而这仅在测试的最高化合物浓度下检测到，并且不被认为是显著的。得出结论，TICA0072是被认为是具有替格瑞洛和TAM特异性的唯一Fab。实例4：抗替格瑞洛/TAMFab的亲和力测量使用OctetRed384上的Biolayer干涉测定法测定上文产生的抗替格雷洛Fab的亲和力。对于亲和力测量，将抗替格瑞洛Fab抗体稀释至测定缓冲液(PBS，Tween200.05％，BSA0.02％)的最终测定浓度的2倍的浓度，如200nM。在Greiner聚丙烯96孔板中制备替格瑞洛的10点2倍系列稀释物。然后将等体积(例如70μL加70μL)的稀释抗体和游离替格瑞洛转移到第二Greiner聚丙烯板。通过吸移混合样品，用板密封件覆盖，并使其在室温下平衡3-5天。平衡后，将60μL抗体/替格瑞洛滴定一式两份转移到384孔黑色倾斜底聚丙烯板中。将生物素化替格瑞洛在测定缓冲液中稀释至250nM，并添加至384孔测定板的前2列的备选孔中，其余孔仅包含测定缓冲液。将链霉亲和素生物传感器在测定缓冲液中预浸泡至少10分钟。然后将样品板和生物传感器加载到OctetRed384的载物台上。所有测定在室温下进行。在测定缓冲液中基线平衡60秒后，将生物素化替格瑞洛加载到链霉亲和素生物传感器上300秒，然后添加测定缓冲液600秒以建立新的基线。然后使抗体/替格瑞洛混合物与生物素化替格瑞洛传感器表面缔合30-600秒，这取决于所用抗体的浓度。使用OctetRed数据分析软件分析所得缔合相数据。将信号与基线比对，并减去每个样品的参考传感器信号(无抗体对照)，然后使用KinExAn-曲线分析软件将数据输出以用于分析。使用常数匹配分析(ConstantPartneranalysis)，确定抗替格瑞洛Fab抗体的平衡KD。数据显示FabTICA0072和TICA0049分别对替格瑞洛具有7.4nM和11.6nM的亲和力(表4)。表4.抗替格瑞洛Fab的平衡亲和力分析抗体ID半抗原平衡KD95％置信区间TICA0072替格瑞洛7.43nM1.75-21.46nMTICA0049替格瑞洛11.6nM1.7-66.5nM实例5：抗替格瑞洛/TAM抗体TICA0072的优化使用基于亲和力的噬菌体选择优化抗体TICA0072。通过使用如所述的标准分子量生物技术(克拉克森(Clackson)和洛曼(Lowman)，2004，实用方法系列(PracticalApproachSeries)266)，可变重链(VH)互补决定区(CDR)1、2或3或可变轻链(VL)CDR1、2或3的寡核苷酸定向诱变，产生源自前导scFv序列的大scFv文库。文库经受基于亲和力的噬菌体展示选择以便选择具有针对替格瑞洛和TAM的更高亲和力的变体。简言之，基本上如先前所述(汤普森(Thompson)等人，1996，分子生物学杂志(JMolBiol.)256(1):77-88)，将scFv-噬菌体颗粒在具有还原性浓度的生物素化替格瑞洛的溶液(典型实例是20nM至20pM，经过四轮选择)中孵育。从来自CDR-靶向选择输出的代表性数目的单个scFv制备含粗scFv的周质提取物，并在表位竞争测定格式中筛选，设计用于筛选相对于TICA072亲和力改进的测定格式。简言之，为了筛选具有改进的亲和力的scFv和Fab变体，通过测试scFv变体，表位竞争测定基于母体TICA0072IgG和生物素化替格瑞洛之间的相互作用的竞争完成。将该测定法用作初级单点HTS以筛选粗周质提取物scFv样品，并且用作多点二级图谱分析测定法，以测量纯化的scFv和Fab变体两者相对于母体TICA0072的IC50值的改进。虽然表位竞争测定法(例如本文所述的测定法)通常不用于测定绝对亲和力值，但此测定法可用作基于HTS的亲和力的基础。此外，纯化的scFv/Fab变体(相对于母体scFv/Fab)的IC50的倍数改进可以提供亲和力的总体倍数增加的良好指示，并且可以表示在先导优化运动中对scFv/Fab变体亲和性分级的有效方式。本文所述的基于表位竞争测定的TICA0072母体IgG的格式如下：铕标记的链霉亲和素：生物素化替格瑞洛：TICA0072IgG：XL665标记的抗人Fc抗体在包括DPBSpH7.4(Gibco14190-086)、KF(VWR103444T)(0.4M)和Tween20(SigmaP9416)(0.05％)的缓冲液中，在黑色浅孔384孔测定板(Corning/Corning3676)中进行该测定。对于粗周质scFv变体的单点测试，使用10μl的测定体积，然而当在多点次级IC50图谱分析测定中测试纯化的scFv和Fab时，使用20μl测定体积。对于单点HTS，通过添加3ulTICA0072IgG(53.3nM，终浓度为16nM)、2ul粗周质提取物scFv样品、2.5ul生物素化替格瑞洛(8nM，终浓度为2nM)和2.5ul包含铕标记的链霉亲和素(CisBio610SAKLB)(3nM，对于0.75nM最终测定浓度)和XL665标记的抗人Fc抗体(CisBio61HFCXLB)(30nM，最终测定浓度为7.5nM)的组合溶液来设置测定。将母体TICA0072粗周质scFv用作基准，并且将HTS配置为鉴定相对于母体提供改进的抑制的变体。总结合对照孔含有所有测定组分，除了添加2μl测定缓冲液代替scFv样品。阴性结合对照孔包含总结合对照孔的所有组分，除了添加3ul测定缓冲液代替TICA0072IgG。对于纯化的scFv/Fab变体的多点IC50测试，通过添加5μl的TICA0072IgG(53.3nM，终浓度为16nM)、5μl的1/3滴定的纯化的测试scFv或Fab变体、5μl生物素化替格瑞洛(8nM，终浓度为2nM(scFv图谱分析)；4nM，最终测定浓度为1nM(Fab图谱分析))和5ul的含有铕标记的链霉亲和素(CisBio610SAKLB)(3nM，对于0.75nM最终测定浓度)和XL665标记的抗人Fc抗体(CisBio61HFCXLB)(30nM，最终测定浓度为7.5nM)的组合溶液来设置测定。在所有实验中使用纯化的母体TICA0072(scFv或Fab)作为基准，使得用优化变体(scFv或Fab)测量的IC50的改进可表达为相对于母体TICA0072的倍数改进。总结合对照孔含有所有测定组分，除了添加5μl测定缓冲液代替纯化的scFv或Fab样品。阴性结合对照孔包含总结合对照孔的所有组分，除了添加5μl测定缓冲液代替TICA0072IgG。在测定的单点HTS和多点IC50图谱分析版本中，将板在室温下孵育3小时，然后使用标准HTRF读取方案在Envision板读数器上读数，其中样品在337nm处激发，并且在620nm和665nM处测量时间分辨荧光发射。根据早先分别在测定1和4中描述的等式，使用原始665nm和620nm计数来计算ΔF(％)和％特异性结合。对于多点二次图谱分析实验，使用GraphpadPrism软件使用S形剂量响应(可变斜率)曲线拟合(4参数对数等式)确定IC50值。对筛选中鉴定的命中，即与母体TICA0072scFv相比显示出显著改进的抑制效果的scFv变体进行DNA测序，并且将来自可变重链CDR1、CDR2或CDR3和可变轻链文库CDR1、CDR2或CDR3输出的独特变体作为纯化的scFv产生，并在相同的测定中重新测试以确定浓度响应IC50曲线。然后产生显示最大改进的IC50值的scFv变体作为Fab，并在下文所述的第二代表位竞争测定中测试。用于筛选/分级最高亲和力Fab的第二代表位竞争测定为了在先导优化活动结束时有效区分非常高亲和力纯化的Fab，进行进一步的表位竞争测定，然而在这种情况下，该测定基于与母体TICA0072IgG相反的中间亲和力优化的TICA0072谱系IgG(TICA0159)与生物素化替格瑞洛的结合的竞争性抑制。该测定法仅用于多点IC50图谱分析格式(与HTS格式相反)，并且基本上与在测定5(上文)中给出的方法相同地进行，用于基于表位竞争测定的母体TICA0072IgG中纯化的Fab变体的多点IC50图谱分析。唯一的区别是在测定设置中的适当点处使用TICA0159IgG代替TICA0072IgG，但是最终测定浓度相同，为16nM。在所有其他方面，该测定完全如上文针对纯化的Fab的多点二级图谱分析版本所述进行。第二代测定用部分优化的抗体TICA0159代替TICA0072，以能够比基于表位竞争测定的TICA0072中可能的更高效的区分和分级最高亲和力的Fab。最大改进的VH被鉴定为CDR3变体TICA0162。最大改进的VL被鉴定为CDR3变体TICA0152。为了产生进一步的亲和力改进，使用标准的分子生物学技术将来自改进的抗体的不同的CDR重组为新的Fab。从这种重组工作可知，TICA0162和TICA0152的组合产生具有进一步改进的表位竞争图谱的新的FabTICA0212。第二代表位竞争测定中TICA0072、TICA0152、TICA0162和TICA0212Fab的绘图竞争曲线显示于图6中，其中测量的IC50值显示在表5中。TICA0212显示相对于母体TICA0072Fab的IC50提高约2log。表5：在第二代表位竞争测定中列出的优化的抗替格雷洛Fab的IC50数据。FabIC50(nM)倍数改进TICA00721714.00TICA015273.523.3TICA016216.3105.2TICA021212.0142.8实例6：优化的抗替格瑞洛/TAMFab的亲和力测量使用KinExA3200测定实例5中产生的抗替格瑞洛/TAMFab的亲和力。对于KinExA亲和力测量，首先通过使它们与1mg链霉亲和素在50mMNaHCO3中反应过夜来制备小丸(600mg二氢唑酮小丸)。在用2种变化的Tris缓冲液(1MTrispH8.7，10mg/mLBSA)封闭后，将链霉亲和素包被的小丸重悬于8mL的总体积中。用PBS完全洗涤小丸(1.33mL，相当于100mg初始干燥的二氢唑酮小丸)，然后允许在1mLPBS中结合约2.5μg生物素-替格瑞洛，持续10分钟，偶尔搅拌。将所得的生物素-替格瑞洛包被的小丸用PBS洗涤，然后重悬于含有0.1％BSA和0.02％NaN3的50mLPBS中，并在室温下储存，直至转移至KinExA小丸小瓶。基本上如先前方法中所述进行抗体/替格瑞洛样品制备。将抗替格瑞洛Fab抗体稀释至测定缓冲液(PBS，Tween200.05％，BSA0.02％，0.02％NaN3)的最终测定浓度的2倍的浓度，如200nM。在Falcon50mL聚丙烯管中制备替格瑞洛的10点2倍系列稀释物。然后将等体积，例如5mL加5mL的稀释抗体和游离替格瑞洛转移到第二个Falcon聚丙烯管中。通过吸移混合样品，用板密封件覆盖，并使其在室温下平衡3-5天。平衡后，将样品管转移至KinExA3200用于分析。所有测定在室温下进行。取样抗体/替格瑞洛混合物，并使其与生物替格瑞洛小丸混合，同时洗去未结合的游离替格瑞洛。然后使用DyLight649标记的小鼠抗人重链和轻链抗体检测结合的抗体。样品体积(300-1300μL)和注射时间(90-120s)随浓度变化，并且每个样品有2-3个读数改变。使用KinExAn-曲线分析软件分析数据。使用常数匹配分析，确定抗替格瑞洛Fab抗体的平衡KD。如在先前实例中，使Fab在室温下在20倍过量浓度的未修饰的替格瑞洛或TAM存在下平衡。将生物素化替格瑞洛加载到链霉亲和素包被的小丸的表面上。平衡后，使剩余的游离抗体与生物素化替格瑞洛结合。然后使用DyLight649标记的小鼠抗人重链和轻链检测抗体检测结合的抗体。用至少三种不同的固定浓度的抗体进行游离替格瑞洛或TAM的滴定，以产生具有至少10倍表观KD位移的独立滴定图谱。使用KinExAPron-曲线分析软件分析数据以确定游离替格瑞洛或TAM的平衡KD。FabTICA0212对未修饰的替格瑞洛和TAM的亲和力为约20pM(表6)。从平衡数据TICA0212证明了与替格瑞洛和TAM结合的等同的高亲和力(约20pM)。表6：抗替格瑞洛/TAMFab的平衡亲和力分析自母体TICA0072的序列残基的变化被加粗，并且在TICA0072中鉴定某些残基的卡巴特编号。实例7：抗替格瑞洛/TAMFabTICA0162和TICA0212的特异性如实例3中那样测试Fab、TICA0162和TICA0212的特异性，并针对DMSO标准化。TICA0162和TICA0212的所有可用选择性数据的汇总表包括在表7中。另外，实例绘出的数据来自下述实验，其中图4中列出的十二种化合物中的五种与替格瑞洛、TAM、TIM和图7中所示的几种腺苷家族化合物一起进行测试。表7：除了替格瑞洛、TAM、TIM和腺苷家族化合物之外，12种结构相关化合物对生物素化替格瑞洛与TICA0162和TICA0212Fab结合的抑制的相对IC50值。NI表示没有抑制。如数据所示，TICA0212(MEDI2452)对替格瑞洛和TAM具有基本上相等的结合特异性，并且对TIM的结合较弱。此外，MEDI2452/TICA0212未显示与任何其他结构相关的药物或腺苷相关化合物的显著结合。实例8：蛋白质晶体学将具有C-末端his-标签的TICA0072在PBS中浓缩至9mg/ml。通过添加溶解在DMSO中的1mM替格瑞洛实现复合物形成。将该复合物在室温下孵育2小时，然后使用沉滴蒸气扩散法设置结晶试验。使用3个商业筛选进行广泛筛选，并获得几个命中。从(英国分子尺寸公司(MolecularDimensions))命中的网格优化获得最佳衍射晶体。在20℃下，通过混合等体积的TICA0072-替格瑞洛复合物和12.8％PEG3350、12.8％PEG1000、12.8％MPD、1.7％1,6-己二醇、1.7％1-丁醇、1.7％1,2-丙二醇、1.7％2-丙醇、1.7％1,4-丁二醇、1.7％1,3-丙二醇、25mM咪唑、25mM二甲胂酸钠、25mMMES和25mMBis-TrispH6.5的储备溶液，来生长用于结构测定的晶体。将晶体在液氮中快速冷冻，而不添加任何冷冻保护剂。将浓度为约15mg/ml的PBS中的TICA0212/MEDI2452与替格瑞洛混合至1mM的浓度，并在进行广泛筛选之前在室温下孵育2小时。没有获得自发命中。来自TICA0072-替格瑞洛晶体的晶种通过在30ul孔溶液中粉碎几种晶体制备，并用于MMS(微量基质筛选)至广泛的商业筛选中。获得了几个命中，但是用于结构测定的晶体在20℃下在20％甘油、20％PEG4000、10％2-丙醇、0.1MNaCl和0.5M乙酸钠pH4.6的条件下生长。用0.2μl蛋白、0.18μl孔溶液和0.02μl种子原液设置滴剂。将晶体在液氮中快速冷冻，而不添加任何冷冻保护剂。在欧洲同步辐射工厂(法国格勒诺布尔)的光束线ID23-1处收集数据。使用AutoProc工作流程处理、缩放并进一步减化数据[翁赫C(Vonrhein，C.)等人，ActaCryst.，2011；D67:293-302]，统计见表8。对于TICA0072，通过使用高分辨率Fab结构的分子替换进行初始定相(PDBidcode1aqk，[法伯尔C(FaberC.)等人，免疫技术(Immunotechnology)，1998；3:253-70])作为起始模型。对于TICA0212/MEDI2452，使用TICA0072的结构作为起始模型。使用Coot进行模型重建[布里科涅C(BricogneG.)等人，(2011)，BUSTER版本2.11.4，英国剑桥：环球菲兹公司(GlobalPhasingLtd)]，并且使用autobuster进行细化[埃姆斯利P(Emsley，P)等人，晶体学D节：生物晶体学(ActaCrystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.)2004，D60,2126-2132]。最终模型的统计数据见表8。TICA0072与替格瑞洛的复合物的结构确定为分辨率(图10)。CDR形成高度凹入的表面，并且替格瑞洛深深插入VH和VL结构域之间的界面。这种类型的结合通常在小的半抗原中观察到。除VLCDR2外的所有CDR直接有助于替格瑞洛结合，并且大部分VHCDR3是无序的。替格瑞洛的二氟苯基基团位于包含游标残基(vernierresidue)VHTrp47、VLPhe98和VHCDR3残基Leu100L的、排列有疏水性残基的腔中。与替格瑞洛相互作用的关键残基是VLTrp91，其涉及针对腺苷样核心的π-堆积和键合至环戊基部分的核糖羟基之一的氢。与腺苷样核心的另外的相互作用由VHCDR1His35和VHCDR3Tyr99提供。硫丙基取代基与VHCDR2环的主链叠加。环戊基部分上的羟乙基取代基突出到溶剂中，并且不与Fab发生任何相互作用。在亲和力改进的Fab，TICA0212/MEDI2452的结构中，替格瑞洛结合与TICA0072的结构类似，其中保留了上述所有相互作用，但具有一些重要差异(图10B)。VLCDR3突变Asp92Leu和Ser94Asp的组合打破VLCDR3环内的氢键以产生更“松弛”的结构。新构象与嘧啶环的15°倾斜(关于环丙基-二氟苯基取代基的附接)相关。嘧啶环的新位置使其与Fab72相比更接近TICA0212/MEDI2452中的VHCDR3Tyr99约此外，VLIle93Tyr引入氢键供体，其使得与VHCDR3环相互作用，从而进一步限定结合位点。TICA0212/MEDI2452的晶体结构显示在VH和VL界面之间的深缝隙中结合的替格瑞洛。用生物素通过三酰胺接头将替格瑞洛标记到羟乙基基团的设计策略得到证实，因为晶体结构证明羟乙基基团不参与与TICA0212/MEDI2452的任何相互作用。这进一步得到如下事实的支持，即Fab也以相同的亲和力结合缺乏羟乙基基团的TAM。TICA0212/MEDI2452显示对TIM的弱结合，TIM缺乏环丙基-二氟苯基基团。在TICA0212/MEDI2452-替格瑞洛复合物中，环丙基-二氟苯基基团被掩埋在疏水口袋的底部，并且必须在使替格瑞洛腺苷样核心与VLCDR3残基TrpL91比对中起关键结构作用。由于替格瑞洛的化学起点是ATP，并且它保留了腺苷样核心，解毒剂特异性的关键属性是证明没有腺苷的结合。先导分离策略涉及高通量和详细的特异性分析，并且通过竞争性或直接结合分析未检测到腺苷的结合。从结构分析，预期腺苷的嘌呤环和核糖基团可以模拟替格瑞洛的腺苷样核心的相互作用。然而，缺乏结合可以通过缺少两个疏水R基团(环丙基-二氟苯基和硫丙基)来解释，其显著降低结合相互作用的相对形状互补性和疏水性。对母体TICA0072和TICA0212/MEDI2452的结构的分析显示了在亲和力成熟期间引入的一些改变的显著性。VLCDR3中的突变似乎具有特别高的影响，导致TICA0212/MEDI2452中不同的环构象和额外的氢键，以限定结合腔。相反，VHCDR3中的突变的贡献在结构上不太明显。来自结构的这些观察结果部分地由仅含有VLCDR3(TICA0152)或VHCDR3(TICA0162)中的修饰的修饰抗体的数据证实，这些修饰分别导致比TICA0072高200倍和50倍的改进。然而，尽管VLCDR3变化似乎具有更大的效果，但两组突变都显著改进。应当注意，晶体结构是复合物的静态图片，并且不能捕获结合中涉及的任何蛋白质和配体动力学。实例9：在替格瑞洛或TAM存在下，TICA0212/MEDI2452在体外浓度依赖性地恢复血小板聚集使用光透射聚集测定法在人富血小板血浆(PRP)中测定TICA0212/MEDI2452逆转替格瑞洛或TAM介导的对ADP诱导的血小板聚集的抑制的程度和效力。对于体外人PRP测定，通过头静脉的静脉穿刺从禁食的健康志愿者收集血液。弃去前2mL血液，然后收集等分试样到含有0.109M柠檬酸钠、1+9(柠檬酸盐+血液)的管中至最终浓度为10.9mM。将抗凝血的人血在240×g离心15分钟。小心地移除PRP并转移至干净的小瓶中。通过PRP在2000×g离心15分钟制备贫血小板血浆(PPP)。通过血小板聚集分析仪(美国宾夕法尼亚州生物/数据公司(Bio/DataCorporation)PAP-8E)在PRP中评价光透射聚集度(LTA)。将零％聚集定义为PRP的光透射率，将100％聚集定义为PPP的光透射率。PRP与1μM替格瑞洛或TAM一起预孵育1小时，然后与不同浓度的TICA0212或同种型对照Fab共孵育30分钟。通过添加20μMADP引发血小板聚集，并连续记录6分钟。分析6分钟时最终聚集(FA)程度的数据。计算给出半最大值逆转的TICA0212/MEDI2452的浓度(IC50)。TICA0212/MEDI2452产生1μM替格瑞洛的浓度依赖性逆转和1μMTAM介导的对20μMADP诱导的血小板聚集的抑制，分别计算平均(n＝5)IC50值为0.64和0.78μM(图8)。当在1:1条件(1μMTICA0212/MEDI2452：1μM替格瑞洛或TAM)下评价时，平均逆转程度分别为78％和62％。同种型对照Fab不引起替格瑞洛和TAMADP诱导的血小板聚集的显著逆转。例如，在30分钟孵育后，同种型对照Fab分别导致替格瑞洛和TAM的-3％和2％逆转。由此，数据显示TICA0212/MEDI2452能以浓度依赖性方式在体外逆转替格瑞洛和TAM介导的对ADP诱导的血小板聚集的抑制。当在1:1实验设置中评估时获得最大和接近完全的逆转效应，当TICA0212/MEDI2452以1:1化学计量学结合替格瑞洛或TAM时将可预测所述效应。实例10：在替格瑞洛或TAM存在下，TICA0212/MEDI2452在体外有效且快速地恢复血小板聚集使用如实例8中的光透射聚集测定法在人富血小板血浆(PRP)中测定TICA0212/MEDI2452逆转替格瑞洛或TAM的起始时间。PRP与1μM替格瑞洛或TAM预孵育1小时，然后添加1μMTICA0212/MEDI2452并共孵育5、10、15、30和60分钟，或添加同种型对照Fab持续30分钟。通过添加20μMADP引发血小板聚集，并连续记录6分钟。分析6分钟时最终聚集(FA)程度的数据。TICA0212/MEDI2452产生替格瑞洛介导的抑制逆转的类似程度，而不管共孵育时间如何，因为平均(n＝3)逆转程度在5、10、15、30和60分钟后分别为85％、69％、74％、80％和81％。类似地，在5、10、15、30和60分钟后，由TICA0212/MEDI2452诱导的TAM逆转的平均(n＝3)程度分别为53％、56％、58％、69％、74％。TICA0212/MEDI2452快速且有效地逆转替格瑞洛和介导ADP诱导的血小板聚集的抑制。在与同种型对照Fab共孵育30分钟后，没有逆转，平均值(n＝3)-2％。从该数据可知，当在1:1实验设置中评估时，显示TICA0212/MEDI2452快速且有效地逆转替格瑞洛和TAM介导的对ADP诱导的聚集的抑制。实例11：TICA0212/MEDI2452在体内给药经替格瑞洛处理的小鼠后有效且快速恢复血小板聚集在小鼠静脉内(i.v.)给药替格瑞洛后，离体测定TICA0212/MEDI2452介导的、对替格瑞洛介导的ADP诱导的全血血小板聚集抑制的逆转(阻抗聚集测定)的起始速度和程度。给小鼠静脉注射替格瑞洛，经5分钟作1200μg/kg的推注，然后15分钟连续输注30μg/kg/min。在替格瑞洛输注终止后，当测量替格瑞洛血浆暴露为平均1.4μM时，给小鼠静脉内推注250mg/kg的TICA0212/MEDI2452。在TICA0212/MEDI2452给予后5、30和60分钟，处死小鼠，收集血液样品。在该研究中，测量ADP诱导的聚集反应6分钟，并且将数据表示为随时间记录的聚集单位(AU)的曲线下的平均面积(AU*min)。在进行阻抗聚集测定中，处死小鼠并将血液样品收集到7μM水蛭素中。将血液(175μL)添加到多板微型测试单元中的预热的NaCl2(37℃，175μL)中，混合3分钟，然后添加12μLADP，至终浓度为6.5μM。一次性多板微型测试单元包含搅拌棒并且具有浸入血液样品中的两组单独的电极对。当添加激动剂(ADP)并通过搅拌诱导剪切时，血小板将开始粘附并聚集在电极上。这导致电极上的增加的阻抗，其通过多层阻抗仪(德国慕尼黑黛娜贝茨(DynaByte))随时间连续记录所述阻抗。替格瑞洛治疗诱导几乎完全抑制ADP诱导的聚集，因为在替格瑞洛输注和PBS推注5、30和60分钟后，平均(n＝4)聚集反应分别从432降低至2，从474降至6和从494降至14AU*min(图9)。TICA0212/MEDI2452介导体内替格瑞洛介导的抑制的逆转，因为在替格瑞洛输注和TICA0212推注5、30和60分钟后，平均(n＝4)聚集反应分别从2增加到147，从6增加到448和从14增加到413AU*min(图9)。在给予同种型对照30分钟后没有逆转，因为平均(n＝4)聚集反应保持从6至4AU*min不变。该数据表明，当静脉内给予浓度为1.4μM的替格瑞洛血浆时，(其提供对ADP诱导的聚集的完全抑制)，TICA0212/MEDI2452可以快速且有效地恢复ADP诱导的血小板聚集。实例12：替格瑞洛处理的小鼠中的小鼠出血由于TICA0212/MEDI2452的预期适应症之一是作为需要紧急手术的替格瑞洛患者的解毒剂，在小鼠出血实验中评价TICA0212/MEDI2452，该实验设计为模拟临床设置，在手术开始之前应当实现完全逆转。将小鼠用连续输注的替格瑞洛(300μg/kg/min)或载体预处理20分钟。停止输注后，t＝0，经45秒施用推注剂量的TICA0212/MEDI2452(600mg/kg)或载体(组氨酸蔗糖缓冲液)，并且在t＝30分钟时，通过从尾部尖端切割5mm诱导出血。尾部尖端用水(2mL/min)冲洗，并将血液和水混合物收集在小室中，在该室中搅拌器混合液体以增强溶血并且产生匀质溶液。当从腹主动脉收集终末血样用于血小板聚集时，在525nm处记录光透射30分钟。将光透射率转化为吸光度，并用于通过绘制随时间的吸光度来计算为吸光度曲线下面积(AUC，吸光度*s)的失血量和总出血时间(BT，s)。将所有低于95％的透射率定义为出血。在替格瑞洛输注结束时(t＝0)和尾部切割时(t＝30分钟)针对血小板聚集以及总的和游离的血浆暴露收集样品。研究由瑞典哥德堡大学动物研究伦理委员会批准。用异氟烷气体(瑞典阿伯特斯堪的纳维亚AB公司(AbbotScandinaviaAB)的)麻醉小鼠。将导管插入左颈静脉中，用于给予载体或药物。通过外部加热将体温维持在38℃。为了将TICA0212/MEDI2452对血小板聚集的作用转化为对出血的潜在作用，进行了预防性小鼠尾部出血研究。将替格瑞洛输注到平均总替格瑞洛和TAM血浆浓度分别为7.6和0.3μM，以提供显著的药物依赖性出血窗口。在停止替格瑞洛输注后立即将TICA0212/MEDI2452经30秒以600mg/kg的单次推注给药。30分钟后，ADP诱导的聚集完全标准化，替格瑞洛的平均游离血浆浓度从4.7nM降低至低于0.03nM(定量下限)。通过尾部切割开始出血并监测30分钟。在载体处理的小鼠中，尾部切割时的平均总替格瑞洛和TAM血浆浓度为2.4和0.6μM。经30分钟的总失血量和出血时间通过替格瑞洛显著(p<0.05)增强，分别为约3.8倍和1.6倍。相对于单独的替格瑞洛，TICA0212/MEDI2452显著(p<0.05)逆转失血量和出血时间至回到与未用替格瑞洛处理的小鼠没有显著差异的水平(图12)。在该预防性设置中，TICA0212/MEDI2452标准化替格瑞洛依赖性出血。从离体模型翻译为该体内模型的30分钟的起始时间证明TICA0212/MEDI2452可以将失血量和出血时间标准化为未用替格瑞洛处理的小鼠的失血量和出血时间。实例13：替格瑞洛和TAM的总血浆浓度将血样收集在具有EDTA抗凝剂的管中，并在室温下以10000×g离心5分钟以制备血浆。通过蛋白质沉淀和串联质谱法的液相色谱(LC-MS/MS)测定替格瑞洛和TAM的血浆浓度，如公开的方法[席仑H(SillénH.)等人，分析技术测定生物生命科学JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci)，2010；878:2299-306]中描述的，具有以下偏差。血浆，50μL，用在乙腈中的180μl内标(D7-ZD6140)进行蛋白沉淀。液相色谱系统和质谱仪是Acquity超高性能LC，联合沃特斯公司的XevoTQ-S质谱仪。在AquityBEHC18柱上进行色谱分离(2.1×50mm，粒径1.7μm)。使用负电喷射电离。洗脱液A是具有10mmol/L乙酸铵、pH5的水，洗脱液B是具有10mmol/L乙酸铵的乙腈。注射体积为1至5μL，分析梯度从4％B开始，在1.5分钟内增加至95％，保持至2.3分钟，然后在2.4分钟内恢复至初始条件，随后0.3分钟再平衡。在分析中没有使用质量控制样品。定量下限(LLOQ)为0.005μmol/L，校准范围为0.005至15.0μM。通过添加1％甲酸(FA：样品，1:5)，然后进行如上所述的蛋白质沉淀和LC-MS/MS来测定TICA0212/MEDI2452存在下替格瑞洛和TAM的总血浆浓度。将甲酸添加至样品中以促进替格瑞洛和TICA0212/MEDI2452的解离。实例14：替格瑞洛游离血浆浓度基于先前公开的方法[席仑H(SillénH.)等人，分析技术测定生物生命科学(JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci)，2011年8月1日；879(23):2315-22]优化该方法。将允许质量低于6至8kDa的分子通过的透析膜(仕必纯实验用品公司(SpectrumLaboratories，Inc))在ELGA水中浸泡10至15分钟，并放置在透析板(室内制备)之间。将血浆(130μL)添加至透析板的一侧，并将130μL磷酸盐缓冲液(pH7.0)添加到另一侧。将两侧的孔用盖子密封，并将铝板放在该板的每一侧的顶部以避免泄漏。然后将板垂直放置于37℃下100rpm/min的轨道振荡器上24小时。通过将来自血浆侧的50μL保留物和来自缓冲液侧的75μL透析液转移到乙腈中的蛋白质LoBindPCR清洁96深孔板中来终止透析，所述96深孔板各自含有150μL、75μL内标物(D7-ZD6140)。将板混合1分钟，然后在4℃下1500×g离心20分钟。离心后，转移来自沉淀保留物的50μL上清液，并在LC-MS/MS(沃特斯公司Acquity超性能LC联合XevoTQ-S质谱仪)分析之前用50μLELGAH2O稀释。在分析中没有使用质量控制样品。保留物的校准范围为0.4至1000nmol/L，透析液的校准范围为0.003至50nmol/L。透析液中替格瑞洛的LLOQ为0.03nmol/L。下表9提供了在上述实例中描述的示例性抗体的概述，并且用于说明在此披露的技术的某些实施例。表9抗体/scFv/Fab序列的概述参考文献和通过引用并入1.范吉森JJ(VanGiezenJJ)、尼尔森L(NilssonL)、本特森P(BerntssonP)等人，替格瑞洛独立于ADP与人P2Y(12)结合，但拮抗ADP诱导的受体信号传导和血小板聚集，中华血液学杂志(JThrombHaemost)2009；7(9)：1556-15652.瓦伦汀(WallentinL)、贝克尔RC(BeckerRc)、布达A(BudajA)等人，在急性冠状动脉综合征患者中使用替格瑞洛与氯吡格雷，新英格兰医学杂志(NEnglJMed.)2009；361：1045-1057。3.阿姆斯特丹EA(AmsterdamEA)、威戈NK(WengerNK)、布林迪斯RG(BrindisRG)等人，2014ACC/AHA非ST段抬高型急性冠状动脉综合征患者管理指南：美国心脏病学会/美国心脏协会工作组实践指南的报告，循环(Circulation.)2014；000：000-0004.斯托雷RF(StoreyRF)、安吉洛DJ(AngiolilloDJ)、帕蒂尔SB(PatilSB)等人，与氯吡格雷相比，替格瑞洛对急性冠状动脉综合征患者血小板功能的抑制作用：PLATO(血小板抑制和患者结局)血小板研究，美国心脏病学会杂志(JAmCollCardiol)2010；56(18)：1456-1462。5.泰勒G(TaylorG)、奥辛斯基D(OsinskiD)、戴维南A(TheveninA)等人，血小板输注是否有效恢复在紧急手术之前对阿司匹林和/或氯吡格雷有反应的患者的血小板反应性？外伤急性护理杂志(JTraumaAcuteCareSurg.)2013；74：1367-1369。6.普鲁勒尔F(PrüllerF)、德雷克斯勒C(DrexlerC)、阿占S(ArchanS)、马修S(MacherS)、瑞嘉姆RB(RaggamRB)、马哈尔E(MahlaE)，通过输入储存的血小板来恢复低血小板反应性：健康志愿者体内研究，中华血液学杂志(JThrombHaemost)2011；9(8)：1670-1673。7.汉松EC(HanssonEC)、夏姆斯哈基米C(ShamsHakimiC)、阿斯特朗奥森K(K)等人，离体血小板补充对来自用乙酰水杨酸，氯吡格雷或替格瑞洛治疗的患者的血液样品中的血小板聚集性的影响，英国麻醉学杂志(BrJAnaesth)2014；112(3)：570-575。8.蒂勒T(ThieleT)、萨尼A(SümnigA)、赫龙G(HronG)，用于逆转需要紧急手术的患者中的双重抗血小板治疗的血小板输注：一项试验研究，中华血液学杂志(JThrombHaemost)2012；10：968-971。9.佩尔松S(PehrssonS)、汉松K(HanssonK)、尼兰德S(NylanderS.)替格瑞洛诱导小鼠出血可被FVIIa和FII逆转，美国心脏病学会杂志(JAmCollCardiol)，2013；61(10S)：E212。10.道津E(DolginE)解毒剂边缘更接近新血液稀释剂的逆转效应，天然药物(NatMed)2013：193，251。11.克洛泽MA(CrowtherMA)、安吉诺W(AgenoW)、加西亚D(GarciaD)等人，口服维生素K与安慰剂相比，在接受华法林的患者中校正过度抗凝：一项随机试验，内科学年鉴(AnnInternMed)2009；150：293-300。12.席勒F(SchieleF)、范赖恩J(vanRynJ)、卡纳达K(CanadaK)等人，达比加群的特定解毒剂：功能性和结构性特征。血液(Blood)2013；121：3554-3562。13.鲁G(LuG)、迪古士曼FR(DeGuzmanFR)、霍伦巴赫SJ(HollenbachSJ)等人，用于通过凝血因子Xa的直接和间接抑制剂逆转抗凝的特异性解毒剂，天然药物(NatMed)2013；19：446-451。14.斯托雷RF(StoreyRF)、赫斯特德S(HustedS)、哈林顿RA(HarringtonRA)等人，与急性冠状动脉综合征患者的氯吡格雷相比，AZD6140(一种可逆的口服P2Y12受体拮抗剂)抑制血小板聚集，美国心脏病学会杂志(JAmCollCardiol)2007；50：1852-1856。15.赫斯特德SE(HustedSE)、斯托雷RF(StoreyRF)、布莱登K(BlidenK)等人，稳定型冠状动脉疾病患者的替格瑞洛的药代动力学和药效学：来自ONSET-OFFSET和RESPOND研究的结果，临床药代动力学(ClinPharmacokinet.)2012；51(6)：397-409。16.滕R(TengR)、奥利弗S(OliverS)、海耶斯MA(HayesMA)、巴特勒K(ButlerK)，健康受试者中替格瑞洛的吸收、分布、代谢和排泄，药物代谢和处置(DrugMetabDispos.)2010；38(9)：1514-1521。17.达拉莫拉O(DaramolaO)、史蒂文森J(StevensonJ)、迪恩G(DeanG)等人，高产CHO瞬时系统：编码EBNA-1和GS的基因的共表达增强瞬时蛋白表达，生物技术进展(BiotechnolProg)2014；30(1)：132-141。18.奥普雷亚TI(OpreaTI)、尼耳森SK(NielsenSK)、乌阿苏O(UrsuO)等人，将药物、靶点和临床结果关联到综合网络中提供计算机辅助药物再利用的新平台，分子信息(MolInform)2011；30：100-111)。19.斯普朗索普.B(Springthorpe.B)、贝莉A(BaileyA)、巴顿P(BartonP)等人，从ATP到AZD6140：发现用于预防血栓形成的口服活性可逆P2Y12受体拮抗剂，生物有机化学与医药化学快报(BioorgMedChemLett)2007；17：6013-6018。20.范宁SW1(FanningSW1)、霍恩JR(HornJR)，抗半抗原骆驼抗体显示具有来自非高可变环的显著能量贡献的隐藏结合位点，蛋白质科学(ProteinSci.)2011；20：1196-1207。21.张K(ZhangK)、张J(ZhangJ)、高ZG(GaoZG)等人，与抗血栓形成药物复合的人P2Y12受体的结构，自然Nature.，2014；509：115-118。22.卡塔内奥M(CattaneoM)、舒尔茨R(SchulzR)、尼兰德S(NylanderS)，腺苷介导的替格瑞洛的效果：证据和潜在临床相关性，美国心脏病学会杂志(JAmCollCardiol)2014；63：2503-2509。23.席仑H(SillénH.)、库克M(CookM)、戴维斯P(DavisP)，通过平衡透析和LC-MS/MS测定人血浆中游离替格瑞洛及其活性代谢物(AR-C124910XX)，分析技术测定生物生命科学(JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci)2011；879(23)：2315-2322。在此提及的所有公开物和专利特此以其全文通过引用而结合，如同每个单独的公开物或专利被明确且单独地表明通过引用而结合。虽然已经讨论了本披露的特定方面，但上述说明是说明性而非限制性的。通过回顾此说明书和以下权利要求，本披露的多种变体对于本领域的技术人员而言将变得明显。应通过参考权利要求、连同它们的等效物的全部范围、以及说明书、连同这类变体，确定本披露的全部范围。<110><120>替格瑞洛的抗体及其使用方法<130>TICA-100WO1<160>80<170>专利版本3.5<210>1<211>363<212>DNA<213>智人<400>1gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactac180gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcaacagagtac300gacctgcaacggcctttcgggtttgacttctggggcaaggggacaatggtcaccgtctcg360agt363<210>2<211>121<212>PRT<213>智人<400>2GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrGluTyrAspLeuGlnArgProPheGlyPheAspPheTrpGly100105110LysGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>3<211>5<212>PRT<213>智人<400>3Ser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