用于癌症靶向治疗的包含基于重组血红蛋白蛋白质或亚基的治疗剂的药物组合物的制作方法

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技术领域：
本发明提供了具有载氧能力以替代天然血红蛋白的重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体和亚基，包括α、β、γ1、γ2单体(具有或不具有血红素分子)。本发明还提供了使用重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基来用于体内或离体组织的氧合的方法。本发明还提供了基于重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂，至少一个血红蛋白亚基已进行化学修饰以产生能够靶向和/或杀死癌细胞的物质。本发明另外提供了用于构建和表达不同重组血红蛋白亚基(包括α、β、γ1、γ2单体(具有或不具有血红素分子))及其二聚体和四聚体以及用于它们的化学修饰或工程化的方法。本发明还描述了用于产生基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂的化学工程化设计。本发明还涉及包含基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂的药物组合物，其用于人及其他动物中的癌症靶向治疗，特别是用于肝癌、乳腺癌、胰腺癌和由相应祖细胞诱发或与相应祖细胞相关的肿瘤。
背景技术：
：血红蛋白基氧载体(HBOC)最初开发作为血液替代品。人胎盘血红蛋白是一种特别有前景的HBOC。人胎盘血红蛋白由于与人红细胞相比其氧亲和力更高、粘度更低并且平均直径更小而允许将更多的氧输送至缺氧组织。然而，由大规模使用胎盘血红蛋白所构成的主要问题是由从胎盘提取胎盘血红蛋白并纯化的条件引起。将胎盘保持冷冻储存，并且为了提取血红蛋白，必须在解冻之前将其粉碎。然后，通过过滤除去组织和纤维蛋白原，并对所得滤液进行色谱、沉淀和渗滤的几个步骤。而且，人胚胎血红蛋白和人血液的来源是有限的。因此，构建和表达重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基对解决这一问题具有重要意义。缺氧在癌症中是常见的。缺氧和贫血(其有助于肿瘤缺氧)可通过使肿瘤细胞缺乏对这些药剂的细胞毒活性所必需的氧而导致电离辐射和化学治疗抗性。缺氧还可通过一种或多种间接机理(包括蛋白质组和基因组变化)而降低对放射治疗和化学治疗的肿瘤敏感性。因此，需要改进的癌症治疗组合物，特别是有利于靶向癌细胞并增强细胞毒剂的效力的改进的癌症治疗组合物。发明简述因此，在本发明中，构建了具有载氧能力的重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体和/或亚基。本发明提供了具有载氧能力以替代天然血红蛋白的重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体和亚基，包括α、β、γ1、γ2单体(具有或不具有血红素分子)。另外，提供了基于本发明的任意重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体和/或亚基的治疗剂，其能够靶向癌细胞以通过所缀合的治疗性药物(例如，化学治疗剂、放射治疗剂、抗癌蛋白质药物)来高效地杀死癌细胞。然而，发现广泛用于不同患者的常见化学治疗剂、放射治疗剂和抗癌蛋白质药物具有很多副作用。这些问题可通过对本发明的任意重组血红蛋白蛋白质、四聚体、二聚体或亚基进行化学修饰并将其与一种或多种治疗性药物连接来克服。因此，本发明还提供了基于重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂，其已被化学修饰以产生能够靶向和/或杀死癌细胞的物质。本发明另外提供了用于构建和表达不同重组血红蛋白亚基(包括α、β、γ1、γ2单体(具有或不具有血红素分子))及其二聚体和四聚体以及用于它们的化学修饰或工程化的方法。本发明还描述了用于产生基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂的化学工程化设计。本发明还涉及包含基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂的药物组合物，其用于人及其他动物中的癌症靶向治疗，特别是用于肝癌、乳腺癌、胰腺癌和由相应祖细胞诱发或与相应祖细胞相关的肿瘤。当与单独用于治疗癌症的常规治疗性药物(例如，化学治疗性药物，包括5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、顺铂)相比时，本发明的基于重组血红蛋白蛋白质、四聚体、二聚体或亚基的治疗剂不仅可靶向癌细胞，而且由于对癌细胞/肿瘤的杀伤效应进一步增强而可更有效地治疗癌症/或肿瘤。此外，由于与其他已知的血红蛋白基氧载体相比，靶向癌症的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂可以以相对较低的剂量使用，因此来自用于癌症的常规治疗性药物的不良副作用大大减弱。大部分的常规治疗性药物都非常昂贵。如果降低治疗有效剂量的话，对于每位患者而言可显著缩减治疗成本。本发明的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白亚基的治疗剂是用于降低治疗有效剂量的优良候选物，因为经修饰的重组血红蛋白蛋白质或重组血红蛋白亚基可靶向癌细胞。在一个实施方案中，基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂用于在人中治疗癌症的治疗有效剂量可为0.0024mg/kg受试者体重(对于单剂量而言)或更低。其可用于以多剂量(每周一次)治疗癌症。本发明还提供了使用重组血红蛋白蛋白质、重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基来用于体内和离体组织的氧合的方法。任选地，本发明要求保护的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂还可与荧光探针连接以有利于活细胞成像。缀合有荧光素的基于重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基的治疗剂可被肝癌细胞摄取。细胞对新鲜荧光素缀合的基于重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基的治疗剂的摄取通过在下文所述的一系列活细胞摄取研究中将其直接用于细胞来验证。在一个实例中，显示荧光素缀合的基于重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基的治疗剂被肝癌细胞(例如HepG2细胞系)摄取。因此，在本发明的第一方面，提供了不同的重组血红蛋白蛋白质、重组四聚体、重组二聚体和/或重组血红蛋白亚基(例如，α、β、γ1、γ2；具有或不具有血红素分子)，以及由其形成的二聚体和四聚体，并且还提供所述重组血红蛋白蛋白质、四聚体、二聚体和亚基用于进行进一步化学工程化或修饰。还提供了用于构建并在宿主中表达所述重组血红蛋白蛋白质或亚基及其二聚体和四聚体的方法。本发明的第二方面是构建用于靶向癌细胞的具有一个或多个官能团的经化学修饰的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基，所述一个或多个官能团可用作与至少一种类型的治疗性药物连接的连接或接头(可切割的或不可切割的)。在一个实施方案中，参与对本发明的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基进行化学修饰的化学反应包括但不限于胺反应、硫醇反应、羧酸酯反应、羟基反应、使用硫酯的天然化学连接、生物正交官能团的引入、光化学反应和金属介导的反应。可对重组血红蛋白蛋白质的一个或多个血红蛋白亚基进行化学修饰。本发明的第三方面是通过所述可切割或不可切割的连接或接头使本发明的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基与至少一种类型的治疗性药物(活性剂)化学连接以杀死癌细胞。可与本发明的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基连接的治疗性药物或活性剂包括但不限于化学治疗性药物(例如，5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、顺铂)、放射治疗性药物(例如，铑-105络合物、钐-153络合物及其他相关络合物)、抗癌蛋白质药物(例如，精氨酸酶、精氨酸脱亚胺酶)、任何其他治疗性药物和/或化合物：其被证明对于治疗和/或减轻癌症是有效的并且能够通过与重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基连接的或者与本发明的第二方面的经化学修饰的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基连接的可切割或不可切割的连接或接头容易地与本发明的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基连接。本发明还涉及包含基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂的药物组合物，其用于人及其他动物中癌症靶向治疗。所述组合物包含治疗有效量的所述治疗剂以及可药用载体、盐、缓冲剂、水或其组合以用于靶向和治疗癌症。在一个实施方案中，所述药物组合物的pH在5.5至9.5的范围内。在另一个实施方案中，所述药物组合物的pH在7.2至8.0的范围内。在本发明的第四方面，提供了用于靶向和/或治疗癌症的方法，其包括向患有不同肿瘤和/或癌症的有需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂。所述组合物可通过多种途径施用于受试者，所述途径包括但不限于静脉内注射、腹膜内注射和皮下注射。在本发明中可制备可切割和不可切割两种形式的包含活性剂(例如化学治疗剂(例如，5-氟尿嘧啶，5FU))的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂以用于癌症靶向治疗。还可对本发明的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂进行化学修饰以有利于治疗剂靶向癌细胞，使得其更有效地杀死癌细胞。可对重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基进行化学修饰，并使其与不同的治疗剂(例如，5FU、替莫唑胺、顺铂等)连接。重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基可靶向癌细胞。这一靶向特性有利于高效地通过诱导癌细胞、癌干细胞和/或癌祖细胞凋亡来杀死这些细胞。因此，可降低治疗剂的剂量。本发明中提供的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂可用于治疗多种癌症，例如胰腺癌、白血病、头颈癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌和脑癌。本发明涉及基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂、治疗癌症的方法以及治疗和/或抑制癌组织转移和癌组织复发的方法，所述癌症包括但不限于肝癌。肿瘤内的细胞是异质性的。一般认为肿瘤由以下构成：(1)大部分的分裂能力受到限制的癌细胞和(2)稀少的癌干细胞样细胞(CSC)(也称为祖细胞)群体，其可形成新的肿瘤细胞并且本质上具有高转移性。由于CSC固有的化学抗性和转移性，已假设其是癌症患者中复发的原因。由于本发明的基于重组血红蛋白蛋白质或者四聚体、二聚体或亚基的治疗剂中的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基部分可为CSC或祖细胞带来氧以有利于杀死癌干细胞或祖细胞，而本发明基于重组血红蛋白蛋白质或亚基的治疗剂中的活性剂部分可杀死癌细胞，因此本发明基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂在癌症治疗中具有协同效应。附图简述图1示出了用于构建基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂的设计方法。可使一种或多种治疗性药物与重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基(例如α、β、γ1、γ2)连接以形成基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的治疗剂。可使重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体、二聚体或亚基通过可切割的(A)或不可切割的接头/连接(B)与治疗剂化学连接。可切割的接头可以是但不限于甲醇胺、二硫化物、尿素、缩醛胺、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、酰胺、乙缩醛、亚胺、醚和磺胺基团；不可切割的接头可以是但不限于烷基和芳基。图2描绘了人源(智人)的不同血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)的氨基酸序列以及对于重组血红蛋白单体(即，单体α、单体β、单体γ1和单体γ2)、二聚体(即，二聚体αβ、二聚体αγ1、二聚体αγ2、二聚体βγ1和二聚体βγ2)和四聚体(即，四聚体2αβ2、四聚体2αγ12、四聚体2αγ22、四聚体2βγ12、四聚体2βγ22)的设计。图3是描绘用于由转化有不同构建体的细胞制备本发明的重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基的方法的概述的流程图，所述不同构建体表达具有本文中所述的氨基酸序列的不同血红蛋白四聚体、二聚体或亚基的蛋白质。图4示出了用于表达重组血红蛋白亚基γ1的大肠杆菌(E.coli)细胞JM109(DE3)的生长曲线。图5示出了(A)经纯化的重组血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)和(B)经纯化的重组血红蛋白二聚体和四聚体在SDS-PAGE中的分子大小。图6示出了经荧光染料标记的具有或不具有血红素的经纯化的重组血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)。图7示出了本发明的(A)一种重组血红蛋白四聚体(2αβ2)和另一种重组血红蛋白四聚体(2αγ12)的氧平衡曲线。图8描绘了本发明的一种重组血红蛋白二聚体(αβ)的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。图9描绘了本发明的一种重组血红蛋白四聚体(2αβ2)的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。图10显示具有血红素(+)或不具有血红素(-)的经荧光标记的重组血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)可成功地进入肝癌细胞(HepG2)中。图11示出了(A)5FU连接的重组血红蛋白四聚体(2αβ2)和(B)5FU连接的重组血红蛋白四聚体(2αγ12)的液相色谱-质谱(LC-MS)结果。图12示出了(A)具有二硫键的N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺(模型化合物)在还原条件(即，GSH(0.4当量至1,000当量)；PBS(pH7.4)；37℃，0小时至2小时)下的裂解；和(B)模型化合物在不同GSH水平下的转化率：GSH(1当量)类似于血流中，而GSH(1,000当量)类似于细胞质中。图13示出了与对照和经仅GEM处理的动物模型组相比，天然牛交联血红蛋白(Hb)四聚体和本发明的重组血红蛋白四聚体(2αβ2)在具有或不具有吉西他滨(GEM)下在胰腺癌Capan-1动物模型中减小肿瘤尺寸(就肿瘤重量(g)而言)的效力；组1：PBS缓冲液(对照)；组2：吉西他滨(GEM)，100mg/kg；组3：天然牛交联血红蛋白(Hb)四聚体，30mg/kg；组4：天然牛交联血红蛋白四聚体+吉西他滨(Hb+GEM)；组5：重组血红蛋白四聚体(2αβ2)，30mg/kg；组6：重组血红蛋白四聚体(2αβ2)+吉西他滨。图14示出了与对照和仅经GEM处理的动物模型组相比，天然牛交联血红蛋白(Hb)四聚体和本发明的重组血红蛋白四聚体(2αγ12)在具有或不具有吉西他滨(GEM)下在胰腺癌Capan-1动物模型中减小肿瘤尺寸(就肿瘤重量(g)而言)的效力；组1：PBS缓冲液(对照)；组2：吉西他滨(GEM)，100mg/kg；组3：天然牛交联血红蛋白(Hb)四聚体，30mg/kg；组4：天然牛交联血红蛋白四聚体+吉西他滨(Hb+GEM)；组5：重组血红蛋白四聚体(2αγ12)，30mg/kg；组6：重组血红蛋白四聚体(2αγ12)+吉西他滨。定义术语“癌干细胞”指瘤性克隆中能够在体内起始并维持肿瘤生长的生物学上独特的细胞(即癌症引发细胞)。术语“可切割的缀合物”指具有至少一个可切割的接头或连接的缀合物，其通过水解或氧化还原反应可容易地释放连接的治疗性药物/活性剂。术语“不可切割的缀合物”指具有至少一个不可切割的接头或连接的缀合物，其不能通过水解或氧化还原反应容易地释放连接的治疗性药物/活性剂。术语“重组血红蛋白蛋白质”指分子大小为至少约65KDa且通过任何标准分子化学技术合成的而非从任何动物或人来源分离或纯化的血红蛋白分子。在本发明中，重组血红蛋白蛋白质可包括但不限于本发明的重组血红蛋白四聚体、二聚体和亚基(单体)(具有或不具有血红素)或者可与重组血红蛋白四聚体互换使用。术语“重组血红蛋白四聚体”指分子大小为至少约64KDa且通过任何标准分子化学技术合成的而非从任何动物或人来源分离或纯化的血红蛋白分子。在本发明中，重组血红蛋白四聚体可包含本文中所述的任意四个重组血红蛋白亚基(具有或不具有血红素)或者包含通过任何标准分子化学技术合成的而非从任何动物或人来源分离或纯化的任意四个血红蛋白亚基。术语“重组血红蛋白二聚体”指分子大小为至少约32KDa且通过任何标准分子化学技术合成的而非从任何动物或人来源分离或纯化的血红蛋白分子。在本发明中，重组血红蛋白二聚体可包含本文中所述的任意两个重组血红蛋白亚基或者包含通过任何标准分子化学技术合成的而非从任何动物或人来源分离或纯化的任意两个血红蛋白亚基。术语“重组血红蛋白亚基”指分子大小为约16KDa或更小且通过标准分子化学技术合成的而非从动物或人来源分离或纯化的血红蛋白亚基或其片段，其可被修饰成具有或不具有血红素基团。发明详述由于大多数的癌组织(例如癌性肿瘤)是缺氧的，因此其可变得对常规的化学治疗剂/放射治疗剂具有抗性。本发明的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基可用于减轻这一缺氧性病症。本发明的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基由于与人红细胞相比其氧亲和力更高、粘度更低并且平均直径更小而允许将更多的氧输送至缺氧组织，从而导致降低癌细胞中的对化学治疗性药物/放射治疗性药物/其他抗癌药物-抗性。在本发明的一个实施方案中，制备了重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基。所述重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基具有氧输送特征并且可靶向人体或动物体中的癌细胞或癌组织。对作为氧载体的本发明的重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基进行化学修饰并且使其与至少一种类型的治疗性药物(例如，化学治疗剂)连接，所述治疗性药物能够触发受体介导的机理并且引导组合的/缀合的化学治疗剂与重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基一起定位于至少癌细胞的细胞质中以提高重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基和化学治疗剂二者减小肿瘤尺寸的效力从而导致治疗癌症。优选地，所述癌症对单独施用时的常规治疗性药物(例如化学治疗剂和/或放射治疗剂)具有抗性。图1A和图1B中示出了用于构建基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗性药物的设计。使一种或多种活性剂(或者“治疗性药物”可在本文中互换使用)与重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基连接以形成本发明要求保护的基于重组血红蛋白蛋白质或亚基的治疗剂。一种或多种具体活性剂的选择可根据所靶向癌组织的类型以及生成的经化学修饰的物质的所需分子大小。此外，在多于一种活性剂的情况下，所选择的活性剂可以是相同的或不同的。即，只要生成的分子保留效力并且还能够与本发明用于靶向癌细胞的重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基连接的活性剂(或“治疗性药物”)等。本发明的重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基可通过可切割的(图1A)或不可切割的连接或接头(图1B)与治疗性药物/活性剂化学连接，或者可替选地在所述连接或接头不存在下可与活性剂直接缀合。在本发明中可使用不同的化学基团来对重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基进行化学修饰，并且可使重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基通过这些化学基团与治疗性药物/活性剂连接。在一个实施方案中，可切割的接头可以是但不限于甲醇胺、二硫化物、尿素、缩醛胺、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、酰胺、乙缩醛、亚胺、肟、醚和磺胺基团；不可切割的接头可以是但不限于烷基和芳基。图2示出了不同血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)的氨基酸序列比对以及重组血红蛋白单体、二聚体和四聚体的设计。重组血红蛋白可使用来自多种物种的序列来制备，所述序列包括但不限于人、牛、猪、马和犬血红蛋白。在该实例中，选择具有约141至146个氨基酸的不同智人血红蛋白亚基氨基酸序列(即，α、β、γ1和γ2(SEQIDNo.1至4))来设计DNA构建体，将所述DNA构建体插入表达载体中并任选地用His-sumo/Poly-His序列标记以用于在转化有携带相应DNA构建体的表达载体的宿主(例如，细菌)中表达之后进行分离和纯化。用于制备重组血红蛋白蛋白质/亚基的方法在图3的流程图中进行了概述。任意两种亚基(例如α和β亚基或者α和γ1亚基)可通过使用携带表达α和β亚基或者α和γ1亚基的相应DNA序列的另一表达载体来表达。在根据图3流程图中所示的方法纯化之后，可分别形成二聚体αβ、αγ1、αγ2、βγ1和βγ2。还可使用类似的方法来形成两个以上亚基的进一步重组，例如两个α亚基和两个β亚基，或者两个α亚基和两个γ1亚基，或者两个α亚基和两个γ2亚基以形成四聚体，即分别为2αβ2、2αγ12、2αγ22、2βγ12、2βγ22。可在四聚体中的两个血红蛋白亚基之间进行进一步修饰，例如交联。重组血红蛋白亚基、二聚体和四聚体的氨基酸序列的设计示意图分别示于图2A、图2B和图2C中。图3中描绘的方法基于用于在转化有表达载体设计的宿主系统中表达重组蛋白的标准分子化学技术，所述表达载体设计携带用于表达本发明的相应血红蛋白亚基、二聚体或四聚体的相应DNA构建体。还可使用可表达重组蛋白的其他可能方法来表达本发明的重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基。首先，(301)制备具有经转化宿主细胞的种子培养物用于进行发酵(302)，所述宿主细胞携带用于表达相应血红蛋白亚基的DNA构建体。通过离心收获细胞(302)。然后，将收获的细胞裂解以分离粗制蛋白质(303)。然后，使用亲和色谱来纯化粗制蛋白质(304)。通过脱盐柱和/或超滤来除去来自亲和色谱的洗脱液中的盐(305)。将半纯化的蛋白质通过离子交换柱色谱进一步纯化(306)以除去蛋白质杂质和内毒素(307)。本发明的方法适用于重组单体血红蛋白、二聚体血红蛋白和四聚体血红蛋白的大规模工业生产。另外，与药用载体(例如，水、生理缓冲剂，在胶囊剂中)组合的重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基适用于哺乳动物使用。不同重组血红蛋白或者重组血红蛋白亚基的构建和表达在大肠杆菌中进行。例如，接种转化有携带用于表达γ1亚基的DNA构建体的表达载体的大肠杆菌JM109(DE3)，并培养约16小时以收获细胞用于细胞裂解和蛋白质提取。图4中示出了用于表达γ1亚基的大肠杆菌JM109(DE3)的生长曲线。然后，通过柱色谱方法来纯化重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基。根据本发明方法表达并纯化的重组血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)示于图5A中，并且根据本发明方法表达并纯化的重组血红蛋白二聚体和四聚体示于图5B中。图6示出了未经纯化但经荧光标记的具有或不具有血红素的亚基。测量受试化合物的p50值(在本发明中意指产生50％血红蛋白饱和度所必需的氧分压)并且结果示于图7中。天然人血红蛋白的p50值大约为约23mmHg至30mmHg。图7示出了(A)重组血红蛋白四聚体(2αβ2)和(B)重组血红蛋白四聚体(2αγ12)的氧平衡曲线。如图7中所示，重组血红蛋白四聚体2αβ2的p50值大约为约15mmHg，重组血红蛋白四聚体2αγ12的p50值大约为约21mmHg。与p50值大约为23mmHg至30mmHg的天然人血红蛋白相比，形成具有相对更高氧亲和力和小于约23mmHg的更低p50值的重组血红蛋白。在由大量血液损失引起的组织缺氧(例如失血性休克)的情况下，当期望快速氧合时，使用氧亲和力较低的包含血红蛋白基氧载体的组合物。较低的氧亲和力意指，与氧亲和力较高的物质相比，所述物质可更易于向靶标“卸载”氧。在癌症治疗中具有较高氧亲和力的组合物作为氧合辅助治疗是有用的，在这种情况下期望较慢的氧递送速率。对于治疗缺氧病症的用途和心脏保存，本发明的具有较低氧亲和力的包含血红蛋白基氧载体的药物组合物向靶器官或受试者提供氧。本发明的具有较低氧亲和力的重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基可用于需要快速组织氧合的应用(例如，失血性休克和离体器官保存)。对于在癌症治疗中的应用，本发明的具有较高氧亲和力的包含血红蛋白基氧载体的药物组合物充当组织氧合剂以改善肿瘤组织中的氧合，从而增强化学和放射敏感性。本发明的具有相对较高氧亲和力的重组血红蛋白可用于需要较缓慢氧合速率的应用(例如癌症辅助治疗)。ESI-MS能够对非常大的分子进行分析。ESI-MS是一种电离技术，其通过使蛋白质电离来分析高分子量化合物，然后基于质量/电荷比来分离电离的蛋白质。因此，可精确地确定分子量和蛋白质相互作用。在本发明中使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)来分析和表征重组血红蛋白单体、二聚体和四聚体。图8描绘了对重组血红蛋白二聚体(αβ)的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。α亚基的大小为15,189Da，β亚基的大小为15,899Da。图9描绘了对重组血红蛋白四聚体(2αβ2)的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。β亚基的大小为15,899Da，2α的大小为30,356Da。根据该分析，2αβ2的估算总分子大小为约46KDa。ESI-MS对重组血红蛋白四聚体(2αγ12)、其他重组血红蛋白二聚体和单体也有用。本发明的重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基用于制备用于组织氧合、用于癌症治疗、用于治疗缺氧病症(例如失血性休克)的药物并且用于低含氧量环境下的心脏保存(例如，心脏移植物)。本发明的重组血红蛋白四聚体的剂量选择为以下浓度范围：大约0.03g/kg动物体重或更低，或者0.0024g/kg人体重或更低(人剂量，根据FDA工业界指南和综述：EstimatingtheSafetyStartingDoseinClinicalTrialsforTherapeuticsinAdultHealthyVolunteers，2002年11月18日，通过用于小鼠的剂量除以系数12.3来确定)。对于用于癌症治疗的药物，本发明的包含血红蛋白基氧载体的药物组合物充当组织氧合剂以改善肿瘤组织中的氧合，从而增强化学敏感性(例如，对化学治疗的敏感性)和放射敏感性。本发明的药物组合物包含能够靶向并杀死癌细胞的基于重组血红蛋白或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂。图6示出了经荧光染料标记的具有或不具有血红素的经纯化重组血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)。经荧光标记的重组血红蛋白亚基也可进入癌细胞(例如，肝癌细胞，HepG2)中并定位在其中，并且结果示于图10中。可以预期，经化学修饰的基于重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基的治疗剂也可有效地杀死癌细胞和祖细胞/癌干细胞。一些常规的治疗性药物(例如，化学治疗性药物，5FU)由于高毒性而不能以高剂量使用。在本发明中，化学治疗剂(例如，5FU)与重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或者其任意亚基或者重组血红蛋白亚基自身化学连接。与其他单独施用用于癌症的常规方法/药剂相比，与本发明要求保护的重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或者其亚基连接的化学治疗剂可具有较低的剂量，因为本发明要求保护的重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基有利于化学治疗剂定位在癌细胞的细胞质中以提高本发明重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基和化学治疗剂二者的效力。本发明的重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或亚基还可提高放射治疗剂和/或其他抗癌药物对癌细胞或肿瘤的效力，尤其是对用于癌症治疗的这些常规治疗性药物更具抗性的缺氧的癌细胞或肿瘤的效力。图11示出了(A)5FU连接的重组血红蛋白四聚体(2αβ2)和(B)5FU连接的重组血红蛋白四聚体(2αγ12)的液相色谱-质谱(LC-MS)结果。5FU成功地与重组血红蛋白四聚体化学连接。其还适用于其他化学连接的重组血红蛋白二聚体和重组血红蛋白亚基(或单体)。重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或者其亚基在与治疗性药物连接之前可被不同的官能团化学修饰。可通过以下一种或多种化合物或反应对重组血红蛋白蛋白质或四聚体或二聚体或者其亚基进行修饰：(1)对于胺反应：酸酐；乙烯酮；NHS酯；异硫氰酸酯；异氰酸酯；包括氟苯基酯和羰基叠氮化物的活性酯；磺酰氯；羰基化合物，之后被还原性胺化；环氧化物；碳酸酯；氟苯；亚氨酸酯；羟甲基膦衍生物；曼尼希缩合；重氮基衍生物；4-磺基-2,3,5,6-四氟苯酚；羰基二咪唑；磺基-NHS，和通过吡哆醛-5-磷酸基仿生转氨基的N端修饰；(2)对于硫醇反应：马来酰亚胺、卤代烷、卤代乙酰胺、二硫化物、硫代硫酸酯、含氮丙啶试剂、丙烯酰基衍生物、芳基化剂和乙烯基砜衍生物；(3)对于羧酸酯反应：重氮烷和重氮基乙酰基化合物、羰基二咪唑和碳二亚胺；(4)对于羟基反应：环氧化物和环氧乙烷、羰基二咪唑、碳酸酯、氯甲酸酯、化学和酶促氧化、烷基卤素和异氰酸酯；(5)使用硫酯的天然化学连接；(6)N-端修饰，利用N-端丝氨酸或苏氨酸的高碘酸盐氧化来生成用于与羟胺、肼或酰肼、碳二亚胺偶联的醛；(7)对于生物正交官能团的引入：包括发生后续生物正交缀合反应的炔烃和叠氮化物，所述后续生物正交缀合反应包括炔烃和叠氮化物的偶极加成Huisgen1,3-偶极加成、叠氮化物和三芳基膦的施陶丁格连接、炔烃和四嗪的Diels-alder反应，以及炔烃和四唑的偶联；(8)对于光化学反应：光亲和标记剂、二氮丙啶衍生物、二苯甲酮和蒽醌；(9)对于金属介导的反应：金属类卡宾和钯活化的烯丙基试剂。与血流(约1当量)相比，癌细胞的细胞质中具有远远更高的谷胱甘肽(GSH)水平(约1000当量)。具有二硫键的治疗性药物在具有高GSH浓度的癌细胞细胞质中更容易被裂解。图12中示出了具有二硫键的模型化合物(N-(2-巯基乙基)苯甲酰胺)在还原条件下的裂解的高效液相色谱(HPLC)分析。在具有不同浓度的谷胱甘肽(GSH)(0.4当量至1000当量)的PBS缓冲液(pH7.4)中在37℃下观察模型化合物的裂解。在高GSH浓度(>50当量)下，模型化合物的裂解较好。在本发明中，制备通过二硫键与治疗性药物(例如，化学治疗剂、放射治疗剂、抗癌蛋白质药物)连接的重组血红蛋白或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基用于进行癌症治疗。市场上尚没有基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂可供利用。本发明中提供的包含经化学修饰的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂的药物组合物可靶向癌细胞并具有治疗效果。对于在癌症治疗中的用途，本发明的包含经化学修饰的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂的药物组合物充当抗癌剂以杀死癌细胞。经化学修饰的基于重组血红蛋白蛋白质或者重组血红蛋白四聚体或二聚体或亚基的治疗剂是以较低剂量使用的良好候选物并且可与其他分子靶向剂或细胞毒剂组合。实施例通过描述本发明的一些具体实施方案的方式提供了以下实施例，而并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实施例1(a)构建具有重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或其亚基的表达载体合成人源的α/β/γ1/γ2链的DNA序列，并克隆在PUC57载体中。通过PCR方法扩增α/β/γ1/γ2链。PCR中使用的引物基于两条α/β/γ1/γ2链来设计。PCR在梯度热循环仪(Lifesci)中进行。反应在25μl反应混合物中进行，反应混合物包含：Taq缓冲液、10mMdNTP、25mMMgCl2、10μM引物、2.5UTaqDNA聚合酶和100ng模板DNA。梯度PCR条件包括：95℃下3分钟的初始变性步骤；接着是25个扩增循环，扩增循环由在95℃下变性30秒，在50℃至55℃下引物退火30秒以及在72℃下延伸45秒组成；之后在72℃下最后延伸5分钟。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳与标准参照物一起分离PCR产物并用凝胶红染色。切下预期大小的产物带并用PCR清洁凝胶提取试剂盒根据生产商的说明提取DNA片段。将经纯化的DNA片段克隆到pSumo载体或PUC19载体中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5a菌株中，并在包含100ng/ml氨苄青霉素的LB琼脂上筛选转化株。通过核苷酸测序来验证假定克隆。使用BLAST算法程序来进行cDNA序列的分析。(b)不同的重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基如图2和表1中所示产生七种重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基。α/β/γ1/γ2链的蛋白质序列示于图2中。对于重组血红蛋白单体，将α/β/γ1/γ2链克隆到pSumo载体中并且由T7启动子来控制融合蛋白的表达。对于重组血红蛋白异二聚体，将α链和β/γ1链在pUC19载体中共表达并使其处于pTac启动子的控制之下。对于重组血红蛋白四聚体，将两条α链通过甘氨酸接头连接并与β/γ1链在pUC19载体中共表达且使其处于pTac启动子的控制之下。表1：不同的重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基实施例2重组蛋白的表达将用于表达重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基的质粒转化到大肠杆菌JM109(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)中。将大肠杆菌细胞在补充有氨苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基中在37℃下培养。对于摇瓶式表达，将过夜培养物以1:100添加到包含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。在摇瓶中在37℃下培养细胞直至600nm下的光密度达到0.6。通过添加异丙基b-硫代半乳糖苷至0.4mM来诱导重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基的表达。然后，向培养物补充血红素(20mg/L)，并在28℃下继续生长至少16小时。对于发酵罐培养物，用于表达重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基的培养基包含1.28％细菌用胰蛋白胨、0.8％细菌用酵母提取物、1％甘油、25mMKH2PO4、25mMNa2HPO4、45mMNH4Cl、5mM(NH4)2SO4和100mg/L氨苄青霉素。将细胞在2L发酵罐(Sartorius,B)中在30℃下培养直至600nm下的光密度达到8。通过添加异丙基b-硫代半乳糖苷(Sigma)至mM来诱导重组血红蛋白蛋白质/四聚体/二聚体/亚基的表达。然后，向培养物补充血红素(50mg/L)，并在25℃下继续生长至少16小时。通过离心收获细胞并将其冷冻储存在-80℃下直至需要进行纯化。实施例3重组血红蛋白在摇瓶和发酵罐中的蛋白质产量重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基的蛋白质产量总结于表2中。发酵方法的蛋白质产量远远更高，可高达180mg/L。表2：重组人血红蛋白通过摇瓶和发酵的蛋白质产量蛋白质培养方法蛋白质产量单体-α摇瓶20mg/L至40mg/L单体-β摇瓶20mg/L至40mg/L单体-γ1摇瓶20mg/L至40mg/L单体-γ2摇瓶20mg/L至40mg/L二聚体-αβ摇瓶5mg/L至10mg/L二聚体-αγ1摇瓶5mg/L至10mg/L四聚体-2αβ2摇瓶5mg/L至10mg/L单体-γ1发酵180mg/L四聚体-2αβ2发酵30mg/L至40mg/L实施例4用于癌细胞系的培养和试剂将癌细胞(HepG2)在具有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM(Invitrogen)中在37℃下进行培养。对于常氧条件，在环境O2浓度和5％CO2下孵育细胞；对于缺氧条件，在0.1％至0.5％O2(QuorumFC-7自动CO2/O2/N2气体混合器)和5％CO2下孵育细胞。实施例5癌细胞中的活细胞缩时显微术将癌细胞(例如HepG2肝癌细胞)接种到玻璃底微孔培养皿(MatTekCorporation)上。使用装备有气氛/温度控制室和用于多位置采集的电动平台的ZeissObserverZ1宽视野显微镜来采集在限定变焦(63x、20x)下的活细胞。在经0.1％O2和5％CO2(预先混合)净化的封闭活细胞成像系统中进行孵育。使细胞暴露于经荧光标记的重组血红蛋白亚基(α、β、γ1、γ2)持续15分钟，之后每隔3分钟采集图像，持续2小时的时间。使用MetaMorph软件(MolecularDevice)将图像去卷积并压制成缩时影片。图像示于图10中。实施例6(a)重组血红蛋白四聚体(2αβ2)对癌细胞异种移植物的体内效力在该实施例中使用裸balb/c小鼠(5周至7周)，并且在实验之前允许其适应一周。向小鼠皮下接种在100μl新鲜培养基中的2x106个癌细胞。10天之后，将小鼠随机分成对照组和处理组。对照组接受100μlPBS，处理组(第2至6组)每周(每周两次，持续4周)腹膜内接受药物。吉西他滨是一种抗癌(“抗肿瘤性”或“细胞毒性”)化学治疗性药物，并且在第2组、第4组和第6组中使用。通过卡尺测量肿瘤尺寸并使用下式计算肿瘤体积：(长度x宽度2)/2。结果示于图13中。结果显示，重组血红蛋白四聚体(2αβ2)可抑制肿瘤细胞的生长。(b)重组血红蛋白四聚体(2αγ12)对癌细胞异种移植物的体内效力在该实施例中使用裸balb/c小鼠(5周至7周)，并且在实验之前允许其适应一周。向小鼠皮下接种在100μl新鲜培养基中的2x106个癌细胞。10天之后，将小鼠随机分成对照组和处理组。对照组接受100μlPBS，处理组(第2至6组)每周(每周两次，持续4周)腹膜内接受药物。吉西他滨是一种抗癌(“抗肿瘤性”或“细胞毒性”)的化学治疗性药物，并且在第2组、第4组和第6组中使用。通过卡尺测量肿瘤尺寸并使用下式计算肿瘤体积：(长度x宽度2)/2。结果示于图14中。结果显示，重组血红蛋白四聚体(2αγ12)可抑制肿瘤细胞的生长。当与其他化学治疗性药物(吉西他滨)组合时，重组血红蛋白四聚体还产生更好的结果。观察到对癌症治疗、抑制转移和/或降低复发的协同效应。工业适用性本发明的重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基可用于氧合，在靶向可能对用于癌症的常规治疗性药物具有抗性的癌细胞或组织或肿瘤中是有用的。本发明经化学修饰的重组血红蛋白蛋白质、四聚体和/或二聚体和/或亚基在体内还能够被裂解或者在体内是可降解的，使得对所施用的受试者不产生细胞毒效应。配置成与一种或多种常规治疗性药物连接的重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基可克服患者中一些类型的癌症中或者癌症的某些阶段中的抗性问题。重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基易于配制成药物组合物，并且包含治疗有效量的连接有或未连接有一种或多种治疗性药物的重组血红蛋白蛋白质和/或四聚体和/或二聚体和/或亚基的所述药物组合物可用于多种应用，包括使组织氧合、治疗失血性休克和缺氧疾病，和/或靶向抗药性癌细胞/组织。序列表<110>黄炳镠<120>用于癌症靶向治疗的包含基于重组血红蛋白蛋白质或亚基的治疗剂的药物组合物<130>P7797US01<150>US62/019,925<151>2014-07-02<150>US14752999<151>2015-06-28<160>4<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>141<212>PRT<213>智人<400>1ValLeuSerProAlaAspLysThrAsnValLysAlaAlaTrpGlyLys151015ValGlyAlaHisAlaGlyGluTyrGlyAlaGluAlaLeuGluArgMet202530PheLeuSerPheProThrThrLysThrTyrPheProHisPheAspLeu354045SerHisGlySerAlaGlnValLysGlyHisGlyLysLysValAlaAsp505560AlaLeuThrAsnAlaValAlaHisValAspAspMetProAsnAlaLeu65707580SerAlaLeuSerAspLeuHisAlaHisLysLeuArgValAspProVal859095AsnPheLysLeuLeuSerHisCysLeuLeuValThrLeuAlaAlaHis100105110LeuProAlaGluPheThrProAlaValHisAlaSerLeuAspLysPhe115120125LeuAlaSerValSerThrValLeuThrSerLysTyrArg130135140<210>2<211>146<212>PRT<213>智人<400>2ValHisLeuThrProGluGluLysSerAlaValThrAlaLeuTrpGly151015LysValAsnValAspGluValGlyGlyGluAlaLeuGlyArgLeuLeu202530ValValTyrProTrpThrGlnArgPhePheGluSerPheGlyAspLeu354045SerThrProAspAlaValMetGlyAsnProLysValLysAlaHisGly505560LysLysValLeuGlyAlaPheSerAspGlyLeuAlaHisLeuAspAsn65707580LeuLysGlyThrPheAlaThrLeuSerGluLeuHisCysAspLysLeu859095HisValAspProGluAsnPheArgLeuLeuGlyAsnValLeuValCys100105110ValLeuAlaHisHisPheGlyLysGluPheThrProProValGlnAla115120125AlaTyrGlnLysValValAlaGlyValAlaAsnAlaLeuAlaHisLys130135140TyrHis145<210>3<211>146<212>PRT<213>智人<400>3GlyHisPheThrGluGluAspLysAlaThrIleThrSerLeuTrpGly151015LysValAsnValGluAspAlaGlyGlyGluThrLeuGlyArgLeuLeu202530ValValTyrProTrpThrGlnArgPhePheAspSerPheGlyAsnLeu354045SerSerAlaSerAlaIleMetGlyAsnProLysValLysAlaHisGly505560LysLysValLeuThrSerLeuGlyAspAlaThrLysHisLeuAspAsp65707580LeuLysGlyThrPheAlaGlnLeuSerGluLeuHisCysAspLysLeu859095HisValAspProGluAsnPheLysLeuLeuGlyAsnValLeuValThr100105110ValLeuAlaIleHisPheGlyLysGluPheThrProGluValGlnAla115120125SerTrpGlnLysMetValThrAlaValAlaSerAlaLeuSerSerArg130135140TyrHis145<210>4<211>146<212>PRT<213>智人<400>4GlyHisPheThrGluGluAspLysAlaThrIleThrSerLeuTrpGly151015LysValAsnValGluAspAlaGlyGlyGluThrLeuGlyArgLeuLeu202530ValValTyrProTrpThrGlnArgPhePheAspSerPheGlyAsnLeu354045SerSerAlaSerAlaIleMetGlyAsnProLysValLysAlaHisGly505560LysLysValLeuThrSerLeuGlyAspAlaIleLysHisLeuAspAsp65707580LeuLysGlyThrPheAlaGlnLeuSerGluLeuHisCysAspLysLeu859095HisValAspProGluAsnPheLysLeuLeuGlyAsnValLeuValThr100105110ValLeuAlaIleHisPheGlyLysGluPheThrProGluValGlnAla115120125SerTrpGlnLysMetValThrGlyValAlaSerAlaLeuSerSerArg130135140TyrHis145当前第1页1 2 3