与PD‑1和LAG‑3具有免疫反应性的共价结合的双抗体和其使用方法与流程

本申请要求美国专利申请号62/017,467(提交于2014年6月26日；在审)的优先权，所述申请通过引用以其整体并入本文。参考序列表根据37C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，所述序列表以计算机可读介质(1301_0115PCT_序列_序列表_ST25.txt，2015年6月2日创建，并且大小为50,015字节)的形式公开，并且通过引用将所述文件以其整体并入本文文件。本发明的背景
技术领域：
：本发明涉及包括两条或更多条多肽链的双特异性双抗体，其具有对PD-1的表位为免疫特异性的至少一个表位结合位点和对LAG-3的表位为免疫特异性的至少一个表位结合位点(即，“PD-1xLAG-3双特异性双抗体”)。更优选地，本发明涉及包括四条多肽链的双特异性双抗体，其具有对PD-1的一个(或两个)表位为免疫特异性的两个表位结合位点和对LAG-3的一个(或两个)表位为免疫特异性的两个表位结合位点(即，“PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体”)。本发明还涉及另外包括免疫球蛋白Fc结构域的这样的双抗体(“双特异性Fc双抗体”和“双特异性、四价Fc双抗体”)。本发明的双抗体能够同时结合PD-1和LAG-3，尤其是在这样的分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及包含这样的双抗体的药学组合物，并且涉及使用这样的双抗体治疗癌症和其他疾病和病况的方法。现有技术描述细胞介导的免疫应答人和其他哺乳动物的免疫系统负责提供针对感染和疾病的保护。这种保护通过体液免疫应答和细胞介导的免疫应答二者被提供。体液应答导致能够识别和中和外源靶(抗原)的抗体和其他生物分子的产生。相比之下，细胞介导的免疫应答涉及巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和抗原特异性细胞毒T-淋巴细胞通过T-细胞的激活，和响应抗原的识别的各种细胞因子的释放(Dong,C.等(2003)“ImmuneRegulationbyNovelCostimulatoryMolecules,Immunolog.Res.28(1):39-48)。T-细胞最佳地介导针对抗原的免疫应答的能力需要两种不同的信号传导相互作用(Viglietta,V.等(2007)“ModulatingCo-Stimulation,Neurotherapeutics4:666-675；Korman,A.J.等(2007)“CheckpointBlockadeinCancerImmunotherapy,Adv.Immunol.90:297-339)。第一，排列在抗原呈递细胞(APC)的表面上的抗原必须被呈递至抗原特异性原初(naive)CD4+T-细胞。这样的呈递经T-细胞受体(TCR)递送信号，所述信号引导T-细胞启动对呈递的抗原为特异性的免疫应答。第二，通过在APC和不同的T-细胞表面分子之间的相互作用介导的一系列共刺激和抑制信号首先触发T-细胞的激活和增殖，并最终导致它们的抑制。因此，第一信号赋予免疫应答特异性，而第二信号用于确定应答的性质、量级(magnitude)和持续时间。免疫系统通过共刺激和共抑制配体和受体被严格地控制。这些分子提供用于T-细胞激活的第二信号，并且提供正信号和副信号的平衡网络以最大化针对感染的免疫应答，同时限制对自身的免疫(Wang,L.等(2011年3月7日)“VISTA,ANovelMouseIgSuperfamilyLigandThatNegativelyRegulatesT-CellResponses,”J.Exp.Med.10.1084/jem.20100619:1-16；Lepenies,B.等(2008)“TheRoleOfNegativeCostimulatorsDuringParasiticInfections,”Endocrine,Metabolic&ImmuneDisorders-DrugTargets8:279-288)。尤其重要的是抗原呈递细胞的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配体和CD4+T-淋巴细胞的CD28和CTLA-4受体之间的结合(Sharpe,A.H.等(2002)“TheB7-CD28Superfamily”,NatureRev.Immunol.2:116-126；Dong,C.等(2003)“ImmuneRegulationbyNovelCostimulatoryMolecules”,Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“TheClinicalUtilityOfInhibitingCD28-MediatedCostimulation”,Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1或B7.2与CD28的结合刺激T-细胞激活；B7.1或B7.2与CTLA-4的结合抑制这种激活(Dong,C.等(2003)“ImmuneRegulationbyNovelCostimulatoryMolecules”,Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“TheClinicalUtilityOfInhibitingCD28-MediatedCostimulation”,Immunol.Rev.229:307-321；Greenwald,R.J.等(2005)“TheB7FamilyRevisited”,Ann.Rev.Immunol.23:515-548)。CD28在T-细胞的表面上组成型表达(Gross,J.,等(1992)“IdentificationAndDistributionOfTheCostimulatoryReceptorCD28InTheMouse”,J.Immunol.149:380–388)，而CTLA4表达在T细胞激活之后被快速上调(Linsley,P.等(1996)“IntracellularTraffickingOfCTLA4AndFocalLocalizationTowardsSitesOfTCREngagement,”Immunity4:535–543)。因为CTLA4是更高的亲和性受体(Sharpe,A.H.等(2002)“TheB7-CD28Superfamily”,NatureRev.Immunol.2:116-126)，所以结合首先启动T-细胞增殖(经CD28)，然后抑制它(经CTLA4的初期表达)，从而在不再需要增殖时阻遏所述效果。CD28受体的配体的进一步研究导致一组相关的B7分子(“B7超家族”)的鉴定和表征(Coyle,A.J.等(2001)“TheExpandingB7Superfamily:IncreasingComplexityInCostimulatorySignalsRegulatingT-CellFunction”,NatureImmunol.2(3):203-209；Sharpe,A.H.等(2002)“TheB7-CD28Superfamily”,NatureRev.Immunol.2:116-126；Greenwald,R.J.等(2005)“TheB7FamilyRevisited”,Ann.Rev.Immunol.23:515-548；Collins,M.等(2005)“TheB7FamilyOfImmune-RegulatoryLigands”,GenomeBiol.6:223.1-223.7；Loke,P.等(2004)“EmergingMechanismsOfImmuneRegulation:TheExtendedB7FamilyAndRegulatoryT-Cells.”ArthritisRes.Ther.6:208-214；Korman,A.J.等(2007)“CheckpointBlockadeinCancerImmunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339；Flies,D.B.等(2007)“TheNewB7s:PlayingaPivotalRoleinCancerImmunotherapy,”J.Immunother.30(3):251-260；Agarwal,A.等(2008)“TheRoleOfPositiveCostimulatoryMoleculesInTransplantationAndTolerance,”Curr.Opin.OrganTransplant.13:366-372；Lenschow,D.J.等(1996)“CD28/B7SystemofT-CellCostimulation,”Ann.Rev.Immunol.14:233-258；Wang,S.等(2004)“Co-SignalingMoleculesOfTheB7-CD28FamilyInPositiveAndNegativeRegulationOfTLymphocyteResponses,”MicrobesInfect.6:759-766)。该家族当前具有若干个已知成员：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、程序性死亡-1配体(PD-L1；B7-H1)、程序性死亡-2配体(PD-L2；B7-DC)、B7-H3、B7-H4和B7-H6(Collins,M.等(2005)“TheB7FamilyOfImmune-RegulatoryLigands,”GenomeBiol.6:223.1-223.7；Flajnik,M.F.等(2012)“EvolutionOfTheB7Family:Co-EvolutionOfB7H6AndNkp30,IdentificationOfANewB7FamilyMember,B7H7,AndOfB7'sHistoricalRelationshipWithTheMHC,”Immunogeneticsepubdoi.org/10.1007/s00251-012-0616-2)。PD-1程序性死亡-1(“PD-1”)是广义地负调节免疫应答的T-细胞调节剂的扩展的CD28/CTLA4家族的约31kDI型膜蛋白成员(Ishida,Y.等(1992)“InducedExpressionOfPD-1,ANovelMemberOfTheImmunoglobulinGeneSuperfamily,UponProgrammedCellDeath”,EMBOJ.11:3887-3895；美国专利申请公开号2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667；美国专利号6,808,710；7,101,550；7,488,802；7,635,757；7,722,868；PCT公开号WO01/14557)。与CTLA4相比，PD-1更多。PD-1表达在激活的T-细胞、B细胞和单核细胞上(Agata,Y.等(1996)“ExpressionOfThePD-1AntigenOnTheSurfaceOfStimulatedMouseTAndBLymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772；Yamazaki,T.等(2002)“ExpressionOfProgrammedDeath1LigandsByMurineT-CellsAndAPC,”J.Immunol.169:5538-5545)并在天然杀伤(NK)T细胞中以低水平表达(Nishimura,H.等(2000)“FacilitationOfBetaSelectionAndModificationOfPositiveSelectionInTheThymusOfPD-1-DeficientMice,”J.Exp.Med.191:891-898；Martin-Orozco,N.等(2007)“InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,”Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。PD-1的细胞外区域由与CTLA4中的相当的(equivalent)结构域具有23％同一性的单一免疫球蛋白(Ig)V结构域组成(Martin-Orozco,N.等(2007)“InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,”Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。细胞外IgV结构域之后是跨膜区和细胞内尾区。细胞内尾区包含位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节TCR信号(Ishida,Y.等(1992)“InducedExpressionOfPD-1,ANovelMemberOfTheImmunoglobulinGeneSuperfamily,UponProgrammedCellDeath,”EMBOJ.11:3887-3895；Blank,C.等(Epub2006Dec29)“ContributionOfThePD-L1/PD-1PathwayToT-CellExhaustion:AnUpdateOnImplicationsForChronicInfectionsAndTumorEvasionCancer,”Immunol.Immunother.56(5):739-745)。通过结合B7-H1和B7-DC，PD-1介导其对免疫系统的抑制(Flies，D.B.等(2007)“TheNewB7s:PlayingaPivotalRoleinTumorImmunity,”J.Immunother.30(3):251-260；美国专利号6,803,192；7,794,710；美国专利申请公开号2005/0059051；2009/0055944；2009/0274666；2009/0313687；PCT公开号WO01/39722；WO02/086083)。B7-H1和B7-DC是广泛表达在人和鼠科动物组织表面上的结合配体，所述组织比如心、胎盘、肌肉、胎肝(fetalliver)、脾、淋巴结和胸腺以及鼠科动物肝、肺、肾、胰腺和小肠的胰岛细胞(Martin-Orozco,N.等(2007)“InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,”Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。在人中，在人内皮细胞(Chen,Y.等(2005)“ExpressionofB7-H1inInflammatoryRenalTubularEpithelialCells,”Nephron.Exp.Nephrol.102:e81-e92；deHaij,S.等(2005)“RenalTubularEpithelialCellsModulateT-CellResponsesViaICOS-LAndB7-H1”KidneyInt.68:2091-2102；Mazanet,M.M.等(2002)“B7-H1IsExpressedByHumanEndothelialCellsAndSuppressesT-CellCytokineSynthesis,”J.Immunol.169:3581-3588)、心肌(Brown,J.A.等(2003)“BlockadeOfProgrammedDeath-1LigandsOnDendriticCellsEnhancesT-CellActivationAndCytokineProduction,”J.Immunol.170:1257-1266)、合体滋养层细胞(syncyciotrophoblasts)(Petroff,M.G.等(2002)“B7FamilyMolecules:NovelImmunomodulatorsAtTheMaternal-FetalInterface,”Placenta23:S95-S101)中已经发现了B7-H1蛋白质表达。分子也由一些组织的驻留型(resident)巨噬细胞表达、由已经用干扰素(IFN)-γ或肿瘤坏死因子(TNF)-α激活的巨噬细胞表达(Latchman,Y.等(2001)“PD-L2IsASecondLigandForPD-1AndInhibitsT-CellActivation,”Nat.Immunol2:261-268)，并在肿瘤中表达(Dong,H.(2003)“B7-H1PathwayAndItsRoleInTheEvasionOfTumorImmunity,”J.Mol.Med.81:281-287)。已经发现B7-H1和PD-1之间的相互作用为T和B细胞提供了重要的负共刺激信号(Martin-Orozco,N.等(2007)“InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,”Semin.CancerBiol.17(4):288-298)，并且用作细胞死亡诱导者(Ishida,Y.等(1992)“InducedExpressionOfPD-1,ANovelMemberOfTheImmunoglobulinGeneSuperfamily,UponProgrammedCellDeath,”EMBOJ.11:3887-3895；Subudhi,S.K.等(2005)“TheBalanceOfImmuneResponses:CostimulationVerseCoinhibition,”J.Molec.Med.83:193-202)。更具体而言，已经发现低浓度的PD-1受体和B7-H1配体之间的相互作用导致强烈抑制抗原特异性CD8+T-细胞增殖的抑制信号的传输；在更高的浓度下，与PD-1的相互作用不抑制T细胞增殖但是显著减少多种细胞因子的产生(Sharpe,A.H.等(2002)“TheB7-CD28Superfamily,”NatureRev.Immunol.2:116-126)。已经发现可溶性B7-H1-Fc融合蛋白抑制静息和先前激活的CD4和CD8T-细胞，以及甚至来自脐带血的原初T-细胞的T细胞增殖和细胞因子产生(Freeman,G.J.等(2000)“EngagementOfThePD-1ImmunoinhibitoryReceptorByANovelB7FamilyMemberLeadsToNegativeRegulationOfLymphocyteActivation,”J.Exp.Med.192:1-9；Latchman,Y.等(2001)“PD-L2IsASecondLigandForPD-1AndInhibitsT-CellActivation,”NatureImmunol.2:261-268；Carter,L.等(2002)“PD-1:PD-LinhibitorypathwayaffectsbothCD4(+)andCD8(+)T-cellsandisovercomebyIL-2,”Eur.J.Immunol.32(3):634-643；Sharpe,A.H.等(2002)“TheB7-CD28Superfamily,”NatureRev.Immunol.2:116-126)。B7-H1和PD-1在抑制T-细胞激活和增殖中的作用已经提示这些生物分子可能用作用于治疗炎症和癌症的治疗性靶。因此，已经建议了抗PD-1抗体治疗感染和肿瘤以及上调适应性免疫应答的用途(见美国专利申请公开号2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401；美国专利号7,521,051、7,563,869、7,595,048；PCT公开号WO2004/056875、WO2008/083174)。Agata,T.等(1996)“ExpressionOfThePD-1AntigenOnTheSurfaceOfStimulatedMouseTAndBLymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772和Berger,R.等(2008)“PhaseISafetyAndPharmacokineticStudyOfCT-011,AHumanizedAntibodyInteractingWithPD-1,InPatientsWithAdvancedHematologicMalignancies,”Clin.CancerRes.14(10):3044-3051已经报道了能够免疫特异性结合PD-1的抗体(也见美国专利号8,008,449和8,552,154；美国专利公开号2007/0166281、2012/0114648、2012/0114649、2013/0017199、2013/0230514和2014/0044738；和PCT专利公开WO2003/099196、WO2004/004771、WO2004/056875、WO2004/072286、WO2006/121168、WO2007/005874、WO2008/083174、WO2009/014708、WO2009/073533、WO2012/135408、WO2012/145549和WO2013/014668)。LAG-3淋巴细胞激活基因3(LAG-3，CD223)是由激活的CD4+和CD8+T-细胞和NK细胞表达的细胞-表面受体蛋白质，并且由浆细胞样树突细胞组成型表达；LAG-3不被B细胞、单核细胞或任何其他测试的细胞类型表达(Workman,C.J.等(2009)“LAG-3RegulatesPlasmacytoidDendriticCellHomeostasis,”J.Immunol.182(4):1885-1891)。已经发现，LAG-3与T-细胞共受体CD4密切相关(Grosso,J.F.等(2009)“FunctionallyDistinctLAG-3andPD-1SubsetsonActivatedandChronicallyStimulatedCD8T-Cells,”J.Immunol.182(11):6659-6669；Huang,C.T.等(2004)“RoleOfLAG-3InRegulatoryT-Cells,”Immunity21:503-513；Workman,C.J.等(2009)“LAG-3RegulatesPlasmacytoidDendriticCellHomeostasis,”J.Immunol.182(4):1885-1891)。如CD4，LAG-3也结合II类MHC分子，但是以显著更高的亲和力结合II类MHC分子(Workman,C.J.等(2002)“PhenotypicAnalysisOfTheMurineCD4-RelatedGlycoprotein,CD223(LAG-3),”Eur.J.Immunol.32:2255-2263；Huard,B.等(1995)“CD4/MajorHistocompatibilityComplexClassIIInteractionAnalyzedWithCD4-AndLymphocyteActivationGene-3(LAG-3)-IgFusionProteins,”Eur.J.Immunol.25:2718-2721；Huard,B.等(1994)“CellularExpressionAndTissueDistributionOfTheHumanLAG-3-EncodedProtein,AnMHCClassIILigand,”Immunogenetics39:213-217)。研究已经显示LAG-3在负调节T-细胞增殖、功能和稳态中起重要的作用(Workman,C.J.等(2009)“LAG-3RegulatesPlasmacytoidDendriticCellHomeostasis,”J.Immunol.182(4):1885-1891；Workman,C.J.等(2002)“CuttingEdge：MolecularAnalysisOfTheNegativeRegulatoryFunctionOfLymphocyteActivationGene-3,”J.Immunol.169:5392-5395；Workman,C.J.等(2003)“TheCD4-RelatedMolecule,LAG-3(CD223),RegulatesTheExpansionOfActivatedT-Cells,”Eur.J.Immunol.33:970-979；Workman,C.J.(2005)“NegativeRegulationOfT-CellHomeostasisByLymphocyteActivationGene-3(CD223),”J.Immunol.174:688-695；Hannier,S.等(1998)“CD3/TCRComplex-AssociatedLymphocyteActivationGene-3MoleculesInhibitCD3/TCRSignaling,”J.Immunol.161:4058-4065；Huard,B.等(1994)“Lymphocyte-ActivationGene3/MajorHistocompatibilityComplexClassIIInteractionModulatesTheAntigenicResponseOfCD4+TLymphocytes,”Eur.J.Immunol.24:3216-3221)。研究已经提示，通过抗体封锁抑制LAG-3功能可逆转LAG-3介导的免疫系统抑制和部分恢复效应子功能((Grosso,J.F.等(2009)“FunctionallyDistinctLAG-3andPD-1SubsetsonActivatedandChronicallyStimulatedCD8T-Cells,”J.Immunol.182(11):6659-6669；Grosso,J.F.等(2007)“LAG-3RegulatesCD8+T-CellAccumulationAndEffectorFunctionDuringSelfAndTumorTolerance,”J.Clin.Invest.117:3383-3392)。已经发现，LAG-3经T细胞受体(TCR)-诱导的钙流量(calciumflux)的抑制来负调节T细胞扩展，并控制记忆T细胞库的尺寸(Matsuzaki,J.等(2010)“Tumor-InfiltratingNY-ESO-1-SpecificCD8+T-CellsAreNegativelyRegulatedByLAG-3AndPD-1InHumanOvarianCancer,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)107(17):7875-7880；WorkmanC.J.,etal.(2004)“LymphocyteActivationGene-3(CD223)RegulatesTheSizeOfTheExpandingT-CellPopulationFollowingAntigenActivationinvivo,”J.Immunol.172:5450-5455)。尽管之前的进步，但是仍需要这样的改善的组合物：其能够更有力引导身体的免疫系统攻击癌症细胞或感染病原体的细胞，尤其以更低的治疗性浓度。尽管适应性免疫系统可以是抵抗癌症和疾病的有效防御机制，但是其通常受肿瘤微环境中免疫抑制机制，比如PD-1和LAG-3的表达，的阻碍。肿瘤细胞、免疫细胞和肿瘤环境(tumormilieu)中的基质细胞表达的共抑制分子可显著减弱针对癌症细胞的T-细胞应答。如下面详细描述的，本发明通过提供PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体解决了该需要。这样的双抗体能够结合耗竭性和耐受性肿瘤-浸润淋巴细胞表面上存在的PD-1和LAG-3细胞-表面分子，从而能够消弱这样的细胞-表面分子结合它们的受体配体的能力。这样，本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体用于阻断PD-1和LAG-3介导的免疫系统抑制，从而促进免疫系统的持续激活。该性质允许这样的双特异性双抗体用于治疗癌症和病原体相关的疾病和病况。本发明涉及这样的双抗体和它们应用的方法。附图说明图1显示基本的结构域的图示。图2显示携带Fc的的结构域的图示。图3显示的结构域的图示。图4显示本发明优选的PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体的结构域的图示。四条多肽链——其中两条具有多肽链1和3的结构域并且其中两条具有多肽链2和4的结构域——复合在一起以形成双抗体。二硫键(显示为条纹线(stripedline))共价连接多肽链1和2、多肽链1和3以及多肽链3和4。相同多肽链的可变轻链结构域和可变重链结构域针对不同的表位(PD-1或LAG-3)，使得所得双抗体具有对PD-1免疫特异性的两个表位结合结构域和对LAG-3免疫特异性的两个表位结合结构域。图5显示评估抗PD-1和抗LAG-3抗体增强T-细胞增殖的能力的方案的图。图6显示在allo-MLR试验开始时添加PD-1mAb1(5C4；BMS-936558)、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)和PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)相比IgG1同种型对照抗体诱导强的T-细胞增殖应答。也显示的是用PD-1mAb4(CT-011；CureTech，BAT-1)，抗CTLAmAb和LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)获得的增殖性应答。应答(R)细胞是全(pan)T细胞；刺激(S)细胞是成熟的树突细胞(mDC)。图7显示对LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)单独或组合PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)的T-细胞增殖性潜能的评估的结果。应答(R)细胞是全T细胞；刺激(S)细胞是成熟的树突细胞(mDC)。图8显示可溶性人LAG-3(shLAG-3)——其结合在APC和CD4T-细胞上表达的人HLA-II类分子——相比IgG同种型或应答细胞(R)(全T细胞)加刺激细胞(S)(成熟的树突细胞(mDC)对照孔诱导强的增殖性应答。图9A-9B显示本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体，相比抗PD-1mAb(5C4)或抗LAG-3mAb(25F7)，诱导有效的T-细胞增殖性应答。图9A显示使用本发明优选的PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体(PD-1x和PD-1x)、PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)、可溶性人LAG-3(ShLAG-3)、对照IgG、应答+刺激细胞(全T细胞和成熟的树突细胞；R+S)和刺激细胞(成熟的树突细胞；S)获得的T-细胞增殖性应答。图9B显示使用不同y轴刻度，对于PD-1x和PD-1xPD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)，和PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))+LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)的相同数据。技术实现要素：本发明涉及包括两条或更多条多肽链的双特异性双抗体，其具有对PD-1的表位为免疫特异性的至少一个表位结合位点和对LAG-3的表位为免疫特异性的至少一个表位结合位点(即，“PD-1xLAG-3双特异性双抗体”)。更优选地，本发明涉及包括四条多肽链的双特异性双抗体，其具有对PD-1的一个(或两个)表位为免疫特异性的两个表位结合位点和对LAG-3的一个(或两个)表位为免疫特异性的两个表位结合位点(即，“PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体”)。本发明还涉及另外包括免疫球蛋白Fc结构域的这样的双抗体(“双特异性Fc双抗体”和“双特异性、四价Fc双抗体”)。本发明的双抗体能够同时结合PD-1和LAG-3，尤其是在这样的分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及包含这样的双抗体的药学组合物，并且涉及使用这样的双抗体治疗癌症和其他疾病和病况的方法。详细地，本发明提供能够免疫特异性结合PD-1的表位和结合LAG-3的表位的双特异性Fc双抗体，其中双抗体包括四条多肽链，每条多肽链均具有氨基末端和羧基末端，并且其中：(A)第一和第二多肽链彼此共价结合，第二和第三多肽链彼此共价结合，和第三和第四多肽链彼此共价结合；(B)双抗体的第一和第三多肽链各在N-末端至C-末端方向上包括对PD-1或LAG-3为免疫特异性的抗体的轻链可变结构域、对LAG-3或PD-1为免疫特异性的抗体的重链可变结构域、异源二聚体-促进结构域和CH2-CH3结构域，其中轻链可变结构域和重链可变结构域不能缔合形成能够结合PD-1的表位或LAG-3的表位的表位结合位点；和(C)双抗体的第二和第四多肽链各在N-末端至C-末端方向上包括对PD-1或LAG-3为免疫特异性的抗体的轻链可变结构域、对LAG-3或PD-1为免疫特异性的抗体的重链可变结构域和异源二聚体-促进结构域，其中轻链可变结构域和重链可变结构域不能缔合形成能够结合PD-1的表位或LAG-3的表位的表位结合位点；和其中：(I)(1)第一多肽链的轻链可变结构域和第二多肽链的重链可变结构域缔合以形成第一表位结合位点，和第一多肽链的重链可变结构域和第二多肽链的轻链可变结构域缔合以形成第二表位结合位点；和(2)第三多肽链的轻链可变结构域和第四多肽链的重链可变结构域缔合以形成第三表位结合位点，和第三多肽链的重链可变结构域和第四多肽链的轻链可变结构域缔合以形成第四表位结合位点；其中形成的表位结合位点中的两个能够免疫特异性结合PD-1的表位和形成的表位结合位点中的两个能够免疫特异性结合LAG-3的表位；II.第一和第三多肽链的异源二聚体-促进结构域不同并且具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO:16和SEQIDNO:17；和III.第一和第三多肽链的CH2-CH3结构域缔合形成Fc结构域。本发明还涉及这样的双特异性Fc双抗体的实施方式，其中第一和第三多肽链的CH2-CH3结构域每个具有SEQIDNO:24的氨基酸序列。本发明还涉及这样的双特异性Fc双抗体的实施方式，其中对LAG-3为免疫特异性的抗体的重链可变结构域具有SEQIDNO:11的氨基酸序列，并且其中对LAG-3为免疫特异性的抗体的轻链可变结构域具有SEQIDNO:12的氨基酸序列。本发明还涉及这样的双特异性Fc双抗体的实施方式，其中对PD-1为免疫特异性的抗体的重链可变结构域具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，并且其中对PD-1为免疫特异性的抗体的轻链可变结构域具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明也涉及药学组合物，其包括有效量的任何上述Fc双抗体，和药学上可接受的载体。本发明还涉及这样的药学组合物的实施方式，其中有效量的双特异性Fc双抗体是在需要这种治疗的接受者个体中治疗癌症的有效量。本发明还涉及这样的药学组合物的实施方式，其中癌症是肾上腺癌、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、成纤维细胞性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肿瘤、骨外粘液样软骨瘤、不完全性骨纤维生成、骨纤维发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、末梢神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后眼色素层黑素瘤(posteriousuvealmelanoma)、罕见血液疾病、肾转移性癌、杆状肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症或子宫癌。本发明还涉及这样的药学组合物的实施方式，其中有效量的双特异性Fc双抗体是在需要这种治疗的接受者个体中治疗与病原体的存在相关的疾病的有效量。本发明还涉及这样的药学组合物的实施方式，其中病原体是细菌、真菌或病毒。本发明也涉及治疗癌症的方法，其包括向需要其的个体施用有效量的这样的药学组合物。本发明也涉及治疗与病原体的存在相关的疾病的方法，其包括施用有效量的权利要求8-9任一项所述的药学组合物至需要其的个体。发明详述本发明涉及包括两条或更多条多肽链的双特异性双抗体，其具有对PD-1的表位为免疫特异性的至少一个表位结合位点和对LAG-3的表位为免疫特异性的至少一个表位结合位点(即，“PD-1xLAG-3双特异性双抗体”)。更优选地，本发明涉及包括四条多肽链的双特异性双抗体，其具有对PD-1的一个(或两个)表位为免疫特异性的两个表位结合位点和对LAG-3的一个(或两个)表位为免疫特异性的两个表位结合位点(即，“PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体”)。本发明还涉及另外包括免疫球蛋白Fc结构域的这样的双抗体(“双特异性Fc双抗体”和“双特异性、四价Fc双抗体”)。本发明的双抗体能够同时结合PD-1和结合LAG-3，尤其在这样的分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及包含这样的双抗体的药学组合物，并且涉及使用这样的双抗体治疗癌症和其他疾病和病况的方法。本发明的双特异性双抗体能够同时结合PD-1和结合LAG-3，尤其在这样的分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及包含这样的双抗体的药学组合物，并且涉及使用这样的双抗体治疗癌症和其他疾病和病况的方法。尤其地，本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体包括共价复合在一起的多肽链。如上所讨论，T-细胞激活需要两种不同的信号。通过在抗原呈递细胞(APC)上表达的人白细胞抗原(HLA)背景下已经识别肽抗原的T-细胞表面上表达的T-细胞受体(TCR)提供第一信号。通过在APC上表达的共刺激配体：B7-1和B7-2和在T-细胞上表达的它们相应的受体：CD28和CTLA-4的相关(cognate)对的相互作用提供第二信号。在该受体-配体轴(axis)内，B7-共刺激分子与CD28受体的结合可刺激T-细胞增殖，并随后诱导CD28的负调节子和抗衡受体(抗衡受体)CTLA-4的表达，其强烈竞争B7-1和B7-2配体从而“减慢(winddown)”T-细胞激活和增殖性应答。已经显示结合CD28的激动剂抗体诱导T-细胞效应子功能和增强肿瘤根除免疫的产生，并且在本质上是共刺激性的。相反地，阻断CTLA-4结合的拮抗剂可防止T-细胞摆脱(disengage)它们的效应子功能同时保持可导致自身免疫的持续增殖。与CTLA-4:B7-1/B7-2轴——其用于在正常稳态下和在针对抗原的免疫应答的启动期中激活免疫系统——平行，第二受体-配体轴用于抑制免疫系统，从而在免疫应答的效应期用作CTLA-4的抗衡点(counter-point)。该第二轴涉及在T-细胞的表面上表达的程序性细胞死亡-1蛋白质(PD-1)受体与其分别在抗原呈递细胞(APC)和上皮细胞上表达的相应的配体：PD-L1和PD-L2的结合(ChenL.等(2013)“MolecularMechanismsOfT-CellCo-StimulationAndCo-Inhibition,”NatureReviewsImmunology13(4):227-242)。与结合CD28以刺激T-细胞应答的激动剂抗体相反，结合PD-1或PD-L1对抗或阻断PD-1/PD-L1结合的抗体能够通过防止朝着T-细胞递送负信号而维持T-细胞应答。这增强或维持持T-细胞增殖、细胞毒性和细胞因子分泌。一并考虑，激动剂抗体，比如抗CD28，靶向正信号途径，因此是共刺激物，而拮抗抗体，比如抗PD-1，靶向负信号途径，因此被称为检查点抑制剂。尽管CTLA-4和PD-1代表标准的检查点抑制剂，但存在免疫调节受体-配体对的不断增长的家族。上述淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)是在T-细胞上表达的另外的检查点抑制剂靶，其结合在APC上表达的HLA-II类分子。LAG-3与PD-1在耗竭性和耐受性肿瘤浸润淋巴细胞(“TILs”)上共表达(Matsuzaki,J.等(2010)“Tumor-InfiltratingNY-ESO-1-SpecificCD8+T-CellsAreNegativelyRegulatedbyLAG-3andPD-1inHumanOvarianCancer,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)107(17):7875-7880；Okazaki,T.等(2011)“PD-1andLAG-3inhibitorCoreceptorsActSynergisticallyToPreventAutoimmunityInMice,”J.Exp.Med.208(2):395-407)，并且关于T-调节细胞已经报道了LAG-3表达，暗示在肿瘤免疫学和自身免疫中的作用。动物模型已经表明了抗LAG-3诱导有效的肿瘤根除免疫，其足以减缓肿瘤生长，并且当组合抗PD-1mAb给予时，可甚至触发完全的肿瘤消退(Woo,S.R.等(2012)“ImmuneInhibitoryMoleculesLAG-3AndPD-1SynergisticallyRegulateT-CellFunctionToPromoteTumoralImmuneEscape,”CancerRes.72(4):917-927)。涉及抗LAG-3mAbBMS-986016的组合疗法目前处在单独或组合抗PD-1mAb(nivolumab/BMS-936558)的早期临床研究中(见Creelan,B.C.(2014)“UpdateonImmuneCheckpointInhibitorsinLungCancer,”CancerControl21(1):80-89)。本发明的双特异性双抗体能够结合耗竭性和耐受性肿瘤浸润淋巴细胞的表面上存在的PD-1和LAG-3细胞-表面分子，从而能够损伤这样的细胞-表面分子结合它们的受体配体的能力。这样，本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体能够减弱PD-1和LAG-3介导的免疫系统抑制，并且促进持续的免疫系统激活。一般技术和一般定义本发明的实践，除非另外指出，采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规的技术，其在本领域的技术范围内。在下述文献中充分阐释了这样的技术，比如，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第三版(Sambrook等.Eds.,2001)ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS:METHODSANDAPPLICATIONS(MethodsinMolecularBiology),Herdewijn,P.,Ed.,HumanaPress,Totowa,NJ；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS(Gait,M.J.,Ed.,1984)；METHODSINMOLECULARBIOLOGY,HumanaPress,Totowa,NJ；CELLBIOLOGY:ALABORATORYNOTEBOOK(Cellis,J.E.,Ed.,1998)AcademicPress,NewYork,NY；ANIMALCELLCULTURE(Freshney,R.I.,Ed.,1987)；INTRODUCTIONTOCELLANDTISSUECULTURE(Mather,J.P.andRoberts,P.E.,Eds.,1998)PlenumPress,NewYork,NY；CELLANDTISSUECULTURE:LABORATORYPROCEDURES(Doyle,A.等.,Eds.,1993-8)JohnWileyandSons,Hoboken,NJ；METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.)NewYork,NY；WEIR’SHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY(Herzenberg,L.A.等.Eds.1997)Wiley-BlackwellPublishers,NewYork,NY；GENETRANSFERVECTORSFORMAMMALIANCELLS(Miller,J.M.等.Eds.,1987)ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,F.M.等.,Eds.,1987)GreenePub.Associates,NewYork,NY；PCR:THEPOLYMERASECHAINREACTION,(Mullis,K.等.,Eds.,1994)BostonMA；CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(Coligan,J.E.等.,eds.,1991)JohnWileyandSons,Hoboken,NJ；SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(JohnWileyandSons,1999)Hoboken,NJ；IMMUNOBIOLOGY7(Janeway,C.A.等.2007)GarlandScience,London,UK；Antibodies(P.Finch,1997)StridePublications,Devoran,UK；ANTIBODIES:APRACTICALAPPROACH(D.Catty.,ed.,1989)OxfordUniversityPress,USA,NewYorkNY)；MONOCLONALANTIBODIES:APRACTICALAPPROACH(Shepherd,P.等.Eds.,2000)OxfordUniversityPress,USA,NewYorkNY；USINGANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL(Harlow,E.等.Eds.,1998)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY；THEANTIBODIES(Zanetti,M.等.Eds.1995)HarwoodAcademicPublishers,London,UK)；和DEVITA,HELLMAN,ANDROSENBERG'SCANCER:PRINCIPLES&PRACTICEOFONCOLOGY,EIGHTHEDITION,DeVita,V.等.Eds.2008,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA。如本文所使用，“抗体”是免疫球蛋白分子，其通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点，能够特异性结合靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所使用，该术语不仅仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且也包括其突变体、天然存在的变体、包括具有必要的特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化的抗体和嵌合抗体以及包括具有必要的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的结构(configuration)。天然存在的抗体通常包括两个拷贝的“重”(“H”)多肽链和两个拷贝的“轻”(“L”)多肽链。每条轻链由轻链可变区(“VL”)和轻链恒定区(“CL”)组成，每条重链由重链可变区(“VH”)和重链恒定区组成，所述重链恒定区通常由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。重链多肽的CH2和CH3结构域彼此相互作用，以形成能够结合免疫系统细胞表面上存在的Fc受体的Fc区域。完整的、未修饰的抗体(例如，IgG)结合抗原的表位的能力取决于免疫球蛋白轻链和重链上可变结构域(即，分别为VL和VH结构域)的存在。抗体轻链和抗体重链的相互作用，尤其地，其VL和VH结构域的相互作用形成抗体的一个表位结合位点。相比之下，抗体的“scFv”片段包括包含在单一多肽链中的抗体的VL和VH结构域，其中结构域通过足够长的灵活性接头分开，使得两个结构域自组装成功能性表位结合位点。在VL和VH结构域的自组装由于不足长度的接头(小于约12个氨基酸残基)而不可能的情况下，两个scFv构建物彼此相互作用形成“双抗体”，其是二价分子，其中一条链的VL缔合另一条链的VH(在以下文献中被综述：Marvin等(2005)“RecombinantApproachesToIgG-LikeBispecificAntibodies,ActaPharmacol.Sin.26:649-658)。除了它们在诊断中的已知用途，已经显示抗体可用作治疗剂。过去数十年已经看到对抗体治疗潜能的兴趣的复兴，并且抗体已经成为一类重要的源自生物技术的药物(Chan,C.E.等(2009)“TheUseOfAntibodiesInTheTreatmentOfInfectiousDiseases,”SingaporeMed.J.50(7):663-666)。接近200种基于抗体的药物已经被批准使用或正在开发。术语“单克隆抗体”指同质性(homogenous)抗体群体，其中单克隆抗体由参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体是高度特异性的，针对单抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且也包括其片段(比如Fab、Fab’、F(ab’)2Fv)、单链(scFv)，其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和包括具有必要特异性和结合抗原能力的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰结构。就抗体来源或制备其的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)而言不期望受到限制。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上面根据定义“抗体”描述的片段。制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler,G.等的方法(1975)“ContinuousCulturesOfFusedCellsSecretingAntibodyOfPredefinedSpecificity,”Nature256:495-497或其改良方法。典型地，单克隆抗体在小鼠、大鼠或兔子中开发。通过用包含期望的表位的免疫原量的细胞、细胞提取物或蛋白制品免疫动物而产生抗体。免疫原可以是，但不限于原代细胞、培养的细胞系、癌细胞、蛋白质、肽、核酸或组织。用于免疫的细胞可培养一段时间(例如，至少24小时)，然后它们用作免疫原。细胞可通过它们本身或组合非变性佐剂比如Ribi用作免疫原。一般而言，当用作免疫原时，细胞应保持完整和优选地能存活。相比于破裂的细胞，完整的细胞可允许抗原被免疫的动物更好地检测。变性或烈性佐剂，例如，弗氏佐剂的使用，可使细胞破裂，因此，其应用受阻。免疫原可以周期性间隔被多次施用，诸如两周一次或一周一次，或者可以维持在动物(例如，在组织重组体中)中的生存力这样的方式被施用。可选地，对于期望的致病表位是免疫特异性的现有单克隆抗体和任意其他等价抗体可被测序并通过本领域中已知的任意手段重组产生。在一个实施方式中，对这样的抗体测序，然后将多核苷酸序列克隆至载体用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可在宿主细胞中保持在载体中，并且，可然后扩展开和冷冻宿主细胞用于将来的使用。这样的抗体的多核苷酸序列可用于基因操作，以产生本发明的双特异性分子以及嵌合抗体、人源化的抗体或犬源化(caninized)的抗体，改善抗体的亲和性，或其他特征。人源化抗体的一般原理涉及保留抗体的表位结合的部分的基本序列，同时用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。使单克隆抗体人源化大体上有四个步骤。这些是：(1)测定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列(2)设计人源化的抗体或犬源化的抗体，即，确定在人源化或犬源化过程期间使用哪个抗体框架区(3)实际人源化或犬源化方法/技术和(4)转染和表达人源化的抗体。见，例如，美国专利号4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。天然抗体仅仅能够结合一个表位种类(即，它们是单特异性的)，但是它们可结合该种类的多个拷贝(即，展示二价或多价)。已经开发了各种重组双特异性抗体形式(见，例如，PCT公开号WO2008/003116、WO2009/132876、WO2008/003103，WO2007/146968)，其大部分使用接头肽，以将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至另外的结合蛋白(例如scFv)或将例如两个Fab片段或scFv融合。典型地，这样的方法涉及折中和权衡。例如，PCT公开号WO2013/174873、WO2011/133886和WO2010/136172公开了接头的使用可在治疗情形中引起问题，并且教导了三特异性抗体，其中CL和CH1结构域由它们各自的天然位置被交换以及VL和VH结构域已经被多样化(WO2008/027236、WO2010/108127)，以使得它们结合多于一个抗原。因此，这些文件中公开的分子用结合特异性换取结合另外抗原种类的能力。PCT公开号WO2013/163427和WO2013/119903公开了修饰CH2结构域，以包含包括结合结构域的融合蛋白加合物。文件指出了CH2结构域可能在介导效应子功能中仅起到最小的作用。PCT公开号WO2010/028797、WO2010028796和WO2010/028795公开了重组抗体，其Fc结构域已经用另外的VL和VH结构域取代，以便形成三价结合分子。PCT公开号WO2003/025018和WO2003012069公开了重组双抗体，其单条链包含scFv结构域。PCT公开号WO2013/006544公开多价Fab分子，其作为单条多肽链被合成并且然后进行蛋白酶解以产生异源二聚结构。因此，这些文件中公开的分子用所有或一些介导效应子功能的能力换取结合另外抗原种类的能力。PCT公开号WO2014/022540、WO2013/003652、WO2012/162583、WO2012/156430、WO2011/086091、WO2007/075270、WO1998/002463、WO1992/022583和WO1991/003493公开了添加另外的结合结构域或官能团至抗体或抗体部分(例如，添加双抗体至抗体的轻链，或添加另外的VL和VH结构域至抗体的轻链和重链，或添加异源融合蛋白或彼此连接的多个Fab结构域)。因此，这些文件中公开的分子用天然抗体结构换取结合另外的抗原种类的能力。现有技术已经另外指出了产生双抗体的能力，所述双抗体与天然抗体的不同之处在于能够结合两个或更多个不同表位种类(即，除了二价或多价之外还展示双特异性或多特异性)(见，例如，Holliger等(1993)“Diabodies’:SmallBivalentAndBispecificAntibodyFragments,Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)90:6444-6448；US2004/0058400(Hollinger等)；US2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBSLett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“AFullyHumanRecombinantIgG-LikeBispecificAntibodyToBothTheEpidermalGrowthFactorReceptorAndTheInsulin-LikeGrowthFactorReceptorForEnhancedAntitumorActivity,J.Biol.Chem.280(20):19665-19672、WO02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)“CovalentDisulfide-LinkedAnti-CEADiabodyAllowsSite-SpecificConjugationAndRadiolabelingForTumorTargetingApplications,”ProteinEngDesSel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)“MultimerizationOfAChimericAnti-CD20Single-chainFv-FvFusionProteinIsMediatedThroughVariableDomainExchange,ProteinEngineering14(2):1025-1033；Asano等(2004)“ADiabodyForCancerImmunotherapyAndItsFunctionalEnhancementByFusionOfHumanFcDomain,摘要3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“BispecificT-CellEngagingAntibodiesForCancerTherapy,CancerRes.69(12):4941-4944)。双抗体的设计是基于单链可变区片段(scFv)。这样的分子通过利用短连接肽连接轻链和/或重链可变区而制备。Bird等(1988)(“Single-ChainAntigen-BindingProteins,”Science242:423-426)描述了连接肽的例子，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥跨约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的接头(Bird等(1988)“Single-ChainAntigen-BindingProteins,”Science242:423-426)。接头可进而被修饰用于另外的功能，比如药物的附着或附着至固体载体。可经重组或经合成产生单链变体。对于合成产生scFv，可使用自动合成仪。对于重组产生scFv，包含编码scFv的多核苷酸的适当质粒可被引入适当的宿主细胞——真核细胞比如酵母细胞，植物细胞，昆虫细胞或哺乳细胞，或原核细胞比如大肠埃希氏菌(E.coli)。编码感兴趣scFv的多核苷酸可通过常规的操作比如多核苷酸的连接而制备。所得scFv可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。美国专利号7,585,952和美国专利公开号2010-0173978涉及对ErbB2免疫特异性的scFv分子。已经描述了双特异性T细胞连接子(engager)(“BiTEs”)，其是一类scFv分子(WO05/061547；Baeuerle,P等(2008)“BiTE:ANewClassOfAntibodiesThatRecruitTCells,”DrugsoftheFuture33:137-147；Bargou,等2008)“TumorRegressioninCancerPatientsbyVeryLowDosesofaTCell-EngagingAntibody,”Science321:974-977)。这样的分子由具有两个抗原结合结构域的单个多肽链分子组成，其中一个抗原结合结构域免疫特异性结合CD3表位和其第二个免疫特异性结合靶细胞表面上存在的抗原。非单特异性双抗体的供应提供了明显的优势：共连接和共定位不同表位的能力。二价双抗体因此具有宽的应用范围，包括治疗和免疫诊断。二价允许在各种应用中在设计和工程化双抗体时更大的灵活性，提供对多聚体抗原的增强的抗体亲抗原性，交联不同的抗原，和依赖于两个靶抗原的存在引导靶向特定的细胞类型。由于它们增加的价，低解离速率和从循环的快速清除(对于～50kDa或更低的小尺寸双抗体)，本领域已知的双抗体分子也已经显示在肿瘤成像领域的特定用途(Fitzgerald等(1997)“ImprovedTumourTargetingByDisulphideStabilizedDiabodiesExpressedInPichiapastoris,”ProteinEng.10:1221)。双抗体的二价已经使得它们用于共连接不同的细胞，例如，将细胞毒性T-细胞交联至肿瘤细胞(Staerz等(1985)“HybridAntibodiesCanTargetSitesForAttackByTCells,Nature314:628-631；和Holliger等(1996)“SpecificKillingOfLymphomaCellsByCytotoxicT-CellsMediatedByABispecificDiabody,ProteinEng.9:299-305)。因此，例如，双抗体表位结合结构域可被引导至任何免疫效应细胞比如CD3、CD16、CD32或CD64的表面决定子，所述免疫效应细胞在T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞或其他单核细胞上表达。在许多研究中，也发现结合效应细胞决定子，例如Fcγ受体(FcγR)，的双抗体激活效应细胞(Holliger等(1996)“SpecificKillingOfLymphomaCellsByCytotoxicT-CellsMediatedByABispecificDiabody,ProteinEng.9:299-305；Holliger等(1999)“CarcinoembryonicAntigen(CEA)-SpecificT-cellActivationInColonCarcinomaInducedByAnti-CD3xAnti-CEABispecificDiabodiesAndB7xAnti-CEABispecificFusionProteins,CancerRes.59:2909-2916；WO2006/113665、WO2008/157379、WO2010/080538、WO2012/018687、WO2012/162068)。通常，通过经Fc-FcγR相互作用使结合抗原的抗体结合效应细胞触发效应细胞激活；因此，在这方面，双抗体分子可展示Ig样功能，不依赖于它们是否包括Fc结构域(例如，如在本领域已知的或本文列举的任何效应子功能试验(例如，ADCC试验)中所检验的)。通过交联肿瘤和效应细胞，双抗体不仅仅使效应细胞接近肿瘤细胞，而且使得有效的肿瘤杀伤(见例如，Cao等(2003)“BispecificAntibodyConjugatesInTherapeutics,Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。但是，上述优势需要显著的成本。形成这样的非单特异性的双抗体需要成功组装两个或更多个有区别的和不同的多肽(即，这样的形成需要通过不同多肽链种类的异源二聚化形成双抗体)。该事实与单特异性的双抗体相反，其通过相同多肽链的同源二聚化形成。因为必须提供至少两个不同的多肽(即，两个多肽种类)，以便形成非单特异性的双抗体，并且，因为这类多肽的同源二聚化导致无活性分子(Takemura,S.等(2000)“ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588)，因此，产生这样的多肽必须以防止相同种类的多肽之间的共价结合的方式完成(Takemura,S.等(2000)“ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588)。因此，现有技术教导了这类多肽的非共价缔合(见，例如，Olafsen等(2004)“CovalentDisulfide-LinkedAnti-CEADiabodyAllowsSite-SpecificConjugationAndRadiolabelingForTumorTargetingApplications,Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“ADiabodyForCancerImmunotherapyAndItsFunctionalEnhancementByFusionOfHumanFcDomain,摘要3P-683；J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)“AFullyHumanRecombinantIgG-LikeBispecificAntibodyToBothTheEpidermalGrowthFactorReceptorAndTheInsulin-LikeGrowthFactorReceptorForEnhancedAntitumorActivity,J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。但是，现有技术已经认识到由非共价缔合的多肽组成的双特异性双抗体不稳定并且容易解离成非功能单体(见，例如，Lu,D.等(2005)“AFullyHumanRecombinantIgG-LikeBispecificAntibodyToBothTheEpidermalGrowthFactorReceptorAndTheInsulin-LikeGrowthFactorReceptorForEnhancedAntitumorActivity,J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。面对该挑战，现有技术已经成功开发了稳定、共价结合的异源二聚非单特异性的双抗体，称为(见，例如，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP2714079、EP2601216、EP2376109、EP2158221；和PCT公开号WO2012/162068、WO2012/018687、WO2010/080538；和Moore,P.A.等(2011)“ApplicationOfDualAffinityRetargetingMoleculesToAchieveOptimalRedirectedT-CellKillingOfB-CellLymphoma,Blood117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“TherapeuticControlOfBCellActivationViaRecruitmentOfFcgammaReceptorIIb(CD32B)InhibitoryFunctionWithANovelBispecificAntibodyScaffold,”ArthritisRheum.62(7):1933-1943；Johnson,S.等(2010)“EffectorCellRecruitmentWithNovelFv-BasedDual-AffinityRe-TargetingProteinLeadsToPotentTumorCytolysisAndinvivoB-CellDepletion,J.Mol.Biol.399(3):436-449)。这类双抗体包括两个或更多个共价复合的多肽，并且涉及将一个或多个半胱氨酸残基工程化至每个采用的多肽种类中。例如，添加半胱氨酸残基至这类构建物的c-末端已经显示允许多肽链之间的二硫键合，稳定所得异源二聚体而不干扰二价分子的结合特征。最简单的两个多肽的每一个均包括三个结构域(图1)。第一多肽包括：(i)结构域，其包括第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包括第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，和(iii)第三结构域，其用于促进与第二多肽的异源二聚化以及用于共价结合双抗体的第一多肽与第二多肽。第二多肽包含互补的第一结构域(VL2结构域)、互补的第二结构域(VH1结构域)和第三结构域，所述第三结构域与第一多肽链的第三结构域复合，以便促进与第一多肽链的异源二聚化和共价键合。这类分子是稳定、有效的并且能够同时结合两个或更多个抗原。在一个实施方式中，第一和第二多肽的第三结构域每个包含半胱氨酸残基，其用于将多肽经二硫键结合在一起。多肽之一或两者的第三结构域可另外具有CH2-CH3结构域的序列，以便双抗体多肽的复合形成Fc结构域，其能够结合细胞(比如B淋巴细胞、树突细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜伊红粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)的Fc受体(图2)。已经描述了这类分子的许多变型(见，例如，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP2714079、EP2601216、EP2376109、EP2158221；和PCT公开号WO2012/162068、WO2012/018687、WO2010/080538)。这些具有Fc的可包括三条多肽链。这类双抗体的第一多肽包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域，(ii)包含VH2的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。这类的第二多肽包含：(i)包含VL2的结构域，(ii)包含VH1的结构域和(iii)促进与双抗体的第一多肽链的异源二聚化以及共价键合的结构域。这类的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，这类的第一和第二多肽链复合在一起以形成能够结合表位的VL1/VH1结合位点，以及能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点。第一和第二多肽通过涉及它们各自的第三结构域中的半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。注意，第一和第三多肽链彼此复合，形成经二硫键稳定的Fc结构域。这类双抗体具有增强的效力。这类具有Fc的可具有两个取向之一(表1)：也已经描述了甚至更复杂的称为(图3)(WO2012/018687)。具有四条多肽链。这类双抗体的第一和第三多肽链包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域，(ii)包含VH2的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。的第二和第四多肽包含：(i)包含VL2的结构域，(ii)包含VH1的结构域和(iii)促进与Fc-DARTTM的第一多肽链的异源二聚化和共价键合的结构域。第三和第四多肽链的VL和/或VH结构域，和第一和第二多肽链的VL和/或VH结构域可以相同或不同，以便允许是特异性的、双特异性的或四特异性的四价结合(表2)。遍及本申请，抗体轻链和重链的氨基酸残基的编号是根据如在Kabat等(1992)SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST,NationalInstitutesofHealthPublication(国立卫生研究院)No.91-3242中的EU索引。术语“多肽”和“肽”在本文可互换使用，指任何长度，尤其是长度大于3、5、10、15、20或25个氨基酸残基，的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或支链的，其可包括修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。该术语也包括天然修饰的或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，比如缀合标签组分。还包括在该定义中的是，例如，包含一个或多个氨基酸的类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。本发明的多肽可作为单链或复合的链存在。上面已经描述了术语“双抗体”和“DARTTM”。是一类双抗体，其包括至少两条多肽链，所述多肽链优选地通过共价相互作用彼此复合，以形成至少两个表位结合位点，其可识别相同的或不同的表位。双抗体或DARTTM的多肽链中的两条各包括免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，但是这些区域不相互作用形成表位结合位点(即，它们不是相互“互补的”)。相反，双抗体或DARTTM多肽链中的一条(例如，第一)多肽链的免疫球蛋白重链可变区与不同的(例如，第二)双抗体或DARTTM多肽链的免疫球蛋白轻链可变区相互作用，以形成表位结合位点。类似地，双抗体或DARTTM多肽链中的一条(例如，第一)多肽链的免疫球蛋白轻链可变区与不同的(例如，第二)双抗体或DARTTM多肽链的免疫球蛋白重链可变区相互作用，以形成表位结合位点。DARTTM分子公开在以下文献中：美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP2714079、EP2601216、EP2376109、EP2158221；和PCT公开号WO2012/162068、WO2012/018687、WO2010/080538、WO2006/113665、WO2008/157379；和Moore,P.A.等(2011)“ApplicationOfDualAffinityRetargetingMoleculesToAchieveOptimalRedirectedT-CellKillingOfB-CellLymphoma,Blood117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“TherapeuticControlOfBCellActivationViaRecruitmentOfFcgammaReceptorIIb(CD32B)InhibitoryFunctionWithANovelBispecificAntibodyScaffold,”ArthritisRheum.62(7):1933-1943；和Johnson,S.等(2010)“EffectorCellRecruitmentWithNovelFv-BasedDual-AffinityRe-TargetingProteinLeadsToPotentTumorCytolysisAndinvivoB-CellDepletion,J.Mol.Biol.399(3):436-449。如本文所使用，术语“缔合(association)”或“缔合(associating)”，就多肽(例如，一个双抗体多肽缔合至另一双抗体多肽、免疫球蛋白轻链缔合至免疫球蛋白重链、一个CH2-CH3结构域缔合至另一CH2-CH3结构域等)而言，旨在表示多肽的非共价结合。术语”复合(complexes)”或“复合(complexing)”旨在表示多肽的共价结合。如本文所使用，如果它们的表位结合结构域能够同时结合它们各自识别的表位，则本发明的双抗体被视为介导“协同结合(coordinatedbinding)”。这样的结合可以是同时的。本发明的双抗体的表位结合结构域以“免疫特异性”方式结合它们识别的表位。如本文所使用，如果其相对于可选的表位，与该表位更频繁、更快速地以更久的持续时间和/或以更大的亲和力反应或缔合，则认为抗体、双抗体或其他表位结合分子“免疫特异性”结合另一分子的区域(即，表位)。例如，免疫特异性结合病毒表位的抗体是这样的抗体：与其免疫特异性结合其他病毒表位或非病毒表位相比，所述抗体以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或以更持久的时间结合该病毒表位。通过阅读该定义，还应理解，例如，免疫特异性结合第一靶的抗体(或部分或表位)可能或可能不特异性或优先结合第二靶。因此，“特异性结合”不一定要求(尽管其可包括)排他性结合。一般而言，但是不一定，提及结合则意味着”特异性”结合。这类分子的各种免疫球蛋白结构域可源自任何同种型或同种异型的免疫球蛋白，包括但不限于IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在优选的实施方式中，如下面所讨论，这类免疫球蛋白源自IgG免疫球蛋白。在具体的实施方式中，使用的IgG同种型是IgG1，但是可采用其他同种型的IgG(例如，IgG2、IgG3或IgG4或其同种异型)。II.本发明优选的PD-1xLAG-3双特异性双抗体本发明涉及PD-1xLAG-3双特异性双抗体。本发明优选的PD-1xLAG-3双特异性双抗体具有抗体的表位结合片段，使得它们能够协同结合两个不同表位：PD-1的表位和LAG-3的表位，以便减弱这类分子的抑制活性。如本文所使用，这类减弱指可检测的PD-1和或LAG-3抑制活性降低至少20％、降低至少50％、降低至少80％或降低至少90％，或可检测的PD-1和或LAG-3抑制活性全部消除。A.抗PD-1结合能力对于PD-1免疫特异性的抗体是已知的(见，例如，美国专利号8,008,449、8,552,154；PCT专利公开WO2012/135408、WO2012/145549和WO2013/014668)。可通过分离使用PD-1或其肽片段产生的分泌抗体的杂交瘤制备另外期望的抗体。人PD-1(包括20个氨基酸残基信号序列(以下划线显示)和268个氨基酸残基的成熟蛋白质)具有氨基酸序列(SEQIDNO:1)：优选的抗PD-1抗体包括：PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)、PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)和PD-1mAb4(CT-011；CureTech，BAT-1)。PD-1mAb1的重链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:2)(CDR加下划线显示)：PD-1mAb1的轻链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:3)(CDR加下划线显示)：PD-1mAb2的重链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:4)(CDR加下划线显示)：PD-1mAb2的轻链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:5)(CDR加下划线显示)：PD-1mAb3的重链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:6)(CDR加下划线显示)：PD-1mAb3的轻链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:7)(CDR加下划线显示)：PD-1mAb4的重链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:8)(CDR加下划线显示)：PD-1mAb4的轻链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:9)(CDR加下划线显示)：B.抗LAG-3结合能力对LAG-3免疫特异性的抗体也是已知的(见，例如，WO2014/008218)。可通过分离使用LAG-3或其肽片段产生的分泌抗体的杂交瘤制备另外期望的抗体。人LAG-3(包括28个氨基酸残基信号序列(加下划线显示)和497个氨基酸残基的成熟蛋白质)具有氨基酸序列(SEQIDNO:10)：优选的抗LAG-3抗体是LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)。LAG-3mAb1的重链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:11)(CDR加下划线显示)：LAG-3mAb1的轻链可变结构域的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQIDNO:12)(CDR加下划线显示)：如本文所使用，术语“抗体的表位结合片段”意思是能够免疫特异性结合表位的抗体片段。表位结合片段可包含这样的抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR结构域，并且尽管能够免疫特异性结合这样的表位，但可展示针对与这样的抗体的表位不同的这样的表位的免疫特异性、亲和性或选择性。但是，优选地，表位结合片段包含这样的抗体的所有6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可以是单多肽链(例如，scFv)，或可包括两条或更多条多肽链，每条具有氨基末端和羧基末端(例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)。C.本发明优选的双抗体1.一般考虑本发明优选的双抗体是双特异性、四价、双抗体(图3)，其由总共四条多肽链组成。四条多肽链包括两个包含CH2-CH3-的多肽(即，双抗体的“第一”和“第三”多肽链)，其复合在一起，以形成Fc结构域，和两个相同的非包含CH3-的多肽(即，双抗体的“第二”和“第四”多肽链)，其每个与双抗体的包含CH2-CH3-的多肽复合，以形成对PD-1或LAG-3是免疫特异性的表位结合结构域。因此，例如，第一多肽链包含抗PD-1(或抗LAG-3)可变轻链(VL)结构域和抗LAG-3(或抗PD-1)可变重链(VH)结构域，并且与具有互补的抗PD-1(或抗LAG-3)VH结构域和互补的抗LAG-3(或抗PD-1)VL结构域的第二多肽链复合，以便形成第一对的PD-1和LAG-3表位结合结构域。同样地，第三多肽链包含抗PD-1(或抗LAG-3)可变轻链(VL)结构域和抗LAG-3(或抗PD-1)可变重链(VH)结构域，并且与具有互补的抗PD-1(或抗LAG-3)VH结构域和互补的抗LAG-3(或抗PD-1)VL结构域的第四多肽链复合，以便形成第二对的PD-1和LAG-3表位结合结构域。因为相同多肽的可变轻链结构域和可变重链结构域涉及不同的表位，它们不能复合在一起以形成能够结合PD-1或LAG-3的表位结合结构域。第一多肽的可变轻链结构域和可变重链结构域优选地通过足够短的间插接头肽被彼此分开，以基本上防止这些结构域的复合。示例性接头具有序列(SEQIDNO:13：GGGSGGGG。可选地可采用具有类似长度的其他接头(以便防止相同多肽链的VL和VH结构域彼此相互作用)。如图4中所显示，本发明最优选的双特异性、四价、双抗体是已经被修饰以包含异源二聚体-促进结构域的双抗体。包括这样的结构域促进双抗体的多肽链之间的异源二聚体形成。包括这样的结构域不是必要的，并且本发明包括不具有这样的结构域的PD-1xLAG-3双特异性双抗体。优选的异源二聚体-促进结构域包括“E-螺旋”结构域(SEQIDNO:14)：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK，和“K-螺旋”结构域(SEQIDNO:15)：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE。更具体而言，期望复合在一起的一对多肽链均被工程化，以包含一个(或多个)这样的异源二聚体-促进结构域，其中采用的一条多肽链的结构域(一个或多个)与采用的另一多肽链的结构域(一个或多个)互补(例如，一条多肽链包含E-螺旋结构域而另一条包含K-螺旋结构域)。当两条多肽链被工程化以包含大于一个这样的异源二聚体-促进结构域时，它们可带相同的电荷，或更优选地带相反的电荷。尤其优选的是这样的异源二聚体-促进结构域：其包括上述E-螺旋和K-螺旋序列的修饰，以便包括一个或多个半胱氨酸残基。这样的半胱氨酸残基的存在允许一条多肽链上存在的螺旋共价结合另一多肽链上存在的互补螺旋，从而使多肽链彼此共价结合并且增加双抗体的稳定性。这样的尤其优选的例子是这样的异源二聚体-促进结构域：其包括具有氨基酸序列(SEQIDNO:16)：EVAACEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK的修饰的E-螺旋，其中SEQIDNO:14的亮氨酸残基已经被半胱氨酸残基(加下划线显示)替换，和具有氨基酸序列(SEQIDNO:17)：KVAACKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE的修饰的K-螺旋，其中SEQIDNO:15的亮氨酸残基已经被半胱氨酸残基(加下划线显示)替换。第一多肽的可变重链结构域和该多肽的异源二聚体-促进结构域优选地通过包含1、2、3或更多个半胱氨酸残基的间插接头肽彼此分开。优选的包含半胱氨酸的间隔肽具有序列SEQIDNO:18：GGCGGG。可采用具有类似长度的其他接头(以便包括可共价结合另一多肽链的半胱氨酸残基的半胱氨酸残基)。优选地，采用的异源二聚体-促进结构域和第一多肽链的CH2-CH3结构域通过为异源二聚体-促进结构域提供改善的稳定性的包含半胱氨酸的间插接头肽彼此分开。合适的包含半胱氨酸的接头肽具有氨基酸序列(SEQIDNO:19)：DKTHTCPPCP，但是，更优选的接头具有氨基酸序列(SEQIDNO:20):LEPKSADKTHTCPPC。可选地，可以采用具有类似长度的其他接头(以便包括可共价结合另一多肽链的半胱氨酸残基的半胱氨酸残基)。野生型CH2-CH3结构域的氨基酸序列如下(如在Kabat等(1992)SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST,NationalInstitutesofHealthPublicationNo.91-3242的EU索引中定位)(SEQIDNO:21)：对于三特异性或四特异性的双抗体(即，对于第一和第三多肽链不同的双抗体)，期望减少或防止两个第一多肽链的CH2-CH3结构域之间或两个第三多肽链的CH2-CH3结构域之间发生同源二聚化。为了促进第一和第三多肽链之间的异源二聚化，优选地修饰这些链的CH2-CH3结构域，以便促进这样的异源二聚化。例如，氨基酸取代(优选用包括形成“杵(knob)”的大侧基的氨基酸例如色氨酸进行取代)可被引入第一多肽链的CH2或CH3结构域，以便空间干扰将防止与类似的突变结构域的相互作用并将迫使突变的结构域与其中互补或适应性突变已经被工程化的结构域——即，“臼(hole)”——配对(例如，用甘氨酸取代)。这样的突变组可被工程化到任何多肽对中，包括双抗体分子，并且进一步地，可被工程化到所述多肽链链对的任何部分中。相对于同源二聚化偏爱异源二聚化的蛋白质工程化的方法在本领域中是悉知的，尤其是关于工程化免疫球蛋白样分子，这些都包括在本文中(见例如，美国专利号7,695,936和专利公开2007/0196363；Ridgway等(1996)“’Knobs-Into-Holes’EngineeringOfAntibodyCH3DomainsForHeavyChainHeterodimerization,”ProteinEngr.9:617-621；Atwell等(1997)“StableHeterodimersFromRemodelingTheDomainInterfaceOfAHomodimerUsingAPhageDisplayLibrary,”J.Mol.Biol.270:26-35；和Xie等(2005)“ANewFormatOfBispecificAntibody:HighlyEfficientHeterodimerization，ExpressionAndTumorCellLysis,”J.Immunol.Methods296:95-101，其每一篇通过引用以其整体并入本文。通过修饰天然的IgGFc结构域以包含修饰T366W产生优选的杵。通过修饰天然的IgGFc结构域以包含修饰T366S、L368A和Y407V产生优选的臼。为了帮助纯化本发明的双抗体，包含臼突变的多肽链另外包括在435位的取代(H435R)，以去除蛋白A结合位点。因此，包含臼突变的多肽的同源二聚体不结合蛋白A，而由于包含异源二聚体的杵和臼形成的双抗体经包含杵突变的多肽链上的蛋白A结合位点保持其结合蛋白A的能力。本发明也包括包含变异的Fc结构域的分子，所述变异的Fc结构域相对于可比较的野生型Fc结构域包括一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。包括变异的Fc结构域的分子相对于包括野生型Fc结构域的分子通常具有改变的表型。变异的表型可表现为改变的血清半衰期、改变的稳定性、改变的对细胞酶的易感性或改变的效应子功能，如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性试验中分析的。鉴定为改变效应子功能的Fc结构域修饰是本领域已知的，包括增加对激活受体的结合(例如，FcγRIIA(CD16A)和减少对抑制受体的结合(例如，FcγRIIB(CD32B)的修饰(见，例如，Stavenhagen,J.B.等(2007)“FcOptimizationOfTherapeuticAntibodiesEnhancesTheirAbilityToKillTumorCellsInVitroAndControlsTumorExpansionInVivoViaLow-AffinityActivatingFcgammaReceptors,”CancerRes.57(18):8882-8890)。具有对CD32B降低的结合和/或对CD16A增加的结合的人IgG1Fc结构域的示例性变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可以任何组合存在于人IgG1Fc结构域。在一个实施方式中，人IgG1Fc结构域变体包含F243L、R929P和Y300L取代。在另一实施方式中，人IgG1Fc结构域变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一实施方式中，人IgG1Fc结构域变体包含N297Q取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因为这些突变消除了FcR结合。这样的分子的第一多肽链的CH2-CH3结构域具有“携带杵的”序列(SEQIDNO:22)：或具有H435R取代的“携带臼的”序列，以消除蛋白A结合(SEQIDNO:23)：如所认识到，“携带臼的”CH2-CH3结构域(例如，SEQIDNO:22)可在第一多肽链中采用，在该情况下，“携带杵的”CH2-CH3结构域(例如，SEQIDNO:22)将用在第三多肽链中。对于本发明的第一和第三多肽链并非不同的双特异性、四价双抗体，优选的CH2-CH3结构域是修饰的CH2-CH3结构域，其具有氨基酸序列(SEQIDNO:24)：因此，总之，本发明优选的PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体双抗体优选的第一和第三多肽链具有一致的序列，并且这样优选的PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体的第二和第四多肽链具有一致的序列，如表3中显示：2.第一示例性PD-1xLAG-3双特异性双抗体(PD-1xLAG-3)本发明的第一尤其优选的PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体(“PD-1xLAG-3”)的第一和第三多肽链具有一致的序列。这样的第一/第三多肽链具有氨基酸序列(SEQIDNO:25)：其中，氨基酸残基1-107是LAG-3mAb1的轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:12)，氨基酸残基108-115是接头GGGSGGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:13)，氨基酸残基116-228是PD-1mAb1的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:2)，氨基酸残基229-234是包含半胱氨酸的间隔肽GGCGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:18)，氨基酸残基235-262是修饰的E-螺旋的氨基酸残基(SEQIDNO:16)，氨基酸残基263-277是包含半胱氨酸的接头肽LEPKSADKTHTCPPC的氨基酸残基(SEQIDNO:20)和氨基酸残基278-494是修饰的CH2-CH3结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:24)。编码这样的第一/第三多肽链的核酸分子是(SEQIDNO:26)：这样的PD-1xLAG-3的第二和第四多肽链具有一致的序列。这样的第二/第四多肽链具有氨基酸序列(SEQIDNO:27)：其中，氨基酸残基1-107是PD-1mAb1的轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:3)，氨基酸残基108-115是接头GGGSGGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:13)，氨基酸残基116-235是LAG-3mAb1的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:11)，氨基酸残基236-241是包含半胱氨酸的间隔肽GGCGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:18)，和氨基酸残基242-269是修饰的K-螺旋的氨基酸残基(SEQIDNO:17)。编码这样的第二/第四多肽链的核酸分子是(SEQIDNO:28)：3.第二示例性PD-1xLAG-3双特异性双抗体(PD-1xLAG-3)本发明的第二尤其优选的PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体(PD-1xLAG-3)的第一和第三多肽链具有一致的序列。这样的第一/第三多肽链具有氨基酸序列(SEQIDNO:29)：其中，氨基酸残基1-107是PD-1mAb1的轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:3)，氨基酸残基108-115是接头GGGSGGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:13)，氨基酸残基116-235是LAG-3mAb1的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:11)，氨基酸残基236-241是包含半胱氨酸的间隔肽GGCGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:18)，氨基酸残基242-269是修饰的E-螺旋的氨基酸残基(SEQIDNO:16)，氨基酸残基270-284是包含半胱氨酸的接头肽LEPKSADKTHTCPPC的氨基酸残基(SEQIDNO:20)和氨基酸残基285-501是修饰的CH2-CH3结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:24)。编码这样的第一/第三多肽链的核酸分子是(SEQIDNO:30)：PD-1xLAG-3的第二和第四多肽链具有一致的序列。这样的第二/第四多肽链具有氨基酸序列(SEQIDNO:31)：其中，氨基酸残基1-107是LAG-1mAb1的轻链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:12)，氨基酸残基108-115是接头GGGSGGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:13)，氨基酸残基116-228是PD-1mAb1的重链可变结构域的氨基酸残基(SEQIDNO:2)，氨基酸残基229-234是包含半胱氨酸的间隔肽GGCGGG的氨基酸残基(SEQIDNO:18)，和氨基酸残基235-262是修饰的K-螺旋的氨基酸残基(SEQIDNO:17)。编码这样的第二/第四多肽链的核酸分子是(SEQIDNO:32)：III.药学组合物本发明包括治疗癌症或与病原体的存在相关的疾病的药学组合物。这样的组合物包括用于制造药学组合物的散装药物组合物(例如，不纯的或非无菌组合物)和药学组合物(即，适于向受试者或患者施用组合物)，其可用于制备单位剂量形式。这样的组合物包括本发明的预防或治疗有效量的修饰的PD-1xLAG-3双特异性双抗体，(和尤其地，本发明的PD-1xLAG-3双特异性、四价双抗体)和药学上可接受的载体。优选地，本发明的组合物包括预防或治疗有效量的本发明的一种或多种分子和药学上可接受的载体。本发明也包括这样的药学组合物：其包括这样的修饰的双抗体和对具体的病原体相关的抗原特异的第二治疗性抗体，以及药学上可接受的载体。如本文所使用，术语“癌症”指特征在于存在恶性肿瘤的疾病。这样的癌症包括肾上腺癌、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、成纤维细胞性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肿瘤、骨外粘液样软骨瘤、不完全性骨纤维生成、骨纤维发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病，脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、末梢神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后眼色素层黑素瘤、罕见血液疾病、肾转移性癌、杆状肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌症或子宫癌。如本文所使用，术语“与病原体的存在相关的疾病”指与由下述病原体导致的感染相关的疾病：细菌(例如，大肠埃希氏菌、艰难梭菌(C.difficile)、伤寒沙门氏菌(Salmonellathyphimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)、流感嗜血杆菌(Hemophilusinfluenzae)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和肺炎链球菌等(Streptococcuspneumonia))，真菌(例如，念珠菌属(Candida)、曲霉菌属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、球孢子菌属(Coccidioides)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺孢菌属(Pneumocystis)、葡萄穗霉菌属(Stachybotrys)等)、原生动物(变形虫类(Amoebozoa)、古虫类(Excavata)、囊泡藻类(Chromalveolata)、内变形虫类(Entamoeba)、疟原虫属(Plasmodium)、贾第虫(Giardia)、锥体虫属(Trypanosoma)、球虫亚纲(Coccidia)、贝诺属(Besnoitia)、岐腔属(Dicrocoelium)、利什曼虫属(Leishmania)等)或病毒(尤其是腺病毒、腺伴随病毒、B病毒(恒河猴疱疹病毒I型(macacineherpesvirusI))、BK病毒、布尼亚病毒、切昆贡亚(chikungunya)病毒、柯萨奇(cocksackie)病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、东部马脑炎(easternequineencephalitis)病毒、埃博拉病毒、肠道病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、汉坦病毒(hantavirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒，单纯性疱疹病毒1型、单纯性疱疹病毒2型、人泡沫病毒(humanfoamyvirus)、人疱疹病毒3型、人疱疹病毒5型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人β-嗜淋巴细胞病毒、人T细胞白血病病毒I型、人T细胞白血病病毒II型、流感病毒、JC病毒、JEV、卡波西氏肉瘤相关的疱疹病毒、拉沙病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒(Nipahvirus)、诺如病毒(norovirus)、诺瓦克(Norwalk)病毒、正呼肠孤病毒(orthoreovirus)、副流感病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒、呼肠病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、裂谷热病毒、轮状病毒、风疹病毒、天花病毒、圣路易脑炎病毒、重型天花病毒(variolamajorvirus)、卡菲尔痘病毒(variolaminorvirus)、水痘-疱疹病毒(vericella-zostervirus)、西尼罗病毒、西部马脑炎病毒或黄热病病毒)。如本文所使用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”表示获得有益的或期望的结果的途径，所述有益的或期望的结果包括并且优选地是有益的或期望的临床结果。这样的有益的或期望的临床结果包括但不限于下述的一个或多个：减少(或破坏)受感染细胞或其他患病的细胞的增殖、减轻由于疾病产生的症状，提高遭受疾病的那些的生活质量、减少治疗疾病需要的其他药物的剂量、延迟疾病的进展，和/或延长陪伴(companion)动物接受者的生存。在具体的实施方式中，术语“药学上可接受的”表示被联邦或国家政府的管理机构批准，或列举在美国药典中或其他通常认可的用于动物，尤其是人的药典中。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全的和不完全的)、赋形剂或利用其施用治疗剂的媒介。这样的药学载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成起源的那些，比如花生油、大豆油、矿物质油、芝麻油等。当静脉内施用药学组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和丙三醇溶液可也可用作液体载体，尤其用于可注射的溶液。适当的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望，组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可为下述形式：溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等。一般而言，分别或以单位剂型混合在一起来提供本发明组合物的成分，例如，在密封容器比如指示活性剂的量的安瓿或袋(sachette)中作为干燥冻干粉末或无水浓缩物。在组合物通过输注施用的情况下，其可用包含无菌药学级的水或盐水的输注瓶进行分配。在通过注射施用组合物的情况下，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水，从而可混合成分然后施用。本发明的组合物可配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于用阴离子形成的那些，比如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和用阳离子形成的那些，比如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。本发明也提供了药学包装或试剂盒，其包括一个或多个包含本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体——单独的或与这样的药学上可接受的载体一起——的容器。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂可也包括在药学包装或试剂盒中。本发明也提供了药学包装或试剂盒，其包括填充本发明的药学组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。任选地与这样的容器(一个或多个)结合的可以是监管药物制剂或生物制品的制造、使用或售卖的政府管理局规定的形式的公告(notice)，该公告反映管理局对用于人施用的制造、使用或售卖的批准。本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包括本发明的一种或多种分子。在另一实施方式中，试剂盒进一步在一个或多个容器中包括一种或多种其他预防剂或治疗剂，所述剂可用于治疗特征在于存在病原体相关的抗原的癌症或疾病。在另一实施方式中，试剂盒进一步包括结合一个或多个病原体相关的抗原的一种或多种抗体或双抗体。在某些实施方式中，其他预防剂或治疗剂是化疗剂。在其他实施方式中，预防剂或治疗剂是生物或激素治疗剂。IV.产生本发明PD-1xLAG-3双特异性双抗体的方法最优选地通过重组表达编码这样的多肽的核酸分子产生本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体，这是本领域熟知的。本发明的多肽可方便地使用固相肽合成制备(Merrifield,B.(1986)“SolidPhaseSynthesis,Science232(4748):341-347；Houghten,R.A.(1985)“GeneralMethodForTheRapidSolid-PhaseSynthesisOfLargeNumbersOfPeptides:SpecificityOfAntigen-AntibodyInteractionAtTheLevelOfIndividualAminoAcids,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-5135；Ganesan,A.(2006)“Solid-PhaseSynthesisInTheTwenty-FirstCentury，MiniRev.Med.Chem.6(1):3-10)。可选地，可使用本领域已知的任何方法重组制备和表达抗体。可如下重组制备抗体：首先分离从宿主动物制备的抗体、获得基因序列和使用基因序列在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组表达抗体。可采用的另一方法是在植物(例如，烟草)或转基因奶中表达抗体序列。已经公开了在植物或奶中重组表达抗体的合适的方法(见，例如，Peeters等(2001)“ProductionOfAntibodiesAndAntibodyFragmentsInPlants,Vaccine19:2756；Lonberg,N.等(1995)“HumanAntibodiesFromTransgenicMice,Int.Rev.Immunol13:65-93；和Pollock等(1999)“TransgenicMilkAsAMethodForTheProductionOfRecombinantAntibodies,J.ImmunolMethods231:147-157)。制备抗体衍生物，例如，嵌合的、人源化的，单链的等的适当的方法是本领域已知的。在另一可选方案中，抗体可通过噬菌体展示技术重组制备(见，例如，美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter,G.等(1994)“MakingAntibodiesByPhageDisplayTechnology,Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。可通过Edman降解法对感兴趣的抗体或蛋白质测序，所述Edman降解法对于本领域技术人员是熟知的。由质谱或Edman降解法产生的肽信息可用于设计探针或引物，其被用于克隆感兴趣的蛋白质。克隆感兴趣的蛋白质的可选的方法是通过使用纯化蛋白质或其部分“淘洗”表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞。“淘洗”程序可如下进行：从在第二细胞类型中表达或过表达期望的cDNA的组织或细胞获得cDNA文库，和筛选特异性结合期望蛋白质的第二细胞类型的转染的细胞。用于通过“淘洗”克隆编码细胞-表面蛋白质的哺乳动物基因的方法的详细描述可见于现有技术(见，例如，Aruffo,A.等(1987)“MolecularCloningOfACD28cDNAByAHigh-EfficiencyCOSCellExpressionSystem,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:8573-8577；和Stephan,J.等(1999)“SelectiveCloningOfCellSurfaceProteinsInvolvedInOrganDevelopment:EpithelialGlycoproteinIsInvolvedInNormalEpithelialDifferentiation,Endocrinol.140:5841-5854)。可根据现有技术的标准方法通过从具体的细胞类型逆转录mRNA获得编码抗体和其他肽激动剂、拮抗剂和调谐剂的cDNA。具体而言，可使用各种裂解酶或化学溶液根据上文Sambrook等阐释的程序分离mRNA，或通过商业上可得的核酸-结合树脂根据制造商提供的伴随说明书提取mRNA(例如，Qiagen,Invitrogen,Promega)。然后将合成的cDNA引入表达载体，以在第二类型细胞中产生感兴趣的抗体或蛋白质。暗示表达载体在宿主细胞中必须是可复制的——作为游离体(episome)或作为染色体DNA的不可缺少的部分。适当的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和黏粒。包含感兴趣的多核苷酸的载体可通过许多适当的方式中的任意方式被引入宿主细胞，所述适当方式包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质进行转染；微弹轰击(microprojectilebombardment)；脂转染；和感染(例如，在载体是感染剂比如牛痘病毒的情况下)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。任何能够过表达异源DNA的宿主细胞均可用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。适当的哺乳动物宿主细胞的非限制性例子包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。优选地，相比于宿主细胞中相应的感兴趣的内源抗体或蛋白质(如果存在)，宿主细胞以高约5倍，更优选地高10倍，更优选地高20倍、更优选地高50倍或更优选地高100倍的水平表达cDNA。优选地通过免疫试验或FACS实现对特异性结合期望的蛋白质的宿主细胞的筛选。由此可鉴定过表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞。各种技术也是可用的，其现在可用以产生突变肽激动剂、拮抗剂和调谐剂，其相对于亲代肽激动剂、拮抗剂或调谐剂分子编码所得蛋白质的氨基酸序列中的添加、缺失或改变。本发明包括对本发明PD-1xLAG-3双特异性双抗体的修饰和具有增强的或降低的活性的变体，所述修饰不显著影响它们的特性。多肽的修饰是现有技术的常规实践。修饰的多肽的例子包括具有氨基酸残基的保守取代的多肽，不显著不利改变功能活性的氨基酸的一个或多个缺失或添加，或使用化学类似物。可彼此保守取代的氨基酸残基包括但不限于：甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，比如例如用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化。优选地，氨基酸取代是保守的，即，取代的氨基酸应具备与原始氨基酸类似的化学特性。这样的保守取代是本领域已知的，并且上面已经提供了例子。氨基酸修饰的范围可从改变或修饰一个或多个氨基酸到区域，比如可变区的完全重新设计(redesign)。可变区的改变可改变结合亲和力和/或特异性。修饰的其他方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶促方式、氧化取代和螯合作用。修饰可用于，例如，连接用于免疫试验的标签，比如连接用于放射免疫分析的放射性部分。使用现有技术确立的程序制备修饰的多肽并且可使用本领域已知的标准试验筛选。本发明也包括融合蛋白，其包括来自本发明多肽和抗体的一个或多个片段或区域。在一个实施方式中，提供融合多肽，其包括可变轻链区的至少10个连续氨基酸和可变重链区的至少10个氨基酸。在另一实施方式中，融合多肽包含异源免疫球蛋白恒定区。在另一实施方式中，融合多肽包含由公共保藏的杂交瘤产生的抗体的轻链可变区和重链可变区。为了本发明的目的，抗体融合蛋白包含一个或多个多肽结构域和在天然分子中未连接的另一氨基酸序列，例如，来自另一区域的异源序列或同源的序列，所述多肽结构域特异性结合期望的病毒表位或期望的免疫效应细胞的激活受体或表达这样的激活受体的免疫效应细胞表面上存在的蛋白质。本发明包括多肽，其包括本发明抗体的氨基酸序列。本发明的多肽可通过本领域已知的程序制备。可如下产生多肽：抗体的蛋白酶解或其他降解、如上述的重组方法(即，单个或融合多肽)或化学合成。抗体的多肽，尤其多达约50个氨基酸的短多肽，便利地通过化学合成制备。化学合成的方法是本领域已知的并且是商业上可得的。例如，这样的多肽可通过采用固相方法的自动多肽合成仪产生。V.本发明的组合物的用途本发明包括组合物，包括药学组合物，所述药学组合物包括本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体、源自这样的分子的多肽、包括编码这样的分子或多肽的多核苷酸序列，和如本文所描述的其他试剂。因为本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体具有减弱由PD-1和LAG-3介导的免疫系统的抑制的能力，所以本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体可用于治疗与非期望的受抑制的免疫系统相关的任何疾病或病况，包括与病原体(例如，细菌、真菌、病毒或原生动物感染)的存在相关的癌症和疾病。VI.施用方法通过向受试者施用有效量的本发明的药学组合物，本发明的组合物可被提供用于治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一个或多个症状。在优选的方面中，这样的组合物基本上是纯化的(即，基本上不含限制其作用或产生非期望的副作用的物质)。在具体的实施方式中，受试者是动物，优选哺乳动物比如非灵长类(例如，牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴比如，食蟹猴(cynomolgusmonkey)、人等)。在优选的实施方式中，受试者是人。各种各种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的组合物，例如，封装在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(见，例如，Wu等(1987)“Receptor-MediatedInVitroGeneTransformationByASolubleDNACarrierSystem,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)，作为逆转录病毒或其他载体一部分的核酸的构建物等。施用本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在具体的实施方式中，肌内、静脉内或皮下施用本发明的分子。可通过任何方便的途径施用组合物，例如，通过输注或丸剂注射，通过经上皮或黏膜皮肤被覆(lining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可也采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有气雾化试剂的制剂。见，例如，美国专利号6,019,968、5,985，320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903，其每一篇通过引用以其整体并入本文。本发明也使得本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体可包装在密封容器比如指示这样的分子的量的安瓿或袋中。在一个实施方式中，本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体被供应作为密封容器中的干燥灭菌冻干粉末或无水浓缩物并且可，例如，用水或盐水重构至适当的浓度用于施用至受试者。优选地，本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体被供应作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末，单位剂量为至少5μg，更优选地至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg或至少200μg。本发明的冻干PD-1xLAG-3双特异性双抗体应在它们的原始容器中在2和8℃之间储存并且分子应在重构之后的12小时内，优选地6小时内，5小时内，3小时内，或1小时内施用。在可选的实施方式中，本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体以液体形式供应在指示分子、融合蛋白或缀合分子的量和浓度的密封容器中。优选地，液体形式的本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体被供应在密封容器中，其中分子存在的浓度为至少1μg/ml，更优选地至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml或至少100μg/ml。如本文所使用，在一个实施方式中，“有效量”的药学组合物是足够实现有益的或期望的结果的量，包括但不限于临床结果比如减轻由于疾病造成的症状、减轻感染的症状(例如，病毒量、发烧、疼痛，脓毒症等)或癌症的症状(例如，癌细胞的增殖、肿瘤存在、肿瘤转移等)，从而提高遭受疾病的那些的生活质量、减少治疗疾病需要的其他药物的剂量、加强另一药物的作用——比如经靶向和/或内化、延迟疾病的进展和/或延长个体的生存。有效量可在一次或多次施用中施用。为了本发明的目的，有效量的药物、化合物或药学组合物是这样的量：所述量足够直接或间接减少病毒存在的增殖(或作用)和减轻和/或延迟病毒疾病的发展。在一些实施方式中，有效量的药物、化合物或药学组合物可能或不能实现结合另一药物、化合物或药学组合物。因此，“有效量”可在施用一种或多种化疗剂的背景下考虑，并且如果结合一种或多种其他试剂，期望的结果可以或得以实现，则单个试剂可视为以有效量给予。尽管个体需要不同，测定每种组分的有效量的最佳范围仍在现有技术的范围内。对于抗体施用，典型的剂量包括在0.1-至100mg/kg/体重之间的一个或多个单位剂量。有效治疗、预防或改善与病症相关的一个或多个症状的本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体的量可通过标准临床技术来测定。制剂中采用的精确剂量也取决于施用的途径和病况的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况决定。有效的剂量可从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线外推。对于本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体，施用至患者的剂量通常为按受试者的体重计至少约0.01μg/kg、至少约0.05μg/kg、至少约0.1μg/kg、至少约0.2μg/kg、至少约0.5μg/kg、至少约1μg/kg、至少约2μg/kg、至少约5μg/kg、至少约10μg/kg、至少约20μg/kg、至少约50μg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约30mg/kg、至少约50mg/kg、至少约75mg/kg、至少约100mg/kg、至少约125mg/kg、至少约150mg/kg或更多。在另一实施方式中，患者施用的治疗方案包括一个或多个剂量的这样的预防或治疗有效量的本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体，其中治疗方案在2天内、3天内、4天内、5天内、6天内或7天内施用。在某些实施方式中，治疗方案包括间歇地施用预防或治疗有效量的本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体的剂量(例如，在给定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用剂量并且在相同周的第5天、第6天和第7天不施用预防或治疗有效量的本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体的剂量)。典型地，有1、2、3、4、5或更多个治疗疗程。每个疗程可以是相同的方案或不同的方案。在另一实施方式中，施用的剂量在方案(一个或多个)的前四分之一、前二分之一或前三分之二或四分之三(例如，在4个治疗疗程的第一、第二、或第三方案内)内逐渐上升直到实现每日预防或治疗有效量的本发明包括的PD-1xLAG-3双特异性双抗体。在一个实施方式中，可计算施用至患者的本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体的剂量，用作单一试剂疗法。在另一实施方式中，本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体结合其他治疗性组合物使用，并且施用至患者的剂量比这样的双抗体用作单一试剂疗法时更低。在具体的实施方式中，可期望局部施用本发明的药学组合物至需要治疗的区域；这可通过，但不限于例如如下方式实现：局部输注、通过注射、或通过植入体，所述植入体是多孔的、非多孔的、或胶状材料，包括膜，比如硅橡胶膜(sialastic)或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须注意使用不吸收该分子的材料。在另一实施方式中，组合物可在小泡，尤其是脂质体中递送(见Langer(1990)“NewMethodsOfDrugDelivery,”Science249:1527-1533)；Treat等，在LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer(传染病和癌症疗法中的脂质体)中，Lopez-Berestein和Fidler(eds.),Liss,NewYork,353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327页；一般见上)。在又另一实施方式中，组合物可在控释或缓释系统中递送。本领域技术人员已知的任何技术均可用于产生包括本发明的一个或多个分子的缓释制剂。见，例如，美国专利号4,526,938；PCT公开WO91/05548、PCT公开WO96/20698；Ning等(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustained-ReleaseGel,”Radiotherapy&Oncology39:179-189；Song等(1995)“AntibodyMediatedLungTargetingOfLong-CirculatingEmulsions,”PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372-397；Cleek等(1997)“BiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplication,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“MicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDelivery,”Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，其各通过引用以其整体并入本文。在一个实施方式中，泵可用于控释系统中(见Langer，同上；Sefton,(1987)“ImplantablePumps,”CRCCrit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term,ContinuousIntravenousHeparinAdministrationByAnImplantableInfusionPumpInAmbulatoryPatientsWithRecurrentVenousThrombosis,”Surgery88:507-516；和Saudek等(1989)“APreliminaryTrialOfTheProgrammableImplantableMedicationSystemForInsulinDelivery,”N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一实施方式中，聚合物材料可用于实现抗体的控释(见例如，MedicalApplicationsofControlledRelease,LangerandWise(eds.),CRCPres.,BocaRaton,Florida(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,SmolenandBall(eds.),WileyNewYork(1984)；Levy等(1985)“InhibitionOfCalcificationOfBioprostheticHeartValvesByLocalControlled-ReleaseDiphosphonate,”Science228:190-192；During等(1989)“ControlledReleaseOfDopamineFromAPolymericBrainImplant:InVivoCharacterization,”Ann.Neurol.25:351-356；Howard等(1989)“IntracerebralDrugDeliveryInRatsWithLesion-InducedMemoryDeficits,”J.Neurosurg.7(1):105-112)；美国专利号5,679,377、美国专利号5,916,597、美国专利号5,912,015、美国专利号5,989,463、美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO99/20253)。在缓释制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinylacetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯基醇)、聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚交酯-乙交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯(polyorthoeste)。在又另一实施方式中，控释系统可放置在治疗性靶(例如，肺)附近，因此仅仅需要全身剂量的一部分(见，例如，Goodson,在MedicalApplicationsofControlledRelease中，同上，vol.2,pp.115-138(1984))。在另一实施方式中，根据Dunn等使用用作控释移植物的聚合组合物(见美国5,945,155)。该具体的方法基于来自聚合物系统的生物活性材料的原位-控释的疗效。植入可一般发生在患者需要治疗性治疗的身体内的任何地方。在另一实施方式中，使用非聚合物持续递送系统，由此受试者身体中的非聚合物植入物被用作药物递送系统。当植入身体时，植入物的有机溶剂将从组合物消散，分散或渗漏到周围组织流体中，并且非聚合材料逐渐凝聚或沉淀形成固体、多微孔基质(见美国5,888,533)。Langer的综述(1990,“NewMethodsOfDrugDelivery,”Science249:1527-1533)讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术均可用于产生包括本发明的一种或多种治疗剂的缓释制剂。见，例如，美国专利号4,526,938；国际公开号WO91/05548和WO96/20698；Ning等(1996)““IntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustained-ReleaseGel,”Radiotherapy&Oncology39:179-189；Song等(1995)“AntibodyMediatedLungTargetingOfLong-CirculatingEmulsions,”PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372-397；Cleek等(1997)“BiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplication,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“MicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDelivery,”Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，其每一篇通过引用以其整体并入本文。在其中本发明的组合物是编码本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体的一条或多条多肽链的核酸的具体实施方式中，通过将其构建为适当的核酸表达载体的一部分并且施用其从而其变成是细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹道技术(Biolistic)，Dupont)，或用脂质或细胞-表面受体或转染试剂涂覆，或通过将其连接至已知进入核的同源框样肽施用(见例如，Joliot等(1991)“AntennapediaHomeoboxPeptideRegulatesNeuralMorphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等，核酸可被体内施用以促进其编码的双抗体的表达。可选地，可以将核酸引入细胞内并通过同源重组整合到宿主细胞DNA中，以进行表达。用治疗或预防有效量的本发明的PD-1xLAG-3双特异性双抗体治疗受试者可包括单一治疗或，优选地，可包括一系列治疗。在优选的实施例中，受试者用本发明的分子每周治疗一次，持续约1至10周，优选地2至8周，更优选地约3至7周，甚至更优选地持续约4、5或6周。在其他实施方式中，每天一次、每天两次或每天三次施用本发明的药学组合物。在其他实施方式中，每周一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每年两次或每年一次施用药学组合物。也认识到用于治疗的分子的有效剂量可在具体的治疗疗程内增加或降低。现已经大体上描述了本发明，通过参考下述实施例其更容易理解。这样的实施例通过示例的方式提供，并且不旨在限制本发明，除非另外指出。实施例1PD-1xLAG-3双特异性双抗体的产生和特性在allo-MLR试验的背景下，响应HLA-错配(Latchman,Y.E.等(2004)“PD-L1-DeficientMiceShowThatPD-L1OnT-Cells,Antigen-PresentingCells,AndHostTissuesNegativelyRegulatesT-Cells.”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)101(29):10691-10696；Wang,W.等(2008)“PD-L1/PD-1SignalDeficiencyPromotesAllogeneicImmuneResponsesAndAcceleratesHeartAllograftRejection,”Transplantation86(6):836-44)或促有丝分裂/药理学刺激，诱导T-细胞增殖。已知靶向共刺激分子的激动剂抗体通过加强T-细胞信号传导和稳定促进或驱使T-细胞效应子功能的转录因子，诱导增殖性应答(Melero,I.等(2013)“AgonistAntibodiestoTNFRMoleculesThatCostimulateTandNKCells,”Clin.CancerRes.19(5):1044-1053)。类似地，靶向负调节T-细胞应答的关键检查点分子的拮抗剂抗体可通过保持T-细胞信号传导和效应子功能诱导增殖性应答，从而提高抗肿瘤免疫(Capece,D.等(2012)“TargetingCostimulatoryMoleculestoImproveAntitumorImmunity,”J.Biomed.Biotech.2012:926321)。在掺入3H-胸苷之后，可在短期混合淋巴细胞(allo-MLR)反应中容易地测量针对共刺激或检查点靶的单克隆抗体响应同种异体抗原对增殖的作用。为了解决针对检查点抑制剂的抗体增强增殖的能力，产生基准抗PD-1或抗LAG-3mAbs，将其纯化，并且在allo-MLR试验开始时，以20、10、5、2.5和1.25μg/ml外源添加(图5)。在5-6天结束时，用3H-胸苷脉冲平铺的96孔并且培养18hrs，以测量增殖。评估评估针对人PD-1、LAG-3和CTLA-4的数个基准抗体响应同种异体抗原刺激而增强T-细胞增殖的能力。如图6中显示，在allo-MLR试验开始时添加PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)或PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)，相比IgG1同种型对照抗体或包含响应物和刺激物的对照孔诱导强的T-细胞增殖。单独包含辐射的刺激细胞的孔表明没有增殖。尽管观察到剂量依赖性增殖性应答，但PD-1mAb4(CT-011；CureTech，BAT-1)相比PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)或PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)显示最小增殖。也用LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)观察到轻微的剂量依赖性增殖性应答，其与伊匹单抗(ipilimumab)——一种抗CTLA-4mAb(BristolMyers-Squib)——类似地相当。PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)与LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)同时被给予与任一抗体被单独给予相比在动物模型中引起有效的抗肿瘤免疫的显著效力(Woo,S.R.等(2012)“ImmuneInhibitoryMoleculesLAG-3AndPD-1SynergisticallyRegulateT-CellFunctionToPromoteTumoralImmuneEscape,”CancerRes.72(4):917-927)表明以组合给予的基准mAb可比任一单独的抗体更大地加强同种(allo)-诱导的T-细胞增殖。如图7中显示，评估抗LAG-3mAb(25F7)单独或组合抗PD-1mAbs(PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)或PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab))的增生性潜能。如先前观察到的，两种抗PD-1mAbs均以剂量依赖性方式诱导有效的增殖。相反，与任一抗PD-1mAb一起提供抗LAG-3mAb不诱导超过单独用抗PD-1mAbs观察到的增强的增殖。单独的抗LAG-3mAb相比同种型IgG1对照或应答物加刺激物对照孔仅仅展示轻微的T-细胞增殖。抗LAG-3mAb——单独或以组合——不能诱导超过用抗PD-1mAb观察到的增殖表明在allo-MLR试验期间T-细胞上不存在LAG-3表达或抗LAG-3mAb不结合LAG-3以阻断负信号级联。为了分析诱导LAG-3信号转导的潜能，将可溶性人LAG-3蛋白质(“shLAG-3”)添加至allo-MLR，并且与抗LAG-3mAb和/或抗PD-1mAb比较。如图8中显示，结合APC和CD4T-细胞上表达的人HLA-II类分子的可溶性人LAG-3相比IgG同种型或应答物加刺激物对照孔诱导有力的增殖性应答。LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)的加入似乎不阻碍可溶性人LAG-3蛋白质的增生性作用并且可具有轻微的增强的T-细胞增殖，因为观察到轻微的剂量依赖性增殖性应答。与之前的观察一致，抗PD-1mAb诱导有效的T-细胞增殖，其通过添加可溶性人LAG-3蛋白质和/或LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)被进一步增强。添加同种型IgG1对照至抗PD-1抗体不使T-细胞增殖增强超过单独用PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)观察到的。可溶性LAG-3甚至在存在抗LAG-3mAbs的情况下诱导有效T-细胞增殖的能力不清楚。一种可能性是抗LAG-3mAb简单地不能阻断可溶性LAG-3mAb诱导的强的增殖性号。一种可选方式——但不一定是非互相排斥的可能性—是可溶性人LAG-3蛋白质与抗LAG-3一起形成免疫交联复合物，其可进一步加强增殖性应答。可溶性LAG-3加强T-细胞增殖的能力提示在allo-MLR试验中将抗PD-1和抗LAG-3mAb接近引入可能增强T-细胞增殖性应答。为了解决该可能性，以两个取向在双亲和性重靶向-双特异性形式中构建基准抗PD-1和抗LAG-3mAb：LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)–PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)双特异性、四价双抗体(PD-1xLAG-3)和PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)–LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)双特异性、四价双抗体(PD-1xLAG-3)。在allo-MLR开始时外源添加两种形式(以上述剂量-依赖性方式)，并且评估它们的T-细胞增殖性潜能。如图9A-9B中所显示，两种-双抗体均诱导比用PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)和/或LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)获得T-细胞增殖性应答的令人吃惊地更有效的T-细胞增殖性应答。可溶性人LAG-3(“shLAG-3”)在allo-MLR试验中再次显示强的T-细胞增殖。通过和可溶性人LAG-3蛋白质诱导的强的增殖性信号使单独的抗PD-1mAb或抗LAG-3mAb的贡献最小化。尽管抗PD-1和LAG-3mAb都以剂量依赖性方式诱导超过用IgG1同种型对照或应答物加刺激物孔单独观察到的T-细胞增殖，但抗PD-1与抗LAG-3的组合显示比任一单独抗体增强的增殖，表明——如之前在文献中报道的——已经表明功能协同作用(Wang,W.等(2008)“PD-L1/PD-1SignalDeficiencyPromotesAllogeneicImmuneResponsesAndAcceleratesHeartAllograftRejection,”Transplantation86(6):836-44；Melero,I.等(2013)“AgonistAntibodiestoTNFRMoleculesThatCostimulateTandNKCells,”Clin.CancerRes.19(5):1044-1053；Capece,D.等(2012)“TargetingCostimulatoryMoleculestoImproveAntitumorImmunity,”J.Biomed.Biotech.2012:926321)。本说明书提到的所有出版物和专利通过参考并入本文，如同好像具体和单独指出每个单个出版物或专利申请通过参考以其整体并入的程度。尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是应当理解，其能够被进一步更改，并且本申请旨在覆盖大体上遵循本发明原理的本发明的任何变型、用途或改变，所述变型、用途或改变包括与本公开的这种偏离，只要其在本发明所属领域的已知或常规实施范围内和只要其可应用于上文阐释的本质特征。序列表<110>宏观基因股份有限公司E·波维尼L·S·约翰逊P·A·摩尔K·沙哈R·拉莫特-莫斯<120>与PD-1和LAG-3具有免疫反应性的共价结合的双抗体和其使用方法<130>1301.0115PCT<150>62/017,467<151>2014-06-26<160>32<170>PatentIn3.5版本<210>1<211>288<212>PRT<213>智人<220><221>misc<222>(1)..(288)<223>人PD-1，包括信号序列<400>1MetGlnIleProGlnAlaProTrpProValValTrpAlaValLeuGln151015LeuGlyTrpArgProGlyTrpPheLeuAspSerProAspArgProTrp202530AsnProProThrPheSerProAlaLeuLeuValValThrGluGlyAsp354045AsnAlaThrPheThrCysSerPheSerAsnThrSerGluSerPheVal505560LeuAsnTrpTyrArgMetSerProSerAsnGlnThrAspLysLeuAla65707580AlaPheProGluAspArgSerGlnProGlyGlnAspCysArgPheArg859095ValThrGlnLeuProAsnGlyArgAspPheHisMetSerValValArg100105110AlaArgArgAsnAspSerGlyThrTyrLeuCysGlyAlaIleSerLeu115120125AlaProLysAlaGlnIleLysGluSerLeuArgAlaGluLeuArgVal130135140ThrGluArgArgAlaGluValProThrAlaHisProSerProSerPro145150155160ArgProAlaGlyGlnPheGlnThrLeuValValGlyValValGlyGly165170175LeuLeuGlySerLeuValLeuLeuValTrpValLeuAlaValIleCys180185190SerArgAlaAlaArgGlyThrIleGlyAlaArgArgThrGlyGlnPro195200205LeuLysGluAspProSerAlaValProValPheSerValAspTyrGly210215220GluLeuAspPheGlnTrpArgGluLysThrProGluProProValPro225230235240CysValProGluGlnThrGluTyrAlaThrIleValPheProSerGly245250255MetGlyThrSerSerProAlaArgArgGlySerAlaAspGlyProArg260265270SerAlaGlnProLeuArgProGluAspGlyHisCysSerTrpProLeu275280285<210>2<211>113<212>PRT<213>智人<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(113)<223>抗-PD-1抗体mAb1重链可变区<400>2GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuAspCysLysAlaSerGlyIleThrPheSerAsnSer202530GlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleTrpTyrAspGlySerLysArgTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuPhe65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrAsnAspAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSer100105110Ser<210>3<211>107<212>PRT<213>智人<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(107)<223>抗-PD-1抗体mAb1轻链可变区<400>3GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnSerSerAsnTrpProArg859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105<210>4<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗-PD-1抗体mAb2重链可变区<400>4GlnValGlnLeuValGlnSerGlyValGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530TyrMetTyrTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleAsnProSerAsnGlyGlyThrAsnPheAsnGluLysPhe505560LysAsnArgValThrLeuThrThrAspSerSerThrThrThrAlaTyr65707580MetGluLeuLysSerLeuGlnPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgArgAspTyrArgPheAspMetGlyPheAspTyrTrpGlyGln100105110GlyThrThrValThrValSerSer115120<210>5<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗-PD-1抗体mAb2轻链可变区<400>5GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerLysGlyValSerThrSer202530GlyTyrSerTyrLeuHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaPro354045ArgLeuLeuIleTyrLeuAlaSerTyrLeuGluSerGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer65707580SerLeuGluProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisSerArg859095AspLeuProLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105110<210>6<211>121<212>PRT<213>小家鼠<400>6GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaLysProGlyAla151015SerValGlnMetSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPheThrSerSer202530TrpIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTyrIleTyrProSerThrGlyPheThrGluTyrAsnGlnLysPhe505560LysAspLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgTrpArgAspSerSerGlyTyrHisAlaMetAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrSerValThrValSerSer115120<210>7<211>111<212>PRT<213>小家鼠<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(111)<223>抗-PD-1抗体mAb3轻链可变区<400>7AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuThrValSerLeuGly151015GlnArgAlaThrIleSerCysArgAlaSerGlnSerValSerThrSer202530GlyTyrSerTyrMetHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleLysPheGlySerAsnLeuGluSerGlyIleProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuAsnIleHis65707580ProValGluGluGluAspThrAlaThrTyrTyrCysGlnHisSerTrp859095GluIleProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105110<210>8<211>117<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗-PD-1抗体mAb4重链可变区<400>8GlnValGlnLeuValGlnSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAla151015SerValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGlnTrpMet354045GlyTrpIleAsnThrAspSerGlyGluSerThrTyrAlaGluGluPhe505560LysGlyArgPheValPheSerLeuAspThrSerValAsnThrAlaTyr65707580LeuGlnIleThrSerLeuThrAlaGluAspThrGlyMetTyrPheCys859095ValArgValGlyTyrAspAlaLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSer115<210>9<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗-PD-1抗体mAb4轻链可变区<400>9GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysSerAlaArgSerSerValSerTyrMet202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIleTyr354045ArgThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrSerTyrCysLeuThrIleAsnSerLeuGlnProGlu65707580AspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerSerPheProLeuThr859095PheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>10<211>525<212>PRT<213>智人<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(525)<223>人LAG3(CD223)蛋白质，包括信号序列<400>10MetTrpGluAlaGlnPheLeuGlyLeuLeuPheLeuGlnProLeuTrp151015ValAlaProValLysProLeuGlnProGlyAlaGluValProValVal202530TrpAlaGlnGluGlyAlaProAlaGlnLeuProCysSerProThrIle354045ProLeuGlnAspLeuSerLeuLeuArgArgAlaGlyValThrTrpGln505560HisGlnProAspSerGlyProProAlaAlaAlaProGlyHisProLeu65707580AlaProGlyProHisProAlaAlaProSerSerTrpGlyProArgPro859095ArgArgTyrThrValLeuSerValGlyProGlyGlyLeuArgSerGly100105110ArgLeuProLeuGlnProArgValGlnLeuAspGluArgGlyArgGln115120125ArgGlyAspPheSerLeuTrpLeuArgProAlaArgArgAlaAspAla130135140GlyGluTyrArgAlaAlaValHisLeuArgAspArgAlaLeuSerCys145150155160ArgLeuArgLeuArgLeuGlyGlnAlaSerMetThrAlaSerProPro165170175GlySerLeuArgAlaSerAspTrpValIleLeuAsnCysSerPheSer180185190ArgProAspArgProAlaSerValHisTrpPheArgAsnArgGlyGln195200205GlyArgValProValArgGluSerProHisHisHisLeuAlaGluSer210215220PheLeuPheLeuProGlnValSerProMetAspSerGlyProTrpGly225230235240CysIleLeuThrTyrArgAspGlyPheAsnValSerIleMetTyrAsn245250255LeuThrValLeuGlyLeuGluProProThrProLeuThrValTyrAla260265270GlyAlaGlySerArgValGlyLeuProCysArgLeuProAlaGlyVal275280285GlyThrArgSerPheLeuThrAlaLysTrpThrProProGlyGlyGly290295300ProAspLeuLeuValThrGlyAspAsnGlyAspPheThrLeuArgLeu305310315320GluAspValSerGlnAlaGlnAlaGlyThrTyrThrCysHisIleHis325330335LeuGlnGluGlnGlnLeuAsnAlaThrValThrLeuAlaIleIleThr340345350ValThrProLysSerPheGlySerProGlySerLeuGlyLysLeuLeu355360365CysGluValThrProValSerGlyGlnGluArgPheValTrpSerSer370375380LeuAspThrProSerGlnArgSerPheSerGlyProTrpLeuGluAla385390395400GlnGluAlaGlnLeuLeuSerGlnProTrpGlnCysGlnLeuTyrGln405410415GlyGluArgLeuLeuGlyAlaAlaValTyrPheThrGluLeuSerSer420425430ProGlyAlaGlnArgSerGlyArgAlaProGlyAlaLeuProAlaGly435440445HisLeuLeuLeuPheLeuIleLeuGlyValLeuSerLeuLeuLeuLeu450455460ValThrGlyAlaPheGlyPheHisLeuTrpArgArgGlnTrpArgPro465470475480ArgArgPheSerAlaLeuGluGlnGlyIleHisProProGlnAlaGln485490495SerLysIleGluGluLeuGluGlnGluProGluProGluProGluPro500505510GluProGluProGluProGluProGluProGluGlnLeu515520525<210>11<211>120<212>PRT<213>智人<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(120)<223>抗-LAG-3抗体mAb1重链可变区<400>11GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerAspTyr202530TyrTrpAsnTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAsnHisAsnGlyAsnThrAsnSerAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrLeuSerLeuAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuArgSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095PheGlyTyrSerAspTyrGluTyrAsnTrpPheAspProTrpGlyGln100105110GlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>12<211>107<212>PRT<213>智人<220><221>MOD_RES<222>(1)..(107)<223>抗-LAG-3抗体mAb1轻链可变区<400>12GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnArgSerAsnTrpProLeu859095ThrPheGlyGlnGlyThrAsnLeuGluIleLys100105<210>13<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>接头1<400>13GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly15<210>14<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>E-螺旋异源二聚体促进结构域<400>14GluValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGluVal151015AlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLys2025<210>15<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>K-螺旋异源二聚体促进结构域<400>15LysValAlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLysVal151015AlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGlu2025<210>16<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>包含半胱氨酸的E-螺旋异源二聚体促进结构域<400>16GluValAlaAlaCysGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGluVal151015AlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLys2025<210>17<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>包含半胱氨酸的K-螺旋异源二聚体促进结构域<400>17LysValAlaAlaCysLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLysVal151015AlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGlu2025<210>18<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>包含半胱氨酸的间隔肽<400>18GlyGlyCysGlyGlyGly15<210>19<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>包含半胱氨酸的接头肽<400>19AspLysThrHisThrCysProProCysPro1510<210>20<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>可选的包含半胱氨酸的接头肽<400>20LeuGluProLysSerAlaAspLysThrHisThrCysProProCys151015<210>21<211>218<212>PRT<213>智人<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(218)<223>IgG1Fc区<400>21ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys210215<210>22<211>218<212>PRT<213>人工序列<220><223>"携带杵的"IgG1CH2-CH3结构域<400>22ProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys210215<210>23<211>218<212>PRT<213>人工序列<220><223>"携带臼的"IgG1CH2-CH3结构域<400>23ProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuValSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnArgTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys210215<210>24<211>217<212>PRT<213>人工序列<220><223>IgG1Fc区L234A/L235A变体<400>24ProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuTyrIleThrArgGluProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGly210215<210>25<211>494<212>PRT<213>人工序列<220><223>示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1双抗体的第一和第三多肽链<400>25GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnArgSerAsnTrpProLeu859095ThrPheGlyGlnGlyThrAsnLeuGluIleLysGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlyGlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGln115120125ProGlyArgSerLeuArgLeuAspCysLysAlaSerGlyIleThrPhe130135140SerAsnSerGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeu145150155160GluTrpValAlaValIleTrpTyrAspGlySerLysArgTyrTyrAla165170175AspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsn180185190ThrLeuPheLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVal195200205TyrTyrCysAlaThrAsnAspAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuVal210215220ThrValSerSerGlyGlyCysGlyGlyGlyGluValAlaAlaCysGlu225230235240LysGluValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGlu245250255ValAlaAlaLeuGluLysLeuGluProLysSerAlaAspLysThrHis260265270ThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerVal275280285PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuTyrIleThrArgGlu290295300ProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu305310315320ValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys325330335ThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSer340345350ValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys355360365CysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIle370375380SerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro385390395400ProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu405410415ValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsn420425430GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer435440445AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg450455460TrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu465470475480HisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGly485490<210>26<211>1482<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1双抗体的第一和第三多肽链的多核苷酸<400>26gaaattgtcctgacacagtctcccgcaaccctgagtttgagtcctggggagcgagcaact60ctctcctgccgagcctcccagagtatctcctcctacctcgcctggtaccaacagaagcca120gggcaggctccaaggctgcttatctatgacgcctctaaccgcgcaactgggattcccgca180cgcttctccggctctggttccggcacagactttacacttactatctctagcctggagcca240gaagactttgccgtgtactattgtcagcaacgttccaattggccccttacctttgggcag300ggcactaacttggaaatcaaaggtggcggatccggcggcggaggccaggttcagctggtc360gagagtggtggcggcgttgtgcaacctgggcgttccctccgattggactgtaaagcttcc420ggcattactttctcaaattccggcatgcattgggtgaggcaagcccctggaaaagggctc480gaatgggtggctgtgatttggtacgatggcagcaaacggtactacgccgattctgttaag540ggccgctttaccatctcccgcgataactcaaagaacacactgtttctgcaaatgaatagt600cttagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgccacaaatgacgattattgggggcag660ggcacattggtcacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcatgtgag720aaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctg780gagaaactggagcccaaatctgctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacct840gaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctctat900atcacccgggagcctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag960gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgg1020gaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggac1080tggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatc1140gagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc1200ccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc1260tatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaag1320accacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtg1380gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg1440cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt1482<210>27<211>269<212>PRT<213>人工序列<220><223>示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1双抗体的第二和第四多肽链<400>27GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnSerSerAsnTrpProArg859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlyGlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLys115120125ProSerGluThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPhe130135140SerAspTyrTyrTrpAsnTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeu145150155160GluTrpIleGlyGluIleAsnHisAsnGlyAsnThrAsnSerAsnPro165170175SerLeuLysSerArgValThrLeuSerLeuAspThrSerLysAsnGln180185190PheSerLeuLysLeuArgSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyr195200205TyrCysAlaPheGlyTyrSerAspTyrGluTyrAsnTrpPheAspPro210215220TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyCysGlyGly225230235240GlyLysValAlaAlaCysLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLys245250255ValAlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGlu260265<210>28<211>807<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1双抗体的第二和第四多肽链的多核苷酸<400>28gagatcgtacttacccagtctcccgccaccctttccctgagtcctggtgagcgggccact60ctttcctgtcgcgcaagccaatcagtttctagctacctcgcatggtatcagcagaagcca120gggcaggcacccaggcttctcatctatgacgccagtaaccgcgcaaccgggatacctgct180agattttccggcagtggatctgggaccgatttcacactgacaatttcatccttggaacca240gaagatttcgcagtctactactgccagcaatcttccaactggccaagaactttcggacag300gggaccaaagtggaaattaaaggtggcggatccggcggcggaggccaggtccagctccag360caatggggagccgggctgctgaaaccctctgaaacactgagtctcacatgtgccgtttat420ggaggttccttctccgattattactggaactggattcgtcagcctcccggcaagggcctg480gagtggatcggtgagattaaccacaatggcaataccaatagcaatcctagtttgaaatct540cgcgtcactctttccctcgatacaagcaaaaaccagttttctttgaaattgcgatctgta600actgctgctgatactgccgtgtattactgcgcattcggctactccgactatgaatataat660tggttcgatccttggggacagggaacattggtaaccgtgtcatccggaggatgtggcggt720ggaaaagtggccgcatgtaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcactt780aaggaaaaggtcgcagccctgaaagag807<210>29<211>501<212>PRT<213>人工序列<220><223>示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-2双抗体的第一和第三多肽链<400>29GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnSerSerAsnTrpProArg859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlyGlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLys115120125ProSerGluThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPhe130135140SerAspTyrTyrTrpAsnTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeu145150155160GluTrpIleGlyGluIleAsnHisAsnGlyAsnThrAsnSerAsnPro165170175SerLeuLysSerArgValThrLeuSerLeuAspThrSerLysAsnGln180185190PheSerLeuLysLeuArgSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyr195200205TyrCysAlaPheGlyTyrSerAspTyrGluTyrAsnTrpPheAspPro210215220TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyCysGlyGly225230235240GlyGluValAlaAlaCysGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGlu245250255ValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysLeuGluPro260265270LysSerAlaAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGlu275280285AlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp290295300ThrLeuTyrIleThrArgGluProGluValThrCysValValValAsp305310315320ValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGly325330335ValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsn340345350SerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp355360365LeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuPro370375380AlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu385390395400ProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsn405410415GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle420425430AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr435440445ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys450455460LeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCys465470475480SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeu485490495SerLeuSerProGly500<210>30<211>1503<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-2双抗体的第一和第三的多肽链的多核苷酸<400>30gagatcgtacttacccagtctcccgccaccctttccctgagtcctggtgagcgggccact60ctttcctgtcgcgcaagccaatcagtttctagctacctcgcatggtatcagcagaagcca120gggcaggcacccaggcttctcatctatgacgccagtaaccgcgcaaccgggatacctgct180agattttccggcagtggatctgggaccgatttcacactgacaatttcatccttggaacca240gaagatttcgcagtctactactgccagcaatcttccaactggccaagaactttcggacag300gggaccaaagtggaaattaaaggtggcggatccggcggcggaggccaggtccagctccag360caatggggagccgggctgctgaaaccctctgaaacactgagtctcacatgtgccgtttat420ggaggttccttctccgattattactggaactggattcgtcagcctcccggcaagggcctg480gagtggatcggtgagattaaccacaatggcaataccaatagcaatcctagtttgaaatct540cgcgtcactctttccctcgatacaagcaaaaaccagttttctttgaaattgcgatctgta600actgctgctgatactgccgtgtattactgcgcattcggctactccgactatgaatataat660tggttcgatccttggggacagggaacattggtaaccgtgtcatccggaggatgtggcggt720ggagaagtggccgcatgtgagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcactt780gaaaaggaggtcgcagccctggagaaactggagcccaaatctgctgacaaaactcacaca840tgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttcccccca900aaacccaaggacaccctctatatcacccgggagcctgaggtcacatgcgtggtggtggac960gtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcat1020aatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtc1080ctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaac1140aaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa1200ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctg1260acctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg1320cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc1380ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc1440tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccg1500ggt1503<210>31<211>262<212>PRT<213>人工序列<220><223>示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-2双抗体的第二和第四多肽链<400>31GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnArgSerAsnTrpProLeu859095ThrPheGlyGlnGlyThrAsnLeuGluIleLysGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlyGlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGln115120125ProGlyArgSerLeuArgLeuAspCysLysAlaSerGlyIleThrPhe130135140SerAsnSerGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeu145150155160GluTrpValAlaValIleTrpTyrAspGlySerLysArgTyrTyrAla165170175AspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsn180185190ThrLeuPheLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVal195200205TyrTyrCysAlaThrAsnAspAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuVal210215220ThrValSerSerGlyGlyCysGlyGlyGlyLysValAlaAlaCysLys225230235240GluLysValAlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLys245250255ValAlaAlaLeuLysGlu260<210>32<211>786<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-2双抗体的第二和第四多肽链的多核苷酸<400>32gaaattgtcctgacacagtctcccgcaaccctgagtttgagtcctggggagcgagcaact60ctctcctgccgagcctcccagagtatctcctcctacctcgcctggtaccaacagaagcca120gggcaggctccaaggctgcttatctatgacgcctctaaccgcgcaactgggattcccgca180cgcttctccggctctggttccggcacagactttacacttactatctctagcctggagcca240gaagactttgccgtgtactattgtcagcaacgttccaattggccccttacctttgggcag300ggcactaacttggaaatcaaaggtggcggatccggcggcggaggccaggttcagctggtc360gagagtggtggcggcgttgtgcaacctgggcgttccctccgattggactgtaaagcttcc420ggcattactttctcaaattccggcatgcattgggtgaggcaagcccctggaaaagggctc480gaatgggtggctgtgatttggtacgatggcagcaaacggtactacgccgattctgttaag540ggccgctttaccatctcccgcgataactcaaagaacacactgtttctgcaaatgaatagt600cttagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgccacaaatgacgattattgggggcag660ggcacattggtcacagtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcatgtaag720gagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctg780aaagag786当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3