GALNAC亚磷酰胺、其核酸缀合物及其用途的制作方法
本发明通常涉及亚磷酰胺衍生物领域。特别地，本发明涉及N-乙酰基半乳糖胺亚磷酰胺分子以及核酸分子与包含N-乙酰基半乳糖胺的分子的缀合物。还提供了用于制备这些分子的方法及其可能的用途，特别是在药物中的用途。
发明背景
近年来，已经研发了在疗法中使用核酸分子的方法。为了有利地影响药物的相关特性，已经使核酸分子与一些配体缀合，所述配体例如肽、脂质、甾醇和碳水化合物。已经广泛评价了核酸缀合物在siRNAs中的应用，其中它们被视为得到足够的体内效能所必不可少的。例如，通过使包含末端半乳糖或其衍生物的缀合部分连接至核酸，从而使该核酸分子通过结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)靶向至肝细胞，参见，例如WO2009/073809、WO2011/104169和WO2012/083046。
EP2796150描述了包含键合至siRNA或寡核苷酸两端的亲水性材料和疏水性材料的杂交缀合物。在一个实例中，所述亲水性材料是与聚乙二醇化siRNA分子偶联的特定的GalNAc亚磷酰胺。
US 6,057,431涉及在其末端上具有单糖或其衍生物的亚磷酰胺衍生物，特别地涉及寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸被引入所述亚磷酰胺衍生物。
Dubber和Frechet在2003Bioconjugate Chem.第14卷第239页上描述了使用用于偶联亚磷酰胺衍生物、但不产生寡核苷酸的DNA合成仪合成三价半乳糖簇(cluster)。WO2002/094185涉及用于细胞递送的多种缀合物和组合物。
WO2014/118267和WO2014/179620涉及反义寡核苷酸碳水化合物缀合物，特别地包含反义寡聚体和脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合部分，例如GalNAc缀合部分。
然而，目前可得到的碳水化合物缀合物的一个主要缺陷在于其复杂的合成，其包括十个以上单个的合成步骤。对于每种期望的缀合物，必须设置复杂和特定的合成方案。
发明目的
本发明的一个目的在于提供易于制备的新的缀合物分子。
令人惊奇地，本发明的发明人目前已经发现，通过使用新的GalNAc亚磷酰胺大大有利于碳水化合物核酸缀合物的合成。特别地，其应用导致在制备所述缀合物的过程中与目前可利用的方案相比操作步骤明显减少。
此外，由于本发明的GalNAc亚磷酰胺与商购可获得的分支分子以及商购可获得的间隔物的相容性，所以本发明在GalNAc-核酸缀合物的合成中提供了很大的灵活性。适合的GalNAc亚磷酰胺(带有期望的连接物)、核酸和(如果期望)分支分子和/或间隔物分子可以根据特定需要组合。例如，可以选择各个结构单元，使得最终的缀合物的缀合例如在GalNAc分子之间的间隔方面理想地适合于结合特异性细胞受体，例如脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
此外，新的GalNAc亚磷酰胺可以与例如LNA和DNA亚磷酰胺一起用于固相合成。这能够使得在核酸分子合成后即刻进行核酸碳水化合物缀合物装配，而核酸仍然连接至固体支持物。
发明概述
在一个方面，本发明涉及N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)亚磷酰胺。
在进一步的方面，本发明涉及GalNAc-核酸缀合物，即包含一个或多个(例如多个)GalNAc部分的分子，所述一个或多个(例如多个)GalNAc部分使用连接物和亚磷酰胺化学法与核酸分子共价结合。优选地，GalNAc部分与分支分子、任选地通过间隔物分子共价结合，由此生成包含2、3或多个GalNAc部分的簇。
在进一步的方面，本发明涉及GalNAc亚磷酰胺的制备方法。
在进一步的方面，本发明涉及GalNAc-核酸缀合物的制备方法。
在进一步的方面，本发明涉及所述新的GalNAc亚磷酰胺和GalNAc-核酸缀合物的多种用途。
根据进一步的方面，本发明提供了本发明化合物，特别是GalNAc-核酸缀合物的医药用途。
还提供了治疗方法，包括给需要的个体施用治疗或诊断有效量的本发明化合物，特别是GalNAc-核酸缀合物。
附图简述
图1：本发明寡聚体的固相合成概述
a)单独使用GalNAc亚磷酰胺(a)或与双重分支分子组合使用GalNAc亚磷酰胺(b)或与三重分支分子组合使用GalNAc亚磷酰胺(c)合成一价、二价和三价GalNAc-核酸缀合物的流程图。
b)使用GalNAc亚磷酰胺和间隔物和对于二价和三价分子使用双重或三重分支分子合成一价(a)、二价(b)和三价(c)GalNAc-核酸缀合物的流程图。
图2：GalNAc-核酸缀合物的合成实例
a)GalNAc亚磷酰胺直接与寡核苷酸的5’-端偶联作为固体支持物上的依次合成的组成部分的实例。
b)GalNAc亚磷酰胺直接与三重物(trebler)偶联，随后裂解并且脱保护得到寡核苷酸GalNAc簇构建体的实例。
c)在三重物上依次偶联间隔物和GalNAc亚磷酰胺，随后裂解并且脱保护，得到寡核苷酸GalNAc簇构建体的实例。
图3：有关GalNAc亚磷酰胺的NMR数据
a)31P-NMR
b)1H-NMR
c)13C-NMR
d)31P-NMR TEGβ-GalNAc亚磷酰胺
e)1H-NMR TEGβ-GalNAc亚磷酰胺
图4：有关一价GalNAc-寡核苷酸缀合物的数据
a)保留时间(UPLC)
b)如通过ESI-MS测定的分子量
图5：示例性GalNAc亚磷酰胺
(A)至(D)表示带有不同连接物的GalNAc亚磷酰胺。
图6：示例性的GalNAc-核酸缀合物
(A)和(B)是带有8个原子连接物长度的一价GalNAc-核酸缀合物。
(C)和(D)是带有5个原子连接物长度的二价GalNAc-核酸缀合物。从R1、2或3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链的长度为15个原子。
(E)是由GalNAc亚磷酰胺、分支物和寡核苷酸组成的三价GalNAc-核酸缀合物，连接物长度为2个原子。从R1、2或3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链的长度为10个原子。
(F)至(I)是由GalNAc亚磷酰胺、分支物和寡核苷酸组成的三价GalNAc-核酸缀合物，连接物长度为8。从R1、2或3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链的长度为16个原子。
(J)、(K)和M是由GalNAc亚磷酰胺、间隔物、分支物和寡核苷酸组成的三价GalNAc-核酸缀合物。连接物长度为2并且间隔物长度为3。从R1、2或3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链的长度为16个原子。
(L)是由GalNAc亚磷酰胺、间隔物、分支物和寡核苷酸组成的三价GalNAc-核酸缀合物。连接物长度为3并且间隔物长度为8。从R1、2或3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链的长度为22个原子。
(N)是由GalNAc亚磷酰胺、间隔物、分支物和寡核苷酸组成的三价GalNAc-核酸缀合物。连接物长度为2并且间隔物长度为17。从R1、2或3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链的长度为30个原子。
图7：ApoB mRNA敲除。
A)显示单一注射25mg/kg后10天试验化合物在肝中导致的mRNA敲除。
B)显示单一注射25mg/kg后10天试验化合物在肾中导致的mRNA敲除。
图8：血清中总胆固醇的下调
该图显示在单一注射25mg/kg化合物后第3、7和10天时测定的血清胆固醇的下调。
发明详述
GalNAc亚磷酰胺
在一个方面，本发明涉及新的N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)亚磷酰胺。因此，本发明提供了具有通式(I)的化合物，
其中
NR’R”是仲氨基，其中R’和R”独立地选自C1-C6-烷基，或者R’和R”一起形成5-或6-元环，其可以被取代并且可以包含另一个选自N和O的杂原子；
A是C1-C6-烷基或被保护的羟基-或硫代-基团；并且
G表示为通式(II)
其中A1是适合的羟基保护基，其在每次出现时可以是相同的或不同的；并且
L是具有2-30个碳原子的链长的连接物基团，其中该链上的碳原子的一个或多个可以各自独立地被-NHCO-、-CONH-和/或杂原子、特别是O替代。在一些实施方案中，所述连接物基团L选自C2-C30-亚链烯基、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-，更优选选自-(CH2)2-、-(CH2)3-和-(CH2)8-。
GalNAc部分可以是如式II中波状线所示的α或β构型。在优选的实施方案中，GalNAc部分是β构型。
本文所用的术语“GalNAc部分”是包含GalNAc的结构的N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。例如，在式(II)中，GalNAc部分是不构成L的分子部分。
本文所用的术语“GalNAc缀合部分”是指包含至少一个GalNAc部分并且可以缀合至药物、特别是核酸的分子。优选地，GalNAc缀合部分对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力。
本文所用的术语“亚磷酰胺”是指包含以氧化态III共价结合至至少一个氮原子的磷原子的任意化合物。本发明优选的亚磷酰胺是包含以氧化态III共价结合至至少一个氮原子和两个氧原子的磷原子的任意化合物。或者，本发明的亚磷酰胺是包含以氧化态III共价结合至至少一个氮原子和一个氧原子，并且代替第二个氧的是硫(sulphor)原子或C1-C6-烷基的磷原子的任意化合物。
在一些实施方案中，式(I)中的仲氨基-NR’R”的R’和R”独立地选自C1-C6-烷基，特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。在特别的实施方案中，R’与R’相同，并且-NR’R”随后优选选自二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基和二丁基氨基。在优选的实施方案中，R’和R”各自是异丙基。
在另外的实施方案中，R’和R”一起形成5-或6-元环，其可以被取代并且可以包含另一个选自N和O的杂原子。在一些实施方案中，R’和R”形成未取代的5-元环，在另外的实施方案中，它们形成未取代的6-元环。在进一步的实施方案中，5-元或6-元环在一个或多个碳原子上被取代。例如，所述环可以在1、2、3或4个碳原子上被取代，优选在1或2个碳原子上被取代。优选的取代基是甲基和乙基。特别地，所述环选自吡咯烷子基、哌啶子基、2,6-二甲基哌啶子基、吗啉代、咪唑基和4-甲基咪唑基。
根据一些实施方案，式(I)中的部分A选自C1-C6-烷基，特别是选自甲基和乙基。
在进一步的实施方案中，A是被保护的羟基(-OH)或被保护的硫代基团(-SH)。示例性的非限制性被保护的羟基是任一的基团，示例性的非限制性被保护的硫代是硫醚基团。特别地，由A表示的被保护的-OH或-SH基团选自2-氰基乙氧基、2-氰基乙硫基、甲氧基、乙氧基、S-异丁酰基-2-(2-巯基-乙氧基)乙氧基、S-新戊酰基-2-(2-巯基-乙氧基)乙氧基和S-新戊酰基-2-巯基乙氧基。在优选的实施方案中，A是2-氰基乙氧基。
连接物L根据GalNAc亚磷酰胺的期望的应用进行选择。在一些实施方案中，链上碳原子的一个或多个可以各自独立地被-NH-CO-、-CO-NH-和/或杂原子、特别是O替代。替代物数量应当适当，使得在替代后连接物的总长度不超过30个原子并且维持作为碳原子的替代物至少有一个相邻原子(-NH-CO-、-CO-NH的情况中)和至少2个相邻原子(在杂原子替代的情况中)。在一些实施方案中，替代物数量少于5并且与替代物的相邻原子是碳原子。在一些实施方案中，不超过一个或两个替代物在链上形成并且替代物的相邻原子是碳原子。例如，GalNAc与亚磷酰胺之间的连接物可以衍生自简单的二元醇。任何对称或不对称二元醇可以用作本发明GalNAc亚磷酰胺中的连接物，条件是它不含另外的亲核基团。在一些实施方案中，链上的碳原子被氧原子替代，以便形成-(OCH2CH2)-基团阵列。
在一些实施方案中，L选自C2-C30-亚烷基、C2-C30-亚链烯基和-CH2CH2-(OCH2CH2)0-8-OCH2CH2-。更特别地，连接物基团L可以选自C2-C20-亚烷基、C2-C20-亚链烯基、-CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2-、CH2CH2-(OCH2CH2)0-3-OCH2CH2-、CH2CH2-(OCH2CH2)0-4-OCH2CH2-和CH2CH2-(OCH2CH2)6-8-OCH2CH2。更特别地，所述亚烷基选自C3-C19-亚烷基，但不是C6亚烷基；或选自C7-C19-亚烷基。甚至更特别地，连接物基团L可以选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。在优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)2-或-(CH2)3-。在另外优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)8-或-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)5或-CH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，连接物L是-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。
对于A1，大量不同的保护基可以利用。本领域技术人员知晓如何选择对于用于制备亚磷酰胺的方法和寡核苷酸合成方法的偶联和氧化步骤的反应条件而言是稳定的保护基。作为式(II)的适合的羟基保护基A1的实例可以提及酰基和甲硅烷基。优选地，保护基A1选自乙酰基、苯甲酰基、苯氧基-乙酰基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、新戊酰基、异丁酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和异丙基二甲基甲硅烷基。在优选的实施方案中，A1是乙酰基。
在一些实施方案中，乙酰基用作保护基A1。当式(I)的GalNAc亚磷酰胺用于合成核酸缀合物时，乙酰基可以在通常用于例如LNA合成中的裂解和脱保护步骤中与核酸例如LNA或DNA的保护基一起被除去。
在一些实施方案中，二甲氧基三苯甲基(DMT)用作GalNAc的碳原子6上的保护基A1。在该位置上使用DMT的优点在于允许在纯化过程中容易地分离失败的序列(例如不完全构建体，其中合成中的失败导致GalNAc部分未被添加)。
在本发明的特别的实施方案中，化合物具有式(I)，其中
A是-O-CH2CH2CN，R’和R”各自是异丙基，并且G表示为式(II)，其中A1是乙酰基，并且L选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。在一些优选的实施方案中，A是-O-CH2CH2CN，R’和R”各自是异丙基，A1是乙酰基，并且L是-(CH2)2-。在另外优选的实施方案中，A是-O-CH2CH2CN，R’和R”各自是异丙基，A1是乙酰基，并且L是-(CH2)3-。在另外优选的实施方案中，A是-O-CH2CH2CN，R’和R”各自是异丙基，A1是乙酰基，并且L是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。在另外优选的实施方案中，A是-O-CH2CH2CN，R’和R”各自是异丙基，A1是乙酰基，并且L是-(CH2)8-。任选地，在上述优选的实施方案中，糖的6位上的A1是DMT。
示例性的GalNAc亚磷酰胺在图5中表示为式(A)至(D)。
GalNAc-核酸缀合物
在进一步的方面，本发明涉及新的GalNAc-核酸缀合物，特别是GalNAc簇缀合物。GalNAc缀合部分可以修饰或增强所连接的核酸的药代动力学和药效学特性。
因此，本发明提供了具有通式(III)的化合物，
其中
Z是核酸分子；
T表示为通式(IV)
其中
R2表示H或-(CH2)q-R1；
R1和R3在每次出现时表示为通式(V)
其中在每次出现时独立地
V选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
W选自-(CH2)2-15-和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-；
Y是O或S；
m是1至3的整数；
n是的0至5的整数；
p是0至3的整数；并且
q是1至2的整数；
r是1至5的整数；
s是0或1；
G表示为通式(II)’
其中A1是H或适合的羟基保护基，其在每次出现时可以是相同的或不同的；并且L是具有2-23个碳原子的链长的连接物基团，其中该链上的碳原子的一个或多个可以各自独立地被-NH-CO-、-CO-NH-和/或杂原子、特别是O替代；并且
在每次出现时独立地
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是-O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH，
其中，从R1、R3或R2(如果R2不是H)中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
或者，本发明提供了具有通式(III)的化合物，
其中
Z是核酸分子；
T表示为通式(VI)
其中在每次出现时独立地
W选自-(CH2)2-15-和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-；
s是0或1；
G表示为通式(II)’
其中A1是H或适合的羟基保护基，其在每次出现时可以是相同的或不同的；并且L是具有2-23个碳原子的链长的连接物基团，其中该链上的碳原子的一个或多个可以各自独立地被-NH-CO-、-CO-NH-和/或杂原子、特别是O替代；并且
在每次出现时独立地
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是-O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH，
其中，从连接物L的第一个原子开始并且终止于核酸分子中的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
连接物L的第一个原子是其中该连接物连接至式II和II’中的GalNAc部分的原子。
式(III)中的变量Z表示核酸分子。本发明上下文中涉及的核酸分子更广泛地如下所述并且通常可以为DNA、RNA或可以包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含核苷酸和核苷酸类似物或完全由核苷酸类似物组成。GalNAc缀合部分可以被构建在核酸的5’-或3’-端上。优选地，GalNAc缀合部分被构建在核酸分子的5’-端上。
特别地，核酸分子Z可以包含一个或多个锁定核酸核苷。
特别地，核酸分子可以包含一个或多个硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯(boranophosphate)核苷间连接。优选地，DNA和RNA核苷与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。在一些实施方案中，核酸分子中的全部核苷和/或核苷类似物与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。在优选的实施方案中，PO连接物位于核酸与GalNAc缀合部分之间。或者，另外的连接物可以位于核酸与GalNAc缀合部分之间。
通式(III)中的变量T表示为通式(IV)。通式(IV)显示GalNAc簇核酸缀合物的分支区。当R2是H时，即在合成过程中分支分子是双重的，两个GalNAc亚磷酰胺被添加到分支分子的反应端。当R2是-(CH2)q-R1时，即在合成过程中分支分子是三重的，三个GalNAc亚磷酰胺被添加到分支分子的反应端。
或者，通式(III)中的变量T表示为通式(VI)。这将产生一价GalNAc-核酸缀合物，其中式(VI)中的W或G与核酸或连接物(例如PO连接物)缀合。在优选的实施方案中，当式(III)中的T表示为式(VI)时，s是0。
式(III)中的仲氨基-NR’R”的R’和R”选自C1-C6烷基，或者R’和R”一起形成5-或6-元环，其可以被取代并且可以包含另一个选自N和O的杂原子，其中特别的C1-C6烷基和环选自上述有关式(I)的那些。在特别的实施方案中，R’与R”相同，并且-NR’R”选自二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基和二丁基氨基。在优选的实施方案中，R’和R”各自是异丙基。
在另外的实施方案中，R’和R”一起形成上述有关式(I)举出的5-或6-元环。特别地，该环选自吡咯烷子基、哌啶子基、2,6-二甲基哌啶子基、吗啉代、咪唑基和4-甲基咪唑基。
式(III)中的变量T表示为通式(IV)，其通过R1、R3和(如果R2不是H)R2参照式(V)，由此通过G是指式(II)’。式(IV)、(V)和(II)’中出现的变量进一步如下文所定义。
式(IV)中的变量m是1至3的整数，即它表示1、2或3，优选2或3。
式(IV)中的变量n是0至5的整数，即它表示0、1、2、3、4或5。在优选的实施方案中，n是0。
式(IV)中的变量p是0至3的整数，即它表示0、1、2或3，优选0或1。在一些优选的实施方案中，p是1。在另外优选的实施方案中，p是0。
式(IV)中的变量q在每次出现时独立地是1至2的整数，即它表示1或2。在优选的实施方案中，q在每次出现时是相同的整数。在特别优选的实施方案中，q在每次出现时是1。
在本发明特别的实施方案中，n是0，p是1，并且q是1；在另外的实施方案中，n是0，p是0，并且q是1；在另外的实施方案中，n是1，m是1、2或3，优选3，p是1，并且q是1。
就本发明的目的而言，预期簇中两个或三个GalNAc部分的拓扑定位对于功能而言是重要的。例如，这种定位可以影响其结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的能力，而这种能力是本文所述的新化合物的一种示例性的应用。因此，重要的是GalNAc-簇的骨架不会隔开(superate)一定的长度。术语“骨架”是指原子的连续链。例如，乙烷的骨架是C-C(2个原子的连续链)，而乙醚的骨架是C-C-O-C-C(5个原子的连续链)。关于通式(III)化合物，从R1中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点，或者从R3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点，或者(如果R2不是H)从R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链被定义为具有最长30个原子的长度。
应当理解，各连续链可以在其长度方面不同，但这些连续链中没有单一的一个超过30个原子。例如，连续链各自的长度可以独立地为8、9、10、12、14、16、18、20、25或30个原子长度。在一些实施方案中，从R1、R3和(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链各自具有相同的长度。在另外的实施方案中，从R1、R3和(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链各自具有不同的长度。例如，三个连续链各自可以彼此独立地具有16个原子或22个原子的长度。
作为根据原子数量定义长度的可选择的实施方案，还可以通过长度单位定义骨架长度，例如用埃(米)。关于通式(III)化合物，从R1中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点，或者从R3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点，或者(如果R2不是H)从R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链被定义为10至更优选12至并且最优选14至在一个实施方案中，从R1中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链为14至更优选16至并且从R3中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链各自为10至更优选14至并且从R1、R3和(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链具有相同长度，为16至更优选18至
“连接点”是直接连接至存在于式(IV)中的各分支上的分支点碳原子的-(CH2)q-中-CH2-基团的碳原子。
在一些优选的实施方案中，当GalNAc亚磷酰胺通过直接偶联在三重物上连接时，连接物基团L的骨架的长度为约8个原子，即6、7、8、9或10个原子。
在一些实施方案中，从R1、R3和(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链的长度主要通过选择适当的连接物基团L来调节。在这些实施方案中，式(V)中的变量s为0。
然而，根据本发明的另外的实施方案，可以在GalNAc亚磷酰胺中使用短连接物，将其与间隔物亚磷酰胺合并来装配类似的构建体。这对于改变分支物(或如果不存在分支物，为核酸)与GalNAc部分之间的连接物长度、但不使GalNAc亚磷酰胺与不同连接物分隔开而言是便利的方式。在这些实施方案中，式(V)中的变量s为1。
在一些优选的实施方案中，从R1、R3或(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的分支点碳原子的连续链
具有9至23个原子的长度。在进一步优选的实施方案中，从R1、R3或(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的分支点碳原子的连续链具有9至21个原子、例如12至18个原子、例如16个原子的长度。“分支点碳原子”是-(CH2)q-R1、-(CH2)q-R3和R2所结合的碳原子(参见图1)。
在实施方案中，当式(V)或(VI)中的s为1时，式(V)中的变量W选自-(CH2)2-15-，即-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-(CH2)13-、-(CH2)14-、-(CH2)15-，和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-，即-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)3OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-。在优选的实施方案中，W是-(CH2)8-或CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，W是-(CH2)5-或-CH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，W是-(CH2)2-或-CH2CH2CH2。
式(V)中的变量r在每次出现时独立地为1至5的整数，即它表示1、2、3、4或5。在优选的实施方案中，R在每次出现时为相同的整数。在特别优选的实施方案中，R在每次出现时为3。在另外优选的实施方案中，r在每次出现时为4。
式(V)中的变量V在每次出现时独立地选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-。在一些优选的实施方案中，V在每次出现时是-NH-CO-。在另外优选的实施方案中，V在每次出现时是-O-。
式(V)中的变量Y在每次出现时独立地选自O和S。在一些优选的实施方案中，Y在每次出现时是O。
式(III)、(V)和(VI)中的变量X1和X2在每次出现时独立地选自多种不同的组合：
在一些实施方案中，X1是-OH，并且X2是＝O；
在另外的实施方案中，X1是-OH，并且X2是＝S；
在另外的实施方案中，X1是O-，并且X2是＝O；
在另外的实施方案中，X1是O-，并且X2是＝S；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-CH3；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-SH；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-OR，其中R是C1-C6烷基，优选甲基或乙基；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-NHR，其中R是C1-C6烷基，优选甲基或乙基；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-BH3；
在另外的实施方案中，X1是＝S，并且X2是-CH3；
在另外的实施方案中，X1是＝S，并且X2是-SH。
在优选的实施方案中，式(III)、(V)和(VI)中的变量X1和X2在每次出现时独立地选自如下组合：
X1是-OH，并且X2是＝O；
X1是O-，并且X2是＝O；
X1是-OH，并且X2是＝S；
X1是O-，并且X2是＝S；和
X1是＝S，并且X2是-SH。
在一些优选的实施方案中，选择Y、X1和X2，使得式(V)中的基团-O-P(X1X2)-Y-在每次出现时独立地表示磷酸二酯基团(X1＝-OH或-O-，X2＝＝O，Y＝O)、膦酸甲酯基团(X1＝＝O，X2＝-CH3，Y＝O)、硫代磷酸酯基团(X1＝-OH，X2＝＝S，Y＝O)、二硫代磷酸酯基团(X1＝＝S，X2＝-SH，Y＝O)、烷基磷酸三酯基团(X1＝＝O，X2＝-OC1-C6-烷基，Y＝O)、甲基硫代膦酸酯基团(X1＝＝S，X2＝-CH3，Y＝O)、烷基亚磷酰胺基团(X1＝＝O，X2＝-NHC1-C6-烷基，Y＝O)或硼烷基磷酸酯基团(X1＝＝O，X2＝-BH3，Y＝O)。
在进一步优选的实施方案中，选择Y、X1和X2，使得式(V)中的基团-O-P(X1X2)-Y-在每次出现时独立地表示磷酸二酯基团、硫代磷酸酯基团或二硫代磷酸酯基团。在特别优选的实施方案中，选择Y、X1和X2，使得式(V)中的基团-O-P(X1X2)-Y-在每次出现时独立地表示磷酸二酯基团或硫代磷酸酯基团。
在一些实施方案中，选择Y、X1和X2，使得它们在每次出现时表示相同的基团，优选磷酸二酯基团或硫代磷酸酯基团。
式(V)或(VI)中的变量G表示为式(II)’。在式(II)’中，A1是保护基，对其进行选择，使得它对于所暴露于的反应条件保持稳定，例如用于制备亚磷酰胺方法中所用的条件和所述簇和寡核苷酸合成过程的偶联和氧化步骤中所用的条件。作为式(II)’的适合的羟基保护基A1的实例，可以提及酰基和甲硅烷基。优选地，保护基A1选自乙酰基、苯甲酰基、苯氧基-乙酰基、新戊酰基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、异丁酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和异丙基二甲基甲硅烷基。
在优选的实施方案中，A1是乙酰基。在一些实施方案中，二甲氧基三苯甲基(DMT)用作糖的6位上的保护基A1。在该位置上使用DMT的优点在于允许在纯化过程中容易地分离失败的序列(例如不完全构建体，其中合成中的失败导致GalNAc部分未被添加)。
式(II)’中的连接物基团L根据GalNAc核酸缀合物的期望的应用进行选择。在一些实施方案中，链上碳原子的一个或多个可以各自独立地被-NH-CO-、-CO-NH-和/或杂原子、特别是O替代。替代数量应当适当，使得连接物的总长度在替代后不超过30个原子并且在-NH-CO-、-CO-NH的情况中维持与作为碳原子的替代物有至少一个相邻原子并且在杂原子替代的情况中维持至少2个相邻碳原子。在一些实施方案中，替代数量少于5并且与替代物的相邻原子是碳原子。在一些实施方案中，在链上形成不多于一个或两个替代物并且与替代物的相邻原子为碳原子。例如，GalNAc与亚磷酰胺之间的连接物可以衍生自简单的二元醇。原则上，任何对称或不对称二元醇可以用作本发明GalNAc亚磷酰胺中的连接物，条件是它不含另外的亲核基团。在一些实施方案中，链上的碳原子被氧原子替代，以便形成-(OCH2CH2)-基团阵列。
在一些实施方案中，L选自C2-C20-亚烷基、C2-C20-亚链烯基和-CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2-、CH2CH2-(OCH2CH2)0-3-OCH2CH2-和CH2CH2-(OCH2CH2)0-4-OCH2CH2。更特别地，所述亚烷基选自C3-C19-亚烷基、但不是C6亚烷基或选自C7-C19-亚烷基。更具体地，连接物基团L可以选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。在优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)2-或-(CH2)3-。在另外优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)8-或-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)5或-CH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，连接物L是CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。
在本发明的一些实施方案中，双重物或三重物是不对称的，即式(IV)和(V)中的变量q、R、s、X1和X2的至少一个在其第一次出现时(例如在R1中)具有一个特定的含义并且在第二次和/或进一步出现时(例如在R3和/或R2中)具有不同的特定含义。在一些实施方案中，有关特别地R1、R3和任选的R2所定义的分支长度方面的不对称性是指变量q、R和s的至少一个在其第一次出现时与其第二次和/或第三次出现时相比具有不同的值。
在优选的实施方案中，双重物或三重物至少在由R1、R3和任选的R2所定义的分支长度方面是对称的，即变量q、r和s在每次出现时具有相同的值。在一些实施方案中，另外，变量X1和X2和/或A1在每次出现时表示相同的基团。
在式(III)的GalNAc-核酸缀合物的一些特别的实施方案中，n是0，p是0，R2是H，q是1，V是-NH-CO-，并且r是4。在另外的特别的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，并且r是3。在另外特别的实施方案中，n是1，m是3，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3。
更特别地，在式(III)的GalNAc-核酸缀合物的一些优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是＝O，X2是-SH，W是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在式(III)的GalNAc-核酸缀合物另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，R是3，s是1，X1是-O-，X2是＝S，W是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在式(III)的GalNAc-核酸缀合物另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-，X2是＝S，W是-CH2CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在式(III)的GalNAc-核酸缀合物另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是＝O，X2是-SH，W是-CH2CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在式(III)的GalNAc-核酸缀合物另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是＝O，X2是-SH，W是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在式(III)的GalNAc-核酸缀合物另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-，X2是＝S，W是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在式(III)的GalNAc-核酸缀合物另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-或＝O，X2是＝S或-SH，W是-CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是0，X1是-O-，X2是＝S，Y是O，L是-(CH2)8-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是0，X1是＝O，X2是SH，Y是O，L是-(CH2)8-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是0，X1是-O-，X2是＝S，Y是O，L是CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是0，X1是＝O，X2是-SH，Y是O，L是CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-，X2是＝S，W是-CH2CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是＝O，X2是-SH，W是-CH2CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-，X2是＝S，W是-CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是＝O，X2是-SH，W是-CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是＝O，X2是-SH，W是-CH2CH2OCH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-，X2是＝S，W是-CH2CH2OCH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-(CH2)q-R1，q是1，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-或＝O，X2是＝S或-SH，W是-CH2CH2CH2-，Y是O，L是-CH2CH2OCH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在另外优选的实施方案中，n是0，p是1，R2是-H，q是0，V是-O-，r是3，s是1，X1是-O-或＝O，X2是＝S或-SH，Y是O，L是-CH2CH2OCH2CH2-，并且A1是乙酰基。
在上述所示的所有优选实施方案中，式(III)的X1和X2可以独立地选自式(V)和(VI)的X1和X2。优选地，在上述式(III)的X1和X2的优选的实施方案中，X1是-S-或-O-或＝O，并且X2是＝O或＝S或-OH或-SH。
GalNAc-核酸缀合物的示例性实施方案在图6中表示为式(A)-(N)。
式(A)-(N)中的术语寡核苷酸应当被理解为宽范围背景下的核酸。
本发明的GalNAc簇核酸缀合物可以被特别地设计成结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。因此，根据一些实施方案，本发明的一价、二价或优选三价GalNAc核酸缀合物具有对ASGPR的强亲和力。本发明所涉及的“强亲和力”是指特征在于低于50nM、优选25nM或以下、更优选10nM或以下、更优选5nM或以下的IC50值的亲和力。
在特别优选的实施方案中，具有一价GalNAc簇的GalNAc-核酸缀合物对ASGPR的IC50为50nM，优选25nM或以下，更优选15nM或以下，更优选10nM或以下，更优选5nM或以下。
在特别优选的实施方案中，具有二价GalNAc簇的GalNAc-核酸缀合物对ASGPR的IC50为50nM，优选25nM或以下，更优选15nM或以下，更优选10nM或以下，更优选5nM或以下。
在另外特别优选的实施方案中，具有三价GalNAc亚磷酰胺簇的GalNAc-核酸缀合物对ASGPR的IC50为25nM或以下，优选15nM或以下，更优选10nM或以下，更优选5nM或以下，更优选1nM至5nM，例如约3nM。IC50是GalNAc-核酸缀合物抑制标记的配体结合ASPGR达50％的浓度。可以通过Rensen等人在2001Journal of Biological Chemistry第276卷第37577页上所述的方法测定IC50。简言之，在4℃在递增量的所研究的GalNAc-核酸缀合物的存在下将肝细胞(原代或培养中的)与一种浓度(例如5nM)下的配体125I-标记的脱唾液酸化(asialylated)血清类粘蛋白(ASOR)一起温育2小时。对于一价GalNAc-核酸缀合物，浓度可以为2至200mM；对于二价GalNAc-核酸缀合物，浓度可以为1至1000nM；并且对于三价GalNAc-核酸缀合物，浓度可以为0.2至200nM，均为递增浓度。随后在所研究的GalNAc-核酸缀合物的存在下结合标记的ASOR。可以在100mM GalNAc的存在下测定非特异性结合。可以使用单点结合模型分析置换结合数据并且计算IC50。
GalNAc亚磷酰胺的制备
在进一步的方面，本发明涉及制备GalNAc亚磷酰胺的方法。因此，本发明提供了用于制备式(I)化合物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)以立体选择性方式在N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)的碳原子1与2之间形成内部唑啉环；
(ii)使步骤(i)的产物与具有通式HO-L-O-A3的化合物反应，其中
A3是适合的保护基，并且
L是具有2-30个碳原子链长的连接物基团，其中链上碳原子的一个或多个可以各自独立地被-NH-CO-、-CO-NH-和/或杂原子、特别是O替代；
其中L优选选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-，
由此在GalNAc环的碳原子1上形成醚键；
(iii)使步骤(ii)的产物中的-O-A3基团脱保护，由此得到脱保护的-OH基团；
(iv)使步骤(iii)的产物与亚磷酰二胺或氯代亚磷酰胺反应，由此得到式(I)化合物。
保护基A3必须适合于保护通式HO-L-OH的二元醇的羟基之一。这类保护基是有机合成领域普通技术人员所公知的。例如，可以使用酰基和甲硅烷基。在一些优选的实施方案中，保护基A3选自乙酰基、苯甲酰基、苯氧基-乙酰基、新戊酰基、异丁酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和异丙基二甲基甲硅烷基。在优选的实施方案中，A3是叔丁基二苯基甲硅烷基。
根据GalNAc亚磷酰胺期望的应用选择HO-L-O-A3中的连接物基团L。在一些实施方案中，链上碳原子的一个或多个可以各自独立地被-NH-CO-、-CO-NH-和/或杂原子、特别是O替代。替代数量应当适当，使得在替代后连接物的总长度不超过30个原子并且维持作为碳原子的替代物至少有一个相邻原子(在-NH-CO-、-CO-NH的情况中)和至少2个相邻原子(在杂原子替代物的情况中)。在一些实施方案中，替代数量少于5并且与替代物的相邻原子是碳原子。在一些实施方案中，不超过一个或两个替代物在链上形成并且替代物的相邻原子是碳原子。
在一些实施方案中，L选自C2-C30-亚烷基、C2-C30-亚链烯基和-CH2CH2-(OCH2CH2)0-8-OCH2CH2-。更特别地，连接物基团L可以选自C2-C20-亚烷基、C2-C20-亚链烯基和-CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2-。甚至更特别地，连接物基团L可以选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。在优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)2-或-(CH2)3-。在另外优选的实施方案中，连接物L是-(CH2)8-或-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，连接物L是-CH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，连接物L是-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。
有机合成领域普通技术人员知晓用于使被保护的羟基脱保护的几种标准方案。取决于所用的保护基，脱保护可以例如通过添加弱酸或弱碱或催化剂等来进行。
GalNAc核酸缀合物的制备
在进一步的方面，本发明涉及使用至少一种GalNAc亚磷酰胺制备核酸缀合物的方法。
因此，本发明提供了用于制备GalNAc-核酸缀合物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)将核酸分子提供在固体支持物上；
(ii)使用亚磷酰胺化学法任选将分支物分子添加到核酸分子上；
(iii)使用亚磷酰胺化学法任选将间隔物亚磷酰胺分子添加到分支物分子的每个分支上；
(iv)如果不存在分支物分子，则使式(I)化合物与核酸分子反应端反应，或者如果存在分支物分子并且不存在间隔物，则使式(I)化合物与每个分支的反应端反应，或者如果存在间隔物，则使式(I)化合物与每个间隔物的反应端反应；和
(v)从固体支持物上裂解步骤(iv)的产物；
其中从式(I)化合物中的连接物L的第一个原子开始并且终止于使缀合物部分连接至核酸的磷原子的连续链具有最短10个原子的长度和最长34个原子的长度。
更特别地，本发明提供了用于制备核酸缀合物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)将核酸分子提供在固体支持物上；
(ii)使用亚磷酰胺化学法任选将分支物分子添加到核酸分子上，其中添加后所述分支物分子产生优选由通式(IV a)表示的结构，
其中
A4是适合的保护基；
V1选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V2不存在或选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V3选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-SH、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基，或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH；
m是1至3的整数；
n是0至5的整数；
p是0至3的整数；并且在每次出现时独立地
q是1至2的整数；
q’是0至2的整数；并且
r是1至5的整数；
条件是当V2不存在时，q’是0，并且连接至式(IV a)中V2的-(CH2)r-OA4也不存在；
(iii)使用亚磷酰胺化学法任选将间隔物亚磷酰胺分子添加到分支物分子的每个分支上，其中添加后所述间隔物分子产生优选由通式(V a)表示的结构，
其中在每次出现时独立地
A5是适合的保护基；
W选自-(CH2)2-15-和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-；
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S，或者
X1是O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-SH、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH；
(iv)如果不存在分支物分子，则使式(I)化合物与核酸分子反应端反应，或者如果存在分支物分子并且不存在间隔物分子，则使式(I)化合物与每个分支的反应端反应，或者如果存在间隔物，则使式(I)化合物与每个间隔物的反应端反应；和
(v)从固体支持物上裂解步骤(iv)的产物；
其中从式(I)化合物中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IVa)中的连接点或核酸分子的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
更特别地，本发明提供了用于制备核酸缀合物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)将核酸分子提供在固体支持物上；
(ii)使用亚磷酰胺化学法将分支物分子添加到核酸分子上，其中添加后所述分支物分子产生优选由通式(IV a)表示的结构，
其中
A4是适合的保护基；
V1选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V2不存在或选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V3选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-SH、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH；
m是1至3的整数；
n是0至5的整数；
p是0至3的整数；并且在每次出现时独立地
q是1至2的整数；
q’是0至2的整数；并且
r是1至5的整数；
条件是当V2不存在时，q’是0，并且连接至式(IV a)中V2的-(CH2)r-OA4也不存在；
(iii)使式(I)化合物与每个分支的反应端反应；和
(v)从固体支持物上裂解步骤(iv)的产物；
其中从式(I)化合物中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IVa)中的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
在优选的实施方案中，式(I)中的连接物L选自-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2。
更特别地，如果GalNAc-核酸缀合物中的缀合部分由分支物和式(I)化合物生成，即无间隔物，则q是1；q’是1；并且r是3，并且L是-(CH2)8-或CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-或-(CH2)5或CH2CH2OCH2CH2-。
更特别地，如果GalNAc-核酸缀合物中的缀合部分由双重物和式(I)化合物生成，即无间隔物，则q是1；q’是1；并且r是3，并且L是-(CH2)5-或CH2CH2OCH2CH2-。
更特别地，如果GalNAc-核酸缀合物中的缀合部分由三重物和式(I)化合物生成，即无间隔物，则q是1；q’是1；并且r是3，并且L是-(CH2)8-或CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。
或者，所述方法适用于分支物、连接物和式(I)化合物。更特别地，本发明提供了用于制备核酸缀合物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)将核酸分子提供在固体支持物上；
(ii)使用亚磷酰胺化学法将分支物分子添加到核酸分子上，其中添加后所述分支物分子产生优选由通式(IV a)表示的结构，
其中
A4是适合的保护基；
V1选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V2不存在或选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V3选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-SH、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基，或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH；
m是1至3的整数；
n是0至5的整数；
p是0至3的整数；并且在每次出现时独立地
q是1至2的整数；
q’是0至2的整数；并且
r是1至5的整数；
条件是当V2不存在时，q’是0，并且连接至式(IV a)中V2的-(CH2)r-OA4也不存在；
(iii)使用亚磷酰胺化学法将间隔物亚磷酰胺分子添加到分支物分子的每个分支上，其中添加后所述间隔物分子产生优选由式(V a)表示的结构，
其中在每次出现时独立地
A5是适合的保护基；
W选自-(CH2)2-15-和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-；
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-SH、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH；
(iv)使式(I)化合物与每个间隔物的反应端反应；和
(v)从固体支持物上裂解步骤(iv)的产物；
其中从式(I)中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IVa)中的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
更特别地，如果核酸缀合物上的缀合部分由分支物产生，则其中q是1；q’是1；并且r是3；如果由间隔物产生，则其中W选自-(CH2)2-5-或-CH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-；并且如果由式(I)化合物产生，则其中L是-(CH2)2-5-或CH2CH2OCH2CH2-。在优选的实施方案中，W是-(CH2)3，并且L是CH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，W是-(CH2)3或-(CH2)2，并且L是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，W是CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2，并且L是-(CH2)3-或-(CH2)2。在另一个优选的实施方案中，W是-(CH2)3-，并且L是-(CH2)2。
用于生成GalNAc核酸缀合物的核酸分子更广泛地如下所述。通常，核酸分子可以为DNA、RNA或可以包含核苷酸序列，其包含核苷和核苷类似物或完全由核苷类似物组成。GalNAc缀合部分可以被构建至核酸分子的5’-或3’-端。优选地，GalNAc缀合部分被构建至核酸分子的5’-端。在一些实施方案中，PO连接物位于核酸与GalNAc缀合部分之间。
特别地，核酸分子可以包含一个或多个锁定核酸核苷。
特别地，核酸分子可以包含一个或多个硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯核苷间连接物。优选地，DNA和RNA核苷与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。更优选地，核酸分子中的所有核苷和/或核苷类似物与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。在一些实施方案中，GalNAc-核酸缀合物可以使用亚磷酰胺化学法，通过使本发明式(I)的GalNAc亚磷酰胺直接偶联至核酸分子例如寡核苷酸的5’-端作为例如固体支持物上的依次合成的组成部分来制备。在这些实施方案中，无分支物或间隔物分子被添加到核酸分子上。
“亚磷酰胺化学法”即反应顺序是指包括至少如下的步骤：
(a)使被保护的羟基，例如核苷的5’-OH基团或连接物部分脱保护或者使式(IV a)和(V a)中的A4-O或A5-O上的氧基脱保护；
(b)使包含亚磷酰胺的化合物例如本发明的GalNAc亚酰胺(amidite)或分支物分子或间隔物分子与未被保护的羟基(也可以称作相应分子的“反应端”)偶联；和
(c)氧化中间体。
因此，当进行用于制备GalNAc-核酸缀合物的方法的步骤(ii)、(iii)和(iv)时，核酸的被保护的一个或多个羟基(步骤(ii))、分支物分子(步骤(iii)；例如A4O-)和间隔物分子(步骤(iv)；例如A5O-)分别被脱保护，然后使它们进一步反应，即然后添加步骤(ii)中的分支物分子，添加步骤(iii)中的间隔物分子或添加式(I)或式(III)化合物。
适合的脱保护反应是有机合成领域普通技术人员所公知的。
在用于制备GalNAc-核酸缀合物的方法的一些实施方案中，使用亚磷酰胺化学法将分支物分子添加到核酸分子上。添加后，分支物分子优选地由通式(IV a)表示，
在式(IV a)中，A4是适合的保护基。这类保护基是有机合成领域普通技术人员所公知的。例如，可以提及与游离OH基团形成醚的基团。在一些优选的实施方案中，保护基A4是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
式(IV a)中的变量V1和V3独立地选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；在一些实施方案中，它们均为-O-；在另外的实施方案中，它们均为-NH-CO-。
式(IV a)中的变量V2不存在或选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-。当V2不存在时，q’是0，并且连接至式(IV a)中的V2的-(CH2)r-OA4也不存在。在一些实施方案中，V2是-O-；在另外的实施方案中，V2是-NH-CO-。
在一些特别的实施方案中，V1、V2和V3均为-O-。
式(IV a)中的变量X1和X2选自许多不同的组合：
在一些实施方案中，X1是-OH，并且X2是＝O；
在另外的实施方案中，X1是-OH，并且X2是＝S；
在另外的实施方案中，X1是O-，并且X2是＝O；
在另外的实施方案中，X1是O-，并且X2是＝S；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-CH3；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-SH；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-OR，其中R是C1-C6烷基，优选甲基或乙基；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-NHR，其中R是C1-C6烷基，优选甲基或乙基；
在另外的实施方案中，X1是＝O，并且X2是-BH3；
在另外的实施方案中，X1是＝S，并且X2是-CH3；
在另外的实施方案中，X1是＝S，并且X2是-SH。
在优选的实施方案中，式(IV a)中的变量X1和X2选自如下组合：
X1是-OH，并且X2是＝O；
X1是O-，并且X2是＝O；
X1是-OH，并且X2是＝S；
X1是O-，并且X2是＝S；和
X1是＝S，并且X2是-SH。
在一些优选的实施方案中，选择X1和X2，使得式(IV a)中的基团-O-P(X1X2)-与其所连接的羟基一起表示磷酸二酯基团、硫代磷酸酯基团或二硫代磷酸酯基团。
变量q’是0至2的整数，即它表示0、1或2。在一些优选的实施方案中，q’＝q。
式(IV a)的变量m、n、p、q和r如上文有关对式(IV)所公开的定义。
在本发明的一些优选的特别实施方案中，分支物分子选自：
1,3-双-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基酰氨基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(Glen研究目录号：10-1920-xx)；
三-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen研究目录号：10-1922-xx)；和
三-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]亚甲基氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
在另一个实施方案中，分支物可以是1-[5-(4,4’-二甲氧基-三苯甲基氧基)戊基酰氨基]-3-[5-芴基甲氧基-羰基-氧基-戊基酰氨基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen研究目录号：10-1925-xx)。
在一些实施方案中，使用亚磷酰胺化学法将间隔物分子添加入分支物分子的每个分支上。添加后，间隔物分子优选地由通式(V a)表示，
在式(V a)中，A5是适合的保护基。这类保护基是有机合成领域普通技术人员所公知的。
保护基A5可以在每次出现时独立地选择。然而，在优选的实施方案中，相同的保护基用于所有间隔物。
例如，可以将与游离OH基团形成醚的基团作为适合的保护基A5提及。在一些优选的实施方案中，保护基A5是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
式(V a)中的变量W选自-(CH2)2-15-，即(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-(CH2)13-、-(CH2)14-、-(CH2)15-，和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-，即-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)3OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-。在优选的实施方案或，W是-(CH2)8-或CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，W是-(CH2)5-或-CH2CH2OCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，W是-(CH2)2-或-CH2CH2CH2。
式(V a)中的变量X1和X2独立地选自有关对上述式(IV a)中的X1和X2定义的组合。
在一些优选的实施方案中，选择X1和X2，使得式(V a)中的基团-O-P(X1X2)-与其所连接的羟基一起表示磷酸二酯基团、硫代磷酸酯基团或二硫代磷酸酯基团。
在本发明的一些实施方案中，间隔物亚磷酰胺分子表示为通式(VII)
式(VII)中的仲氨基-NR’R”的R’和R”选自C1-C6烷基，或者R’和R”一起形成5-或6-元环，其可以被取代并且可以包含另一个选自N和O的杂原子，其中特别的C1-C6烷基和环选自上述有关对式(I)所定义的那些。在特别的实施方案中，R’与R”相同，并且-NR’R”选自二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基和二丁基氨基，优选二异丙基氨基。在另外的实施方案中，R’和R”一起形成如上述有关对式(I)所举出的5-或6-元环。特别地，所述环选自吡咯烷子基、哌啶子基、2,6-二甲基哌啶子基、吗啉代、咪唑基和4-甲基咪唑基。
作为适合的保护基，式(VII)中A2是被保护的羟基(-OH)或被保护的硫代基团(-SH)。示例性的非限制性被保护的羟基是醚基，示例性的非限制性被保护的硫代基团是硫醚基团。特别地，由A2表示的被保护的-OH或-SH基团选自2-氰基乙氧基、2-氰基乙硫基、甲氧基、乙氧基、S-异丁酰基-2-(2-巯基-乙氧基)乙氧基、S-新戊酰基-2-(2-巯基-乙氧基)乙氧基和S-新戊酰基-2-巯基乙氧基。
式(VII)中的保护基A6在每次出现时可以独立地选择。然而，在优选的实施方案中，相同的保护基用于所有间隔物。例如，可以将与游离OH基团形成醚的基团作为适合的保护基A6提及。在一些优选的实施方案中，保护基A6是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
在一些优选的实施方案中，A2是-CH2CH2CN，A6是4’,4’-二甲氧基三苯甲基，R4选自：-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-、-CH2CH2CH2-和-(CH2)12-；并且NR’R”是仲氨基，其中R’和R”独立地选自C1-C6-烷基或者R’和R”一起形成5-或6-元环，其可以被取代并且可以包含另一个选自N和O的杂原子。
在优选的特别的实施方案中，A2是-CH2CH2CN，A6是4’,4’-二甲氧基三苯甲基，R4是-CH2CH2CH2-，并且R’和R”各自是异丙基。在进一步优选的特别的实施方案中，A2是-CH2CH2CN，A6是4’,4’-二甲氧基三苯甲基，R4是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，并且R’和R”各自是异丙基。
如上所述，GalNAc-亚磷酰胺的骨架长度不应当超过一定长度。因此，化合物用于制备本发明GalNAc-核酸缀合物的方法中，从式(I)化合物中的连接物L的第一个原子开始(如果不使用分支物和/或间隔物分子)并且终止于连接缀合部分至核酸的磷原子的连续链被定义为具有最短10个原子的长度和最长34个原子的长度。
类似地，在其中添加分支物和/或间隔物分子的情况中，从R1、R3或(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
各连续链可以在其长度方面不同，但这些连续链中无单一一个长于34个原子。例如，各连续链的长度可以独立地为8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、31、32、33或34个原子长度，从式(I)化合物中的连接物L的第一个原子开始(如果不使用分支物和/或间隔物分子)并且终止于连接缀合部分至核酸的磷原子的连续链。从式(I)化合物中的连接物L的第一个原子开始(如果不存在分支物和/或间隔物分子)的连续链的最大长度优选为10、12个原子或14个原子。优选地，该长度为10至34个原子，更优选10至30个原子，更优选14至26个原子，甚至更优选16至20个原子。
在其中使用分支物和/或间隔物分子的实施方案中，从R1、R3或(如果R2不是H)R2中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的连接点的连续链各自可以独立地为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30个原子的长度。例如，三个连续链各自可以具有14个原子、16个原子或18个原子的长度。优选地，该长度为8至30个原子，更优选14至22个原子，甚至更优选16至20个原子。
在用于制备本文所述的GalNAc-核酸缀合物的方法的一些实施方案中，通过步骤(ii)将分支的缀合部分添加到核酸分子上。在这些实施方案中，从式(I)化合物中的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV a)中的分支点碳原子的连续链
可以优选地具有9至23个原子的长度。
根据本发明的一些实施方案，可以通过依次合成核酸、然后添加任选的分支物和任选的间隔物和GalNAc亚磷酰胺并且从支持物上裂解来合成GalNAc-核酸缀合物(在固体支持物上，使用亚磷酰胺化学法)(参见图1有关概述的方案)。
示例性GalNAc-核酸缀合物的合成如图2中所示。
GalNAc亚磷酰胺和衍生自它们的化合物的用途
在进一步的方面，本发明涉及所述新的GalNAc亚磷酰胺的多种用途。例如，本发明提供了式(I)化合物在制备GalNAc-核酸缀合物中的用途。缀合部分可以是一价的或簇。优选地，簇在GalNAc部分方面是二价的或三价的。可以使用本发明的GalNAc亚磷酰胺制备本发明的GalNAc-核酸缀合物，即式(III)化合物，其带有或不带有分支物和/或间隔物分子，优选带有分支物和/或间隔物分子。特别地，式(I)化合物可以用于上述制备GalNAc-核酸缀合物的方法中。
在本发明特别的实施方案中，缀合的GalNAc簇可以用于促进与GalNAc缀合部分缀合的药物部分的药物递送。例如，与GalNAc缀合部分缀合的药物与未缀合的药物部分相比具有改善的到达肝的吸收。适合的药物可以是例如能够调节细胞或哺乳动物中的靶基因或RNA的核酸，例如单链寡核苷酸或siRNAs。
在进一步的方面，本发明涉及本发明化合物的医药用途。因此，本发明提供了式(I)化合物用于将药物递送至肝、特别是递送至肝细胞的用途。本发明还提供了式(III)化合物用于药物、特别是人用药物的用途。特别地，本发明提供了式(III)化合物作为药物的用途。
在特别的实施方案中，本发明的GalNAc-核酸缀合物、例如与三价(即具有三个分支的分支物)GalNAc簇缀合的核酸能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，从而允许细胞摄取本发明的GalNAc-核酸化合物。
特别地，本发明的GalNAc核酸缀合物、例如包含寡核苷酸缀合物的LNA用于下调肝表达的RNA。特别地用于预防或治疗代谢疾病或障碍或者肝疾病或障碍。特别地，用于治疗如下疾病：例如肝炎(包括病毒性肝炎，例如HBV或HCV)、肝脂肪变性(包括代谢功能障碍)、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症例如载脂蛋白B中功能突变增加、HDL/LDL胆固醇失调、血脂异常例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、他汀类抗性高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、急性冠脉综合征(ACS)、肝纤维变性(或与肝纤维变性相关的疾病)、肝硬化和癌症。
本发明还提供了治疗如下疾病的方法：肝疾病，例如肝炎(包括病毒性肝炎，例如HBV或HCV)、肝脂肪变性(包括代谢功能障碍)、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症例如载脂蛋白B中功能突变增加、HDL/LDL胆固醇失调、血脂异常例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、他汀类抗性高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、肝硬化和癌症。
核酸分子
本发明上下文中的术语“核酸分子”是指通过两个或多个核苷共价连接形成的分子(即寡核苷酸)。本文的单一核苷(单元)也可以称作单体或单元。在一些实施方案中，术语“核苷”、“核苷酸”、“单元”和“单体”可以互换使用。认为当涉及核苷酸或单体序列时，涉及的是碱基，例如A、T、G、C或U或其类似物序列。
所述核酸分子可以是DNA、RNA或可以包含核苷酸序列，其包含核苷酸和核苷酸类似物。特别地，调节细胞内RNA的核酸类似物分子是期望的。调节可以是，例如有利于mRNA降解、mRNA转录阻断、剪接位点修复、防止micro RNA剪接或阻断。
核酸分子可以包含相当于靶核酸的反向补体的连续核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，当与靶核酸序列杂交并且仍然足以结合该靶标以显示期望的作用即靶标下调时，核酸分子可以耐受1、2、3或4(或以上)个错配。错配可以例如通过增加的寡聚体核苷酸序列长度和/或增加存在于该核苷酸序列内的核苷酸类似物例如LNA的数量得到代偿。
在一些实施方案中，当与靶序列例如编码哺乳动物靶蛋白的核酸相应区杂交时，连续核苷酸序列包含不超过3个、例如不超过2个错配。
在一些实施方案中，当与靶序列例如编码哺乳动物靶蛋白的核酸相应区杂交时，连续核苷酸序列包含不超过单个错配。
核酸分子的核苷酸序列优选与存在于靶核酸中的相应序列的反向补体至少80％相同，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同，例如100％相同。
术语“互补”是指在一个序列可以以反向平行方式结合另一个序列时，两个序列是互补的，其中每个序列的3’-端结合另一个序列的5’-端，并且一个序列的A、T(U)、G和C各自分别与另一个序列的T(U)、A、C和G比对。通常，核酸分子的互补序列与存在于靶核酸分子中的亚序列具有至少80％的互补，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％互补、至少97％互补、至少98％互补、至少99％互补，例如100％互补(完全互补)。
在测定核酸分子与靶核酸序列之间的互补程度的过程中，将互补程度表示为核酸分子的序列和与之最佳比对的靶标区序列之间的互补百分比。该百分比通过如下方式计算：计数2个序列之间形成配对的比对碱基数量，除以核酸分子(反义寡核苷酸或siRNA)中单体的总数并且乘以100。在这类比较中，未比对的核碱基/核苷酸称作错配。
mRNA调节可以通过与涉及RNAi-诱导的沉默复合物(RISC)的细胞的RNA干扰途径机器(machinery)的相互作用得到促进。RNAi多核苷酸可以选自：siRNA、microRNA、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码能够诱导RNA干扰的RNA的表达弹夹。
siRNA包含双链结构，其典型地包含15-50个碱基对并且优选21-25个碱基对并且具有与在细胞内表达的靶基因或RNA中的编码序列相同(完全互补)或接近相同(部分互补)的核苷酸序列。siRNA可以由两个退火的多核苷酸或形成发夹结构的单一多核苷酸组成。本发明的siRNA分子包含有义区和反义区。在一个实施方案中，缀合物的siRNA由两个寡核苷酸片段装配，其中一个片段包含siRNA分子的反义链的核苷酸序列，第二个片段包含siRNA分子的有义区的核苷酸序列。在另一个实施方案中，有义链通过连接物分子例如多核苷酸连接物或非-核苷酸连接物连接至反义链。优选地，本发明的缀合物与siRNA的有义链偶联。如果可裂解的连接物存在于siRNA与缀合物之间，则该缀合物可以连接至有义或反义链的任一个。
microRNAs(miRNAs)是小的未编码RNA基因产物，其约为22个核苷酸长度，指导其mRNA靶标的破坏或翻译抑制。如果miRNA与靶标mRNA之间的互补是部分的，则靶标mRNA的翻译被抑制。如果互补是广泛的，则靶标mRNA被裂解。对于miRNAs，该复合物结合通常位于典型地仅与miRNA共有部分同源性的mRNAs的3’UTR中。“种子区”-与其靶标形成完美碱基配对的miRNA的5’端上约七(7)个连续核苷酸区段-在miRNA特异性中起关键作用。用寡聚体阻断miRNA种子区或使RISC/miRNA复合物结合至mRNA易化可以导致蛋白质翻译抑制或mRNA裂解和降解。
RNAi多核苷酸表达弹夹可以在细胞中被转录以产生小的发夹RNAs，其可以作为siRNA起作用，分离有义和反义链线性siRNAs或miRNA。RNA聚合酶III转录的DNAs包含选自如下列出的启动子：U6启动子、HI启动子和tRNA启动子。RNA聚合酶II启动子包括UI、U2、U4和U5启动子、snRNA启动子、microRNA启动子和mRNA启动子。
或者，与靶标mRNA或miRNA互补的单链寡核苷酸(反义寡核苷酸)可以易于RNA调节。认为反义寡核苷酸可以通过非Rnase介导的靶标mRNA降解、例如通过翻译位阻或其它方法起作用，然而，本发明优选的反义寡核苷酸能够募集内切核糖核酸酶(RNase)，例如RNase H。
EP 1 222 309提供了用于测定RNase H活性的体外方法，其可以用于测定募集RNase H的能力。使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果在提供互补RNA靶标时，如以pmol/l/分钟测定的RNase H起始速率是使用仅DNA寡核苷酸所确定的起始速率的至少1％、例如至少5％、例如至少10％或20％以上，其中所述仅DNA寡核苷酸具有相同的碱基序列，但仅含有DNA单体，无2’取代，在寡核苷酸中的全部单体之间存在硫代磷酸酯连接基团，则认为反义寡核苷酸能够募集RNase H。
在一些实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果在提供互补RNA靶标和RNase H时，如以pmol/L/分钟测定的RNase H起始速率是使用等同的仅DNA寡核苷酸所确定的起始速率的1％以下、例如5％以下、例如10％以下或20％以下，其中所述等同的仅DNA寡核苷酸没有2’取代，在寡核苷酸中的全部核苷酸之间存在硫代磷酸酯连接基团，则认为反义寡核苷酸基本上不能募集RNase H。
在另外的实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果在提供互补RNA靶标和RNase H时，如以pmol/L/分钟测定的RNase H起始速率是使用等同的仅DNA寡核苷酸所确定的起始速率的至少20％、例如至少40％、例如至少60％、例如至少80％，其中所述等同的仅DNA寡核苷酸没有2’取代，在寡核苷酸中的全部核苷酸之间存在硫代磷酸酯连接基团，则认为反义寡核苷酸能够募集RNase H。
典型地，当在与互补靶标RNA的双链体中形成时，形成连续核苷酸单元的寡聚体区能够募集与RNA靶标形成DNA/RNA样双链体的核苷酸单元组成的RNase-并且包括DNA单元和LNA单元，其为α-L构型，特别优选α-L-氧基LNA。
反义寡核苷酸是单链分子并且优选不含例如至少3、4或5个连续核苷酸的短区，所述连续核苷酸与相同的反义寡核苷酸(即双链体)内的等同区互补-在这方面，所述反义寡核苷酸不是(基本上不是)双链的。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸基本上不是双链的，例如不是siRNA。在多个实施方案中，本发明的反义寡核苷酸可以完全由连续核苷酸区组成。因此，反义寡核苷酸基本上不是自补的。在多个实施方案中，本发明化合物不含RNA(单元)。优选本发明化合物是线性分子或被合成为线性分子。
所述反义寡核苷酸由0-50个、例如10-30个核苷酸长度组成或包含它们。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含总计10-22个、例如10-16个、例如10-14个、例如11-20个、例如12-18个、例如12-16个、例如13-17个或例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸长度的连续核苷酸序列或由它们组成。
为了募集RNase H，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列可以是gapmer、headmer或mixmer形式。
将“headmer”定义为包含X区和与之连续的Y区的反义寡核苷酸，其中Y区的5’-最末端单体连接至X区的3’-最末端单体。X区包含募集非-Rnase的核苷类似物的连续区段，并且Y区包含可被RNase识别和裂解的DNA单体或核苷类似物单体的连续区段(例如至少7个连续的单体)。
将“tailmer”定义为包含X区和与之连续的Y区的反义寡核苷酸，其中Y区的5’-最末端单体连接至X区的3’-最末端单体。X区包含可被RNase识别和裂解的DNA单体或核苷类似物单体的连续区段(例如至少7个连续单体)，并且X区包含募集非-Rnase的核苷类似物的连续区段。
“mixmer”由i)可被RNase识别和裂解的DNA单体或核苷类似物单体和(ii)募集非-Rnase的核苷类似物单体的交替结构组成。mixmers的实例可以在WO2005/023995中找到，并入本文作为参考。
优选地，本发明的反义寡核苷酸是gapmer。gapmer反义寡核苷酸是包含核苷酸的连续区段的反义寡核苷酸，所述核苷酸连续区段能够募集RNAse，例如RNase H，例如至少6或7个DNA核苷酸区，本文称作B区，其中在B区的5’和3’侧接增强亲和力的核苷酸类似物区，例如1-6个核苷酸类似物，5’和3’连接至能够募集RNAse的核苷酸连续区段-这些区分别称作A和A’区。A和A’区也可以称作Gapmer的翼。
优选地，gapmer包含式(5’-3’)的(多)核苷酸序列A-B-A’或任选的A-B-A’-PO或PO-A-B-A’，其中；A区(5’区翼)由至少一个核苷类似物、例如至少一个LNA单元、例如1-6个核苷类似物、例如LNA单元组成，或包含它们，B区由至少5个能够募集RNAse的连续核苷酸组成(当与互补RNA分子的双链体形成时，例如mRNA靶标)，例如DNA核苷，或包含它们；并且A’区(3’区翼)由至少一个核苷类似物、例如至少一个LNA单元、例如1-6核苷类似物、例如LNA单元组成，或包含它们；并且PO区在存在时由1-10个核苷单元、优选1-4个核苷单元、例如DNA核苷酸组成，或包含它们。
在一些实施方案中，A和A’区彼此独立地由1、2、3、4、5或6个核苷类似物、例如LNA单元、例如2-5个核苷类似物、例如2-5个LNA单元、例如2-4核苷类似物、例如2-4个LNA、例如3或4个核苷酸类似物、例如3或4个LNA单元组成。
在一些实施方案中，B由5、6、7、8、9、10、11或12个能够募集RNAse的连续核苷酸或5-12个或6-10个或7-9个、例如8个能够募集RNAse的连续核苷酸组成，或包含它们。在一些实施方案中，B区由至少一个DNA核苷单元、例如1-12个DNA单元、优选4-12个DNA单元、更优选6-10个DNA单元、例如7-10个DNA单元、最优选8、9或10个DNA单元组成，或包含它们。在一些实施方案中，能够募集RNAse的单体选自DNA单体、α-L-LNA单体、C4’烷基化DNA单体(参见PCT/EP2009/050349和Vester等人Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，并入本文作为参考)和UNA(未连接的核酸)核苷酸(参见Fluiter等人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，并入本文作为参考)。在一些实施方案中，gapmer B区中的核苷间连接包含一个或多个核苷连接，其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷基磷酸酯。优选地，B区的全部核苷间连接物是硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，用一种如下A-B-A’基序设计gapmer：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、4-7-3或1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、3-8-3、3-8-4、4-8-3、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4或1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、3-9-3、3-9-4、4-9-3或1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1、3-10-3、3-10-4、4-10-3。另外的gapmer设计公开在WO2004/046160和WO2005/023825中，将这些文献并入本文作为参考。WO2007/146511和WO2008/113832(并入本文作为参考)涉及‘shortmer’gapmer反义寡核苷酸。在一些实施方案中，此处提供的反义寡核苷酸可以是这类shortmer gapmers。
在一些实施方案中，PO区是生物可裂解的连接物，其包含至少一个通过磷酸二酯键连接至反义寡核苷酸的5’或3’端的DNA或RNA核苷或由其组成。在一些方面，第一个与第二个区之间的核苷间连接被视为PO区的部分。在一些实施方案中，PO区中的全部核苷间连接是磷酸二酯键连接。
在一些实施方案中，选择PO区中的碱基序列，以便基于存在于靶组织或细胞或亚细胞隔室中的主要内切核酸酶裂解酶提供最佳的内切核酸酶切割位点。
在一些实施方案中，PO区包含序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG的二核苷酸，其中C可以是5-甲基胞嘧啶(也称作mC)和/或T可以被U替代。在一些实施方案中，B区包含序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC和GGG的三核苷酸，其中C可以是5-甲基胞嘧啶和/或T可以被U替代。在一些实施方案中，L’区包含序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX和GGGX的三核苷酸，其中X可以选自A、T、U、G、C，其中C可以是5-甲基胞嘧啶和/或T可以被U替代。应当认为当涉及(天然存在的)核碱基A、T、U、G、C时，它们可以被作为等效天然核碱基(例如与互补核苷的碱基对)起作用的核碱基类似物取代。
可以并入本发明缀合物的示例性的核酸分子是5’-GmCattggtatTmCA-3’(大写字母＝LNA单体；小写字母＝DNA单体)。
靶标
本发明上下文中的术语“靶标”是指天然存在的细胞或细胞内的分子结构，其中所述靶标涉及药物活性分子起作用的关注的病理学。在优选的实施方案中，靶标是在调节时改变所关注的病理学的核酸序列(靶核酸)。
本文所用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物靶多肽的DNA或RNA，例如对细胞内机制例如病毒感染机制、RNA沉默或基因表达的转录后调节发挥调节作用的人靶多肽或非编码DNA或RNA分子。非编码RNA分子可以是，例如micro RNA。在优选的实施方案中，靶核酸是体外或体内存在于细胞例如哺乳动物细胞、特别是人细胞中的基因、信使RNA(mRNA)或micro RNA(miRNA)。在优选的实施方案中，细胞是在表面上包含脱唾液酸糖蛋白受体(ASPGR)的细胞，例如肝细胞和睾丸细胞，特别是肝细胞和Leydig细胞。在进一步优选的实施方案中，靶核酸是mRNA，例如前-mRNA，不过，优选成熟mRNA。优选地，靶mRNA或前-mRNA在肝细胞中表达。在一些实施方案中，例如，当用于研究或诊断时，“靶核酸”可以是cDNA或衍生自上述DNA或RNA核酸靶标的合成寡核苷酸。核酸分子(例如siRNA或反义寡核苷酸)优选能够与靶核酸杂交。
适合的药物活性分子、优选核酸分子能够调节靶核酸表达的下调(例如减少或除去)。在这方面，本发明的药物活性分子可以影响靶标的抑制，典型地是哺乳动物例如人细胞中的靶标抑制。在一些实施方案中，核酸分子结合靶核酸并且与正常表达水平相比影响至少10％或20％的表达抑制，与正常表达水平(例如在核酸分子或核酸分子缀合物不存在下的表达水平)相比更优选影响至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的抑制。可以通过测定蛋白质水平来确定表达调节，例如通过方法，例如SDS-PAGE，然后是使用针对靶蛋白产生的适合的抗体的蛋白质印迹。或者，调节表达水平可以通过测定mRNA水平、例如通过RNA印迹或定量RT-PCR来测定。
因此，本发明提供了调节、例如下调或抑制细胞中蛋白质和/或mRNA和/或microRNA表达或功能性的方法，该方法包括对所述细胞施用本发明的核酸分子缀合物，以便下调或抑制所述细胞中靶蛋白和/或mRNA和/或microRNA的表达或功能性。适合的细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞，并且优选是肝细胞。在一些实施方案中，施用可以在体外进行。在一些实施方案中，施用可以在体内进行。以足以有效治疗或预防人的障碍或调节其生理学病症的用量施用组合物。
术语“其天然存在的变体”是指天然存在于定义的分类学群体例如哺乳动物例如小鼠、猴并且优选人中的核酸序列的靶多肽的变体。典型地当涉及多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还可以涵盖编码靶标的基因组DNA的因染色体转位或复制而存在的任何等位变体，和RNA，例如从中衍生的mRNA。“天然存在的变体”也可以包括衍生自靶mRNA的可变剪接的变体。当涉及特别的多肽序列时，例如，该术语还包括蛋白质的天然存在形式，由此可以例如通过共翻译修饰或翻译后修饰例如信号肽裂解、蛋白水解裂解、糖基化等被加工。
核苷和核苷类似物
在一些实施方案中，术语“核苷类似物”和“核苷酸类似物”可以互换使用。
本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的基团(连接物基团)例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接物基团的糖苷，并且涵盖天然存在的核苷酸。例如DNA或RNA和非天然存在的核苷酸，其包含修饰的糖和/或碱基部分，本文也称作“核苷酸类似物”。在本文中，单一核苷酸(单元)也可以称作单体或核酸单元。
在生物化学领域中，术语“核苷”通常用于指包含糖部分和碱基部分的糖苷，并且因此可以在涉及核苷酸单元时使用，所述核苷酸单元通过寡聚体的核苷酸之间的核苷酸间连接物共价连接。在生物技术领域中，术语“核苷酸”通常用于指核酸单体或单元，以及如在寡核苷酸的语境下可以指碱基-例如“核苷酸序列”-典型地指核碱基序列(即暗示存在糖骨架和核苷间连接物)。同样，特别地，在其中核苷间连接物基团的一个或多个被修饰的寡核苷酸的情况中，术语“核苷酸”可以指“核苷”，例如甚至当说明核苷之间连接物的存在或性质时，可以使用术语“核苷酸”。
正如本领域技术人员可以认识到的，寡核苷酸的5’末端核苷酸不含5’核苷酸间连接物基团，不过，可以包含、也可以不含5’末端基团。
非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，例如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，例如2’取代的核苷酸。
“核苷类似物”是通过在糖和/或碱基部分上修饰的天然核苷例如DNA或RNA核苷的变体。在核酸分子的语境下，类似物主要仅可以为“沉默的”或与天然核苷“等效”，即对核酸分子发挥抑制靶基因表达的方式没有功能影响。尽管如此，这类“等效”类似物可以是有用的，例如，只要它们更为便利或低廉地制备或对储存或制备条件更稳定或代表标签或标记物。然而，优选地，类似物对其中核酸分子发挥抑制表达的方式具有功能影响；例如，通过对靶标产生增加的结合亲和力和/或对胞内核酸酶的抗性增加和/或导致更易转运入细胞。对靶标的结合亲和力增加导致具有互补RNA的核酸分子的双链体稳定性增强，其中在该双链体的熔化温度(ΔTm)方面有正向改变，即每次修饰至少+0.5℃，优选至少+1℃、1.5℃、+2℃、+2.5℃、+3℃/修饰，更优选至少+4℃/修饰，最优选至少+4.5℃/修饰。提供这类亲和力增加的类似物也称作增强亲和力的类似物。对核酸分子发挥作用的方式具有功能影响的核苷类似物的具体实例描述在例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213中并且如下所示：
因此，核酸分子可以包含天然存在的核苷的简单序列或由其组成-优选2’-脱氧核苷酸(本文通常称作“DNA”)，而且可能是核糖核苷酸(本文通常称作“RNA”)或这类天然存在的核苷和一种或多种天然存在的核苷酸的组合，即核苷酸类似物。天然存在的核苷可以包含天然核苷间连接物，例如磷酸二酯或稳定的连接物，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯或这些连接物的混合物。核苷酸类似物可以适当地增强核酸分子对靶序列的亲和力。
适合的并且优选的核苷酸类似物的实例由WO2007/031091提供或在其中涉及。
术语“LNA”是指双环核苷类似物，称作“锁定核酸”。它可以指LNA单体，或在“LNA寡核苷酸”语境下使用时，LNA是指包含一个或多个这类双环核苷酸类似物的寡核苷酸。LNA核苷酸的特征在于在核糖环的C2’与C4’之间存在连接物基团(例如桥)-例如如下所述的双基R4*-R2*所示。
用于本发明寡核苷酸化合物的LNA优选具有式(VIII)的结构，
其中对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在；
其中X选自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-，例如，在一些实施方案中，-O-；
B选自氢、任选取代的C1-4-烷氧基、任选取代的C1-4-烷基、任选取代的C1-4-酰基氧基、核碱基包括天然存在的和核碱基类似物、DNA嵌合剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体，优选B是核碱基或核碱基类似物；
P表示相邻单体的核苷酸间连接物或5’-末端基团，这类核苷酸间连接物或5’-末端基团任选包括取代基R5或等同适用的取代基R5*；
P*表示相邻单体的核苷酸间连接物或3’-末端基团；
R4*和R2*一起表示由1-4个基团/原子组成的二价连接物，所述基团/原子选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，其中Z选自-O-、-S-和-N(Ra)-，并且Ra和Rb各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、任选取代的C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、砜基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌合剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个孪位取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在，并且；
存在的取代基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6和R6*各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、砜基、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌合剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个孪位取代基可以一起表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基；
其中RN选自氢和C1-4-烷基，并且其中两个相邻(非孪位)取代基可以表示产生双键的另外的键；并且RN*在存在并且不涉及双基时选自氢和C1-4-烷基；和其碱式盐和酸加成盐。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示由选自C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-和C(RaRb)-C(RaRb)-O-的基团组成的双基，其中Ra和Rb各自可以任选地独立地选择。在一些实施方案中，Ra和Rb可以任选独立地选自氢和C1-6烷基，例如甲基，例如氢。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基-O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem)-为R-或S-构型。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基-O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem)-为R-或S-构型。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基-O-CH(CH3)-。-为R-或S-构型。在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基-O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基-O-NR-CH3--(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。
在一些实施方案中，LNA单元具有选自如下基团的结构：
在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。
在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*是氢。
在一些实施方案中，R1*、R2、R3独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。
在一些实施方案中，R1*、R2、R3是氢。
在一些实施方案中，R5和R5*各自独立地选自H、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3和-CH＝CH2。适合地，在一些实施方案中，R5或R5*是氢，而另一个基团(分别是R5或R5*)选自C1-5烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6链烯基、取代的C2-6炔基或取代的酰基(-C(＝O)-)；其中取代的基团各自被取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2或N(H)C(＝X)N(H)J2，其中X是O或S；并且J1和J2各自独立地是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、C1-6氨基烷基、取代的C1-6氨基烷基或保护基。在一些实施方案中，R5或R5*是取代的C1-6烷基。在一些实施方案中，R5或R5*是取代的亚甲基，其中优选的取代基包括一个或多个基团，其独立地选自F、NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2或N(H)C(O)N(H)J2。在一些实施方案中，J1和J2各自独立地为H或C1-6烷基。在一些实施方案中，R5或R5*是甲基、乙基或甲氧基甲基。在一些实施方案中，R5或R5*是甲基。在进一步的实施方案中，R5或R5*是乙烯基。在一些实施方案中，R5或R5*是取代的酰基。在一些实施方案中，R5或R5*是C(＝O)NJ1J2。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。这类5’修饰的双环核苷酸公开WO 2007/134181中，将该文献以其完整的形式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，涉及核苷和核苷酸及其类似物的B是核碱基，包括核碱基类似物和天然存在的核碱基，例如嘌呤或嘧啶，或取代的嘌呤或取代的嘧啶，例如本文涉及的核碱基，例如核碱基选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶和/或修饰的或取代的核碱基，例如5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并(thiozolo)-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基，其选自-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)＝C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-和-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、砜基、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌合剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个孪位取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。
在进一步的实施方案中，R4*和R2*一起表示双基(二价基团)，其选自-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH＝CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-和-CH(CH2-O-CH3)-O-和/或-CH2-CH2-和-CH＝CH-。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基C(RaRb)-N(Rc)-O-，其中Ra和Rb独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基，例如氢，并且其中Rc选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基，例如氢。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-，其中Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基，例如氢。
在一些实施方案中，R4*和R2*形成双基-CH(Z)-O-，其中Z选自C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6链烯基、取代的C2-6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫羟基或取代的硫代；并且其中取代基团各自独立地被任选被保护的取代基单或多取代，所述任选被保护的取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中J1、J2和J3各自独立地是H或C1-6烷基，并且X是O、S或NJ1。在一些实施方案中，Z是C1-6烷基或取代的C1-6烷基。在一些实施方案中，Z是甲基。在一些实施方案中，Z是取代的C1-6烷基。在一些实施方案中，所述取代基是C1-6烷氧基。在一些实施方案中，Z是CH3OCH2-。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。这类双环核苷酸公开在US 7,399,845中，将该文献以其完整的形式并入本文作为参考。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*是氢。在一些实施方案中，R1*、R2、R3*是氢，并且R5、R5*之一或它们两者可以如上述和WO 2007/134181所涉及的不是氢。
在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示在桥中包含取代的氨基的双基，例如由双基-CH2-N(Rc)-组成或包含它们，其中Rc是C1-12烷氧基。在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基-Cq3q4-NOR-，其中q3和q4独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基；其中取代的基团各自独立地被取代基单-或多-取代，所述取代基独立地选自卤素、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2或N(H)C(＝X＝N(H)J2，其中X是O或S；并且J1和J2各自独立地是H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6氨基烷基或保护基。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。这类双环核苷酸公开在WO2008/150729中，将该文献以其完整的形式并入本文作为参考。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*是氢。在一些实施方案中，R1*、R2、R3是氢，并且R5、R5*之一或它们两者可以如上述和WO 2007/134181中所涉及的不是氢。在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示双基(二价基团)C(RaRb)-O-，其中Ra和Rb各自独立地是卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12链烯基、取代的C2-C12链烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)NJ1J2、C(＝O)J1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2；或者Ra和Rb一起为＝C(q3)(q4)；q3和q4各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；取代的基团各自独立地被取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)NJ1J2、C(＝O)J1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2，并且J1和J2各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、C1-C6氨基烷基、取代的C1-C6氨基烷基或保护基。这类化合物公开在WO2009006478A中，将该文献以其完整的形式并入本文作为参考。
在一些实施方案中，R4*和R2*形成双基-Q-，其中Q是C(q1)(q2)C(q3)(q4)、C(q1)＝C(q3)、C[＝C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)或C(q1)(q2)-C[＝C(q3)(q4)]；q1、q2、q3、q4各自独立地是H、卤素、C1-12烷基、取代的C1-12烷基、C2-12链烯基、取代的C1-12烷氧基、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)-NJ1J2、C(＝O)J1、-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2；J1和J2各自独立地是H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6氨基烷基或保护基；并且任选地，其中当Q是C(q1)(q2)(q3)(q4)并且q3或q4之一是CH3时，q3或q4的另一个或q1和q2之一的至少一个不是H。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*是氢。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。这类双环核苷酸公开在WO2008/154401中，将该文献以其完整的形式并入本文作为参考。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、取代的C2-6链烯基、C2-6炔基或取代的C2-6炔基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-6氨基烷基或取代的C1-6氨基烷基。在一些实施方案中，R1*、R2、R3、R5、R5*是氢。在一些实施方案中，R1*、R2、R3是氢，并且R5、R5*之一或它们两者可以如上述和WO 2007/134181或WO2009/067647(α-L-双环核酸类似物)中所涉及的不是氢。
另外的双环核苷类似物及其在反义寡核苷酸中的应用公开在WO2011/115818、WO2011/085102、WO2011/017521、WO2009/100320、WO2010/036698、WO2009/124295和WO2009/006478中。这类核苷类似物在一些方面中可以用于本发明的核酸分子。
在一些实施方案中，用于核酸分子的LNA优选具有通式(IX)的结构：
其中Y选自-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)和/或-CH2-；Z和Z*独立地选自核苷酸间连接物、RH、末端基团或保护基；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分(核碱基)，并且RH选自氢和C1-4-烷基；Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、砜基、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌合剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个孪位取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)；并且RH选自氢和C1-4-烷基。在一些实施方案中，Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选独立地选自氢和C1-6烷基，例如甲基。对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S方向存在。例如，两种示例性立体化学异构体包括β-D和α-L异构体(isoforms)，其可以如下示例：
具体的示例性LNA单元如下所示：
术语“硫代-LNA”包括锁定核苷酸，其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-。硫代-LNA可以为β-D和α-L-构型。
术语“氨基-LNA”包括锁定核苷酸，其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以为β-D和α-L-构型。
术语“氧基-LNA”包括锁定核苷酸，其中上述通式中的Y表示-O-。氧基-LNA可以为β-D和α-L-构型。
术语“ENA”包括锁定核苷酸，其中上述通式中的Y是-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子连接至相对于碱基B的2’-位)。Re是氢或甲基。
在一些示例性的实施方案中，LNA选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA，特别是β-D-氧基-LNA。
核酸分子中并入增强亲和力的核苷酸类似物例如LNA或2’-取代的糖可以使得特异性结合核酸分子的尺寸减小，并且还可以将上限降至非特异性或异常结合发生前核酸分子的尺寸。
在一些实施方案中，核酸分子包含至少1个核苷类似物。在一些实施方案中，核酸分子包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，核酸分子包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在迄今为止最优选的实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一个是锁定核酸(LNA)；例如，核苷酸类似物的至少3个或至少4个或至少5个或至少6个或至少7个或8个可以是LNA。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物可以为LNA。
应当理解，当涉及优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，其仅由核苷酸组成，由该序列定义的本发明的核酸分子可以包含相应的替代一个或多个存在于所述序列中的核苷酸的核苷酸类似物，例如LNA单元或另外的核苷酸类似物，其升高核酸分子/靶双链体的双链体稳定性/Tm(即增强亲和力的核苷酸类似物)。
在一些实施方案中，核酸分子的核苷酸序列与靶序列之间的任何错配优选在增强亲和力的核苷酸类似物之外的区中发现，例如本文涉及的B区和/或本文涉及的L区和/在未修饰的位点上，例如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在为连续核苷酸序列的5’或3’的区中。
核苷酸的这类修饰的实例包括修饰糖部分，得到2’-取代基；或产生桥连(锁定核酸)结合，其增强结合亲和力并且还可以提供增加的核酸酶抗性。
优选的核苷酸类似物是LNA，例如氧基-LNA(例如β-D-氧基-LNA和α-L-氧基-LNA)和/或氨基-LNA(例如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(例如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(例如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的是β-D-氧基-LNA。
在一些实施方案中，存在于本发明核酸分子内的核苷酸类似物(例如本文提及的A和C区中)独立地选自，例如：2’-O-烷基-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、阿拉伯核酸(arabino nucleic acid)(ANA)单元、2’-氟-ANA单元、HNA单元、INA(嵌入核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30：4918-4925,并入本文作为参考)单元和2’MOE单元。在一些实施方案中，仅存在上述类型的存在于本发明核酸分子中的核苷酸类似物之一或其连续的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核苷酸类似物是2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)、2’-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，并且因此本发明的寡核苷酸可以包含核苷酸类似物，其独立地选自这三种类型的类似物或者可以仅包含选自三种类型的一种类型的类似物。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种是2’-MOE-RNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一个是2’-氟DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含至少一个锁定核酸(LNA)单元，例如1，2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，例如3-7个或4-8个LNA单元或3、4、5、6或7个LNA单元。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物是LNA。在一些实施方案中，核酸分子可以包含β-D-氧基-LNA和如下LNA单元的一个或多个：硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA和/或ENA，β-D或α-L构型，或其组合。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元是5’甲基-胞嘧啶。在本发明的一些实施方案中，核酸分子可以包含LNA和DNA单元二者。优选地，合并的LNA和DNA单元总计为10-25、例如10-24、优选10-20、例如10-18、甚至更优选12-16。在本发明的一些实施方案中，核酸分子的核苷酸序列、例如连续核苷酸序列由至少一个LNA组成，并且其余核苷酸单元为DNA单元。在一些实施方案中，核酸分子仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(例如RNA或DNA，最优选DNA核苷酸)，任选与修饰的核苷酸间连接物，例如硫代磷酸酯。
术语“核碱基”是指核苷酸的碱基部分并且涵盖天然存在的以及非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅涵盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，还涵盖其杂环类似物和互变异构体。
核碱基的实例包括、但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
在一些实施方案中，存在于核酸分子中的核碱基的至少一个是修饰的核碱基，其选自5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
核苷酸间连接物
本文所述的核酸分子的单体通过连接物偶联在一起。适合地，每个单体通过连接物基团连接至3’相邻单体。
本领域普通技术人员可以理解，在本发明的上下文中，核酸分子末端上的5’单体不含5’连接物基团，不过，它可以包含、也可以不含5’末端基团。
术语“连接物基团”或“核苷酸间连接物”预期是指能够将两个核苷共价偶联在一起的基团。特别和优选的实例包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基团。
本发明核酸分子或其连续核苷酸序列的核苷通过连接物偶联在一起。适合地，每个核苷通过连接物基团连接至3’相邻核苷。
适合的核苷酸间连接物包括WO2007/031091中列出的那些，例如WO2007/031091的第34页的第一段列出的核苷酸间连接物(并入本文作为参考)。
在一些实施方案中，优选从其正常的磷酸二酯到对核酸酶攻击更具有抗性的磷酸二酯例如硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯修饰核苷酸间连接物-这两种核苷酸间连接物可被RNase H裂解，也允许在减少靶基因表达的过程中反义抑制的途经。
可以优选如本文提供的适合的包含硫(S)的核苷酸间连接物。还优选硫代磷酸酯核苷酸间连接物，特别对于gapmers的间隙区(B)。硫代磷酸酯连接物还可以用于侧翼区(A和A’，并且用于连接A或A’至L和如果适合在L区内)。
但是，A、B和A’区可以包含非硫代磷酸酯的核苷酸间连接物，例如磷酸二酯连接物，特别地，例如，当应用核苷酸类似物防止A和A’区内的核苷酸间连接物发生内切核酸酶降解时-例如当A和A’区包含LNA核苷酸时。
核酸分子的核苷酸间连接物可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯，以便允许靶向的RNA的RNase H裂解。对于改善的核酸酶抗性和其它原因，例如易于制备，优选硫代磷酸酯。
在本发明核酸分子的一个方面中，核苷和/或核苷类似物通过硫代磷酸酯基团彼此连接。
认为包含磷酸二酯连接物、例如一个或两个连接物进入另外的硫代磷酸酯核酸分子、特别是在核苷类似物单元之间或与之相邻(典型地在A和或A’区中)可以修饰核酸分子的生物利用度和/或生物分布-参见WO2008/113832，该文献并入本文作为参考。
在一些实施方案中，例如上述涉及的实施方案中，如果适合并且没有特别地指示，则所有其余的连接物基团均为磷酸二酯或硫代磷酸酯或其混合物。
在一些实施方案中，所有核苷酸间连接物基团均为硫代磷酸酯。
当涉及特别的gapmer反义寡核苷酸序列时，例如本文提供的那些，应当理解，在多个实施方案中，当连接物为硫代磷酸酯连接物时，可以应用可选择的连接物例如本文公开的那些，例如可以使用磷酸酯(磷酸二酯)，特别是对于核苷类似物例如LNA单元之间的连接物。同样，当涉及特别的gapmer寡核苷酸序列时，例如本文提供的那些。当C残基被定义为5’甲基修饰的胞嘧啶时，在多个实施方案中，存在于核酸分子中的Cs的一个或多个可以为未修饰的C残基。
WO2009/124238涉及寡聚化化合物，其具有至少一个通过中性核苷间连接物连接至3’或5’末端的双环核苷。因此，本发明的核酸分子可以具有至少一个双环核苷，其通过中性核苷间连接物连接至3’或5’末端，例如一个或多个磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲乙缩醛或硫代甲乙缩醛。其余连接物可以是硫代磷酸酯。
组合物
本发明化合物可以用于药物制剂和组合物中。适合地，这类组合物包含可药用稀释剂、载体、盐或佐剂。WO2007/031091提供了适合的和优选的可药用稀释剂、载体和佐剂-该文献并入本文作为参考。适合的剂量、制剂、施用途经、组合物、剂型、与另外的治疗剂的组合、前药制剂也提供在WO2007/031091中-也并入本文作为参考。
应用
本发明化合物可以用作研究试剂，例如用于诊断、治疗和预防。
在疗法中，本发明化合物可以用于特异性地调节细胞中靶蛋白的合成(典型地通过降解或抑制mRNA并且由此防止蛋白质形成)。
或者，在疗法中，本发明化合物可以用于调节对细胞和试验动物中细胞内机制发挥调节作用的非编码DNA或RNA分子，由此有利于靶标的功能分析，或其作为治疗介入的靶标的有用性评价。
在优选的实施方案中，细胞是在表面上包含脱唾液酸糖蛋白受体(ASPGR)的细胞，例如肝细胞和睾丸细胞，特别是肝细胞和莱迪希细胞。
对于治疗而言，可以通过调节编码哺乳动物靶多肽例如人靶多肽的DNA或RNA或通过调节非编码DNA或RNA分子缓解或治疗疑似具有疾病或障碍的动物或人，所述非编码DNA或RNA分子对细胞内的机制例如病毒感染机制、RNA沉默或基因表达的转录后调节发挥调节作用。非编码RNA分子可以是，例如micro RNA。在优选的实施方案中，靶核酸是基因、信使RNA(mRNA)或micro RNA(miRNA)。
进一步提供了治疗疑似具有或倾向于发生疾病或病症的哺乳动物、例如治疗人的方法，通过施用治疗或预防有效量的本发明化合物或组合物的一种或多种来进行。本发明的核酸缀合物或药物组合物典型地以有效量施用。
特别地，式(III)化合物可以用于本发明的应用中。
本发明还提供了如所述的本发明化合物或缀合物在制备用于治疗障碍的药物或治疗如通过调节靶核酸影响的障碍的方法中的用途。
本发明还提供了用于治疗障碍的方法，该方法包括给需要的患者施用本发明化合物和/或本发明药物组合物。
所治疗的障碍的实例是肝疾病例如肝炎(包括病毒性肝炎，例如HBV或HCV)、肝脂肪变性、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症例如载脂蛋白B中功能突变增加、HDL/LDL胆固醇失调、血脂异常例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、他汀类抗性高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、肝硬化和癌症。
本发明进一步通过如下实施例说明。
实施例
实施例1：GalNAc亚磷酰胺的合成：
β-GalNAc亚磷酰胺的合成
步骤1
在室温将叔丁基二苯基甲硅烷基氯(TBDPSCl)(2.6mL，10mmol)滴加到乙二醇(3.4mL，60.7mmol)和吡啶(3.4mL，42.2mmol)的混合物中。搅拌3.5小时后，用EtOAc(50mL)稀释该反应混合物。用水(30mL)、20％NaHCO3(30mL)、盐水(30ml)萃取有机相，经Na2SO4干燥，并且蒸发。通过DCVC色谱法(洗脱液在己烷中的EtOAc 10％-25％)纯化残留物。分离产物(TBDPS二醇)，为白色固体，2.54g，产率84％。
步骤2
向过乙酰化半乳糖胺(1.63g，4.17mmol)在30mL DCM中的混悬液中加入TMSOTf(1.90mL，10.4mmol)，并且将反应混合物在40-45℃搅拌5小时。再加入部分TMSOTf(0.30mL，2.8mmol)，并且将该反应混合物再搅拌16小时。然后在0℃用NEt3(0.90mL)使反应猝灭，并且用DCM稀释，用冷饱和NaHCO3(2×100mL)、盐水(50mL)萃取，经Na2SO4干燥，并且蒸发。分离产物1，为黄色油状物，1.40g粗产率。
步骤3
将1(1.40g，4.17mmol)和TBDPS二醇(1.08g，1.60mmol)溶于20mL DCE中。加入樟脑-磺酸(CSA)(84mg，0.36mmol)，并且将该反应混合物在70-75℃搅拌2小时。再加入CSA(84mg，0.36mmol)，并且将该反应混合物在70-75℃再搅拌2小时。在室温向该反应混合物中加入NEt3(80μL)，然后用DCM(20mL)稀释。用饱和NaHCO3(100mL)、水(100mL)、盐水(50mL)洗涤该混合物，并且经Na2SO4干燥有机相，并且蒸发。通过柱色谱法纯化得到的残留物(洗脱液：在己烷中的EtOAc 30％-50％)。分离产物，为白色泡沫状物(1.59g，产率70％)，1H-NMR和MS，HPLC 99％。
步骤4
将NEt3*3HF(1.2mL，7.4mmol)加入到2(776mg，1.23mmol)和NEt3(0.44mL，3.07mmol)在12mL THF中的溶液中。搅拌该反应混合物，并且在室温搅拌20小时，然后蒸发。通过柱色谱法纯化残留物(洗脱液：在DCM中的MeOH 4％-10％)。分离3，为白色固体416mg，产率86％，1H-NMR。
步骤5
向3(1.51g，3.87mmol)在DCM(60mL)和MeCN(4mL)中的溶液中加入DCI(320g，2.71mmol)在MeCN(2mL)中的溶液，然后添加PN2(1.42g，4.47mmol)在DCM(2.5mL)中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌4小时。加入DCM(30mL)，并且用NaHCO3(2×100mL)、水/盐水1/1(50mL)洗涤该反应混合物，经Na2SO4干燥，并且蒸发。通过柱色谱法纯化残留物(洗脱液DCM+3％NEt3)，然后通过第二次柱色谱法纯化(EtOAc/己烷)。
分离产物，为黄色油状物(1.02g，产率44％)。31P-NMR(160MHz)：(DMSO-d6)δ：147.5,147.1。1H-NMR(400MHz)：(DMSO-d6)δ：7.80(1H,d,J＝9.0Hz),5.22(1H,d,J＝3.1Hz),4.97(1H,dd,J＝11.3,3.1Hz),4.57(1H,dd,J＝9.0,1.6Hz),4.08-3.99(3H,m),3.98(1H,m),3.83-3.50(8H,m),2.81-2.71(2H,m),2.10(3H,s),1.99(3H,s),1.89(3H,s),1.77(3H,d,J＝1.6Hz),1.17-1.09(12H,m)。13C-NMR(100MHz)：(DMSO-d6)δ：170.41,170.33,170.04,169.64,119.44,101.37,70.92,70.33,69.13,67.14,62.34,62.17,61.89,58.86,58.69,49.70,42.94,42.92,42.82,42.80,24.84,24.78,24.76,24.70,23.26,23.23,20.94,20.87,20.84,20.29,20.22。
另外参见图3a-c。
TEG β-GalNAc亚磷酰胺的合成：
步骤6
在室温将TBDPSCl(9.1mL，35mmol)滴加到乙二醇(28.4mL，210mmol)和吡啶(11.3mL)的混合物中。搅拌2小时后，用EtOAc(150mL)稀释该反应混合物，用水(100mL)、盐水(100mL)萃取，经Na2SO4干燥，并且蒸发。通过DCVC色谱法(洗脱液：在己烷中的EtOAc 10％-30％)纯化残留物。分离TBDPS三甘醇，为粘性油状物，10.7g，产率79％。
步骤7
向1(app 7.4g，20.6mmol)和TBDPS三甘醇(6.68g，17.2mmol)在DCE(130mL)中的混合物中加入樟脑-磺酸(CSA，0.40，1.72mmol)，并且将该反应混合物在70-75℃搅拌18小时。在室温向该反应混合物中加入NEt3(0.48mL)，然后用DCM(80mL)稀释，用饱和NaHCO3(2×100mL)、水(100ml)、盐水(100mL)萃取，经Na2SO4干燥，并且蒸发。通过色谱法纯化残留物(洗脱液：在己烷中的EtOAc 66％-80％)。分离2，为淡黄色油状物8.90g，1H-NMR，MS[M+1]+718，HPLC纯度95％，产率69％。
步骤8
向2(8.90g，12.4mmol)在THF(125mL)中的溶液中加入NEt3(4.3mL，31mmol)和NEt33HF(12mL，74mmol)。将该反应混合物在室温搅拌24小时，然后蒸发。通过柱色谱法纯化残留物(洗脱液：在DCM中的MeOH 4％-9％)。分离3，为淡黄色油状物4.40g，1H-NMR，产率71％。
步骤9
向3(4.4g，9.18mmol)在DCM(100mL)和MeCN(3.5mL)中的溶液中加入DCI在MeCN中的溶液(6mL)，然后加入PN2(3.18，10.6mmol)在DCM(5mL)中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌22小时(不完全转化)。加入DCM(45mL)，并且用NaHCO3(2×100mL)、水/盐水1/1(50mL)萃取该反应混合物，经Na2SO4干燥，并且蒸发。通过柱色谱法纯化残留物(洗脱液：EtOAc/己烷1/4+9％NEt3)。再生成1.52g的3，通过相同方法转化成4(PN2 1.09g 3.64.6mmol，0.26g 2.22mmol，DCM 35mL，MeCN3.5mL，反应时间24小时)，并且与不纯级分一起从第一次色谱法中纯化。分离4，为淡黄色油状物2.45g，产率38％，31P-NMR(160MHz)：(DMSO-d6)δ：147.3；1H-NMR(400MHz)：(DMSO-d6)δ：7.79(1H,d,J＝9.0Mz),5.21(1H,d,J＝3.5Hz),4.97(1H,dd,J＝11.3,3.5Hz),4.55(1H,d,J＝8.6Hz),4.11-3.97(3H,m),3.88(1H,m),3.81-3.47(16H,m),2.78-2.74(2H,m),2.11(3H,s),2.00(3H,s),1.89(3H,s),1.77(3H,s),1.16-1.10(12H,m)。MS[M+1]+680.5。
另外参见图3d-e
GalNAc亚磷酰胺的异头混合物的可选合成
在0℃将乙酰氯滴加到NAcGal和TBDPS二醇在DMF中的溶液中。将该反应混合物在70℃搅拌至完成。将该反应混合物冷却至0℃，并且用过量无水吡啶猝灭。使该反应混合物达到室温，并且加入过量乙酸酐。将该混合物搅拌至完成，基于Medina等人,Biomaterials 32(2011),4118-4129(并入本文作为参考)。
可以使该组合物进行上述反应步骤4和5，得到GalNAc亚磷酰胺的异头混合物，即包含α-和β-GalNAc。如果α-GalNAc亚磷酰胺是期望的，则可以将其从异头混合物中纯化。
实施例2：使用GalNAc亚磷酰胺并入合成寡核苷酸
在NittoPhase Unylinker 200支持物上，采用亚磷酰胺方法以20μmol等级合成寡核苷酸。在合成结束时，在60℃采用浓氢氧化铵从固体支持物上裂解寡核苷酸16小时。通过反相HPLC纯化寡核苷酸，并且用UPLC表征，并且进一步通过ESI-MS证实分子量。
寡核苷酸的延长：
通过采用0.1M亚磷酰胺的乙腈溶液和DCI(4,5–二氰基咪唑)的乙腈溶液(0.25M)作为激活剂偶联β-氰基乙基-亚磷酰胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T、GalNAc亚磷酰胺X和Y和间隔物亚磷酰胺C3和间隔物18(Glen Research,Sterlin g，VA)。采用苍耳烷氢化物(0.01M，在乙腈/吡啶9:1中)进行引入硫代磷酸酯连接物的硫醇化。采用在THF/吡啶/水7:2:1中的0.02M碘引入磷酸二酯连接物。其余试剂典型地是用于寡核苷酸合成的试剂。
通过RP-HPLC纯化：
通过采用Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10mm柱的制备型反相HPLC纯化粗化合物。0.1M乙酸铵pH 8和乙腈用作缓冲液，流速为5mL/分钟。冻干收集的级分，得到纯化的化合物，典型地为白色固体。
已经采用如下寡核苷酸序列5’GmCattggtatTmCA-3’(SEQ ID NO：1)或5’caGmCattggtatTmCA-3’(SEQ ID NO：2)合成了表1中的GalNac-核酸化合物。SEQ ID NO：1中的所有连接物为硫代磷酸酯连接物。在SEQ ID NO：2中，前2个核苷(ca)通过磷酸二酯连接物连接，其余连接物为硫代磷酸酯连接物。大写字母表示LNA单体(mC是5-甲基胞嘧啶LNA单体)并且小写字母是DNA单体。
表1：
对照化合物是SEQ ID NO：1的未缀合的寡核苷酸(即无任何连接的GalNAc部分)。GalNAc2化合物是连接至如下所示的GalNAc2簇的SEQ ID NO：1，寡核苷酸被表示为波状线，并且连接至带有硫代磷酸酯基团的GalNAc2构建体。结合至GalNAc2簇的寡核苷酸描述在WO 2014/118267中，并且该化合物相当于WO 2014/076196(并入本文作为参考)中的SEQ ID NO：20。
实施例3：体内使用GalNAc-缀合物敲除ApoB mRNA和总胆固醇
为了比较不同GalNAc构建体的作用，给C57BL6/J小鼠皮下注射单剂量的盐水或0.25mg/kg GalNAc2簇缀合的LNA-反义寡核苷酸(GalNAc2)或等摩尔量的与本发明GalNAc构建体缀合的LNA反义寡核苷酸(图6E、I、M和N)或未缀合的LNA反义寡核苷酸(参见实施例2，表1的详细描述)，并且在第10天时处死，其中分离肝和肾。
在包含5只体重约为20g的小鼠的动物组中试验每种化合物。在第3天和第7天时采集血清样品(50microL/小鼠)，并且在处死时采集总血清用于如下文方案中所述测定总血清胆固醇。结果如图8中所示。
在处死时，从肝和肾中分离RNA并且使用ApoB特异性引物和探针进行qPCR，以便分析如以下方案中所述的ApoB mRNA敲除。结果如图7中所示。
结论：
所有GalNAc缀合的LNA寡核苷酸与未缀合的ApoB靶向LNA寡核苷酸相比显示肝中ApoB mRNA的敲除改善(图7)。使用GalNAc亚磷酰胺构建的新化合物(图6E、I、M和N)对目标mRNA(ApoB mRNA)表现出与表现出不同连接物长度的GalNAc2簇(GalNAc2)相差无几的作用，并且GalNAc缀合部分的设计被ASGP受体耐受。肾中ApoB mRNA的下调(图7B)是未缀合的LNA寡核苷酸(对照)高于GalNAc缀合的化合物(图6E、I、M和N和GalNAc2)，这启示如所预计的，GalNAc部分改善了LNA寡核苷酸的肝摄取并且减少了其肾摄取。与未缀合的LNA寡核苷酸相比，所有GalNAc缀合的LNA寡核苷酸对总胆固醇水平的降低作用(图8)均得到改善。
材料和方法：
ApoB mRNA敲除的分析：用70％CO2-30％O2麻醉动物，并且通过脱颈椎处死。切碎一半大的肝脏叶片和一个肾并且浸入RNAlater。
从最大30mg组织/样品中提取总RNA，在裂解缓冲液(MagnaPure LC RNA分离组织缓冲液(#03604721001；Roche))的存在下，根据制造商的说明通过珠-研磨匀化。用MagnaPure 96系统；采用Roche的细胞RNA大体积试剂盒(#05467535001；Roche)，根据制造商的标准方案纯化RNA。采用来自Ambion的逆转录酶试剂，根据制造商的说明进行第一链合成。
对于每份样品，用不含RNase的H2O将0.5μg总RNA调整至(10.8μL)，并且与2μL随机十倍体(50μM)和4μL dNTP混合物(各2.5mM dNTP)混合，并且加热至70℃达3分钟，此后，用冰快速冷却样品。向每份样品中加入2μL 10x Buffer RT、1μL MMLV逆转录酶(100U/μL)和0.25μL RNase抑制剂(10U/μL)，随后在42℃温育60分钟，在95℃热灭活酶10分钟，然后将样品冷却至4℃。按照1:5稀释cDNA样品，并且采用Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x(Applied Biosystems Cat #4364103)和Taqman基因表达测定法(mApoB,Mn01545150_m1和mGAPDH#4352339E)，根据制造商的方案进行RT-QPCR，并且用Applied Biosystems RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)以快速模式处理。
血清胆固醇分析：处死前即刻采用S-monovette血清-凝胶小瓶(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)收集眶后窦血液用于血清制备。采用ABX Pentra Cholesterol CP(Triolab,Brondby,Denmark)，根据制造商的说明，分析血清的总胆固醇。
项目
本发明的特征进一步在于如下项目：
项目1：具有通式(I)的化合物，
其中
NR’R”是仲氨基，其中R’和R”独立地选自C1-C6-烷基，或者R’和R”一起形成5-或6-元环，其可以被取代并且可以包含另一个选自N和O的杂原子；
A是C1-C6-烷基或被保护的羟基-或硫代-基团；并且
G表示为通式(II)
其中A1是适合的羟基保护基，其在每次出现时可以是相同的或不同的；并且
L是连接物基团，其选自C3-C19-亚烷基但不是C6亚烷基、C2-C30-亚链烯基、-CH2CH2-(OCH2CH2)0-4-OCH2CH2-和CH2CH2-(OCH2CH2)6-8-OCH2CH2。
项目2：项目1的化合物，其中连接物基团L选自C7-C19-亚烷基、C2-C20-亚链烯基和-CH2CH2-(OCH2CH2)0-3-OCH2CH2-。
项目3：项目1或2的化合物，其中连接物L选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。
项目4：项目1-3任一项的化合物，其中连接物L选自-(CH2)2-、-(CH2)3-和-(CH2)8-。
项目5：项目1-3任一项的化合物，其中连接物L选自CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-。
项目6：项目1-5任一项的化合物，其中GalNAc部分为β构型。
项目7：项目1-6任一项的化合物，其中仲氨基-NR’R”选自二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷子基、哌啶子基、2,6-二甲基哌啶子基、吗啉代、咪唑基和4-甲基咪唑基。
项目8：项目1-7任一项的化合物，其中A选自2-氰基乙氧基、2-氰基乙硫基、甲氧基、乙氧基、S-异丁酰基-2-(2-巯基乙氧基)乙氧基、S-新戊酰基-2-(2-巯基乙氧基)乙氧基、S-新戊酰基-2-巯基乙氧基、甲基和乙基。
项目9：项目1-8任一项的化合物，其中羟基保护基A1选自酰基和甲硅烷基，优选选自乙酰基、苯甲酰基、苯氧基-乙酰基、新戊酰基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、异丁酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和异丙基二甲基甲硅烷基。
项目9a：项目1-9任一项的化合物，其中糖6位上的羟基保护基A1是二甲氧基三苯甲基(DMT)。
项目10：项目1-9a任一项的化合物，其中
A是-O-CH2CH2CN，A1是乙酰基，R’和R”各自是异丙基，并且L选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-，优选选自-(CH2)2-和-(CH2)3-。
项目11：具有通式(III)的化合物
其中
Z是核酸分子；
T表示为通式(IV)或可选择地表示为通式(VI)；
其中
R2表示H或-(CH2)q-R1；
R1和R3在每次出现时表示通为(V)；
其中在每次出现时独立地
V选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
W选自-(CH2)2-15-和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-；
Y是O或S；
m是1至3的整数；
n是0至5的整数；
p是0至3的整数；并且
q是1至2的整数；
r是1至5的整数；
其中式(V)和(VI)中在每次出现时独立地
s是0或1；
G表示为通式(II)’
其中A1是H或适合的羟基保护基，其在每次出现时可以是相同的或不同的；并且L选自C2-C20-亚链烯基、-CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-；并且
式(III)、(V)和(VI)中在每次出现时独立地
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是-O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH，
其中从式(VI)中R1、R3或R2(如果R2不是H)上的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)或核酸分子(如果T表示为式(VI))中的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
项目12：项目11的化合物，其中s是1。
项目13：项目11的化合物，其中s是0。
项目14：项目11的化合物，其中T表示为式(VI)，并且s是0。
项目15：项目11-14任一项的化合物，其中式(II’)上的GalNac部分为β构型。
项目16：项目11-15任一项的化合物，其中W选自-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-、-CH2CH2CH2-和-(CH2)12-。
项目17：项目11-16任一项的化合物，其中在每次出现时独立地
X1是-OH，并且X2是＝O；或者
X1是O-，并且X2是＝O；或者
X1是-OH，并且X2是＝S；或者
X1是O-，并且X2是＝S；或者
X1是＝S，并且X2是-SH。
项目18：项目11-17任一项的化合物，其中从R1、R3或R2(如果R2不是H)上的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IV)中的分支点碳原子的连续链
具有9至23个原子长度。
项目19：项目11-18的化合物，其中核酸分子选自DNA、RNA和核酸类似物分子，特别地选自反义寡核苷酸、小干扰RNAs和microRNAs。
项目20：项目11-19的化合物，其中核酸分子包含锁定核酸核苷酸。
项目21：项目11-20的化合物，其中核酸分子包含一个或多个硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯核苷间连接物。
项目22：项目11-21的化合物，其中所有DNA和RNA核苷与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。
项目23：项目11-22的化合物，其中核酸分子中的所有核苷和/或核苷类似物与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。
项目24：项目11-23任一项的化合物，其中核酸分子的5’端连接至GalNAc缀合部分。
项目25：项目11-24的化合物，其中PO连接物位于核酸和GalNAc缀合部分之间。
项目26：项目11-25的化合物，其中该化合物能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
项目27：用于制备项目1-9任一项的化合物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)以立体选择性方式在N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)的碳原子1与2之间形成内部唑啉环；
(ii)使步骤(i)的产物与具有通式HO-L-O-A3的化合物反应，其中
A3是适合的保护基，并且
L是选自如下的连接物：
-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-和-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-，
由此在GalNAc环的碳原子1上形成醚键；
(iii)使步骤(ii)的产物中的-O-A3基团脱保护，由此得到脱保护的-OH基团；
(iv)使步骤(iii)的产物与亚磷酰胺反应，由此得到项目1-9任一项的化合物。
项目28：用于制备核酸缀合物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)将核酸分子提供在固体支持物上；
(ii)使用亚磷酰胺化学法任选将分支物分子添加到核酸分子上，其中所述分支物分子在添加后产生优选地表示为通式(IV a)的结构，
其中
A4是适合的保护基；
V1选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V2不存在或选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
V3选自-O-、-NH-CO-和-CO-NH-；
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-SH、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH；
m是1至3的整数；
n是0至5的整数；
p是0至3的整数；并且在每次出现时独立地
q是1至2的整数；
q’是0至2的整数；并且
r是1至5的整数；
条件是当V2不存在时，q’是0，并且连接至式(IV a)中的V2的-(CH2)r-OA4也不存在；
(iii)使用亚磷酰胺化学法任选将间隔物亚磷酰胺分子添加到分支物分子的每个分支上，其中所述间隔物分子在添加后产生优选地表示为通式(V a)的结构，
其中在每次出现时独立地
A5是适合的保护基；
W选自-(CH2)2-15-和-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-；
X1是-OH，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是O-，并且X2选自＝O和＝S；或者
X1是＝O，并且X2选自-CH3、-SH、-OR、-NHR和-BH3，其中R在每次出现时独立地是C1-C6烷基；或者
X1是＝S，并且X2选自-CH3和-SH；
(iv)如果分支物分子不存在，则使项目1-9任一项的化合物与核酸分子的反应端反应；或者如果分支物分子存在并且间隔物不存在，则使项目1-9任一项的化合物与每个分支的反应端反应；或者如果间隔物存在，则使项目1-9任一项的化合物与每个间隔物的反应端反应；和
(v)从固体支持物上裂解步骤(iv)的产物；
其中从项目1-9任一项的化合物上的连接物L的第一个原子开始并且终止于式(IVa)中的连接点或核酸分子中的连接点的连续链具有最短8个原子的长度和最长30个原子的长度。
项目29：项目28的方法，其中核酸分子选自DNA、RNA和包含一个或多个核苷类似物的分子，特别地核酸分子选自反义寡核苷酸、gapmers、小干扰RNAs和microRNAs。
项目30：项目28或29的方法，其中核酸分子包含锁定核酸核苷酸。
项目31：项目28-30任一项的方法，其中核酸分子包含一个或多个硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯核苷间连接物。
项目32：项目28-31任一项的方法，其中所有DNA和RNA核苷与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。
项目33：项目28-32任一项的方法，其中核酸分子中的所有核苷和/或核苷类似物与硫代磷酸酯或硼烷基磷酸酯连接。
项目34：项目28-33任一项的方法，其中使分支物分子、间隔物分子或项目1-9任一项的化合物与核酸分子的5’端反应。
项目35：项目28-34任一项的方法，其中PO连接物位于核酸分子和分支物分子、间隔物分子或项目1-9任一项的化合物之间。
项目36：项目28-35任一项的方法，其中分支物分子选自：
1,3-双-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基酰氨基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺；
三-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺；和
三-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]亚甲基氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
项目37：项目28-36任一项的方法，其中间隔物亚磷酰胺分子表示为通式(VII)
其中A2是适合的保护基，优选-CH2CH2CN，A6是适合的保护基，例如4’,4’-二甲氧基三苯甲基，并且R4选自：-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-、-CH2CH2CH2-和-(CH2)12-；并且
NR’R”是仲氨基，其中R’和R”独立地选自C1-C6-烷基，或者R’和R”一起形成5-或6-元环，其可以被取代并且可以包含另一个选自N和O的杂原子。
项目38：项目1-9任一项的化合物在制备项目10-26任一项的化合物中的用途。
项目39：项目10-26任一项的化合物作为药物的用途。
项目40：项目10-26任一项的化合物，其用于减少肝mRNA靶标。
项目41：项目10-26任一项的化合物，其用于治疗肝疾病。
项目42：项目10-26任一项的化合物，其用于治疗代谢性疾病或障碍或者肝疾病或障碍。特别地用于治疗如下疾病：例如肝炎(包括病毒性肝炎，例如HBV或HCV)、肝脂肪变性(包括代谢性功能失调)、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症例如载脂蛋白B中功能突变增加、HDL/LDL胆固醇失调、血脂异常例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、他汀类抗性高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、急性冠脉综合征(ACS)、肝纤维变性(或与肝纤维变性相关的疾病)、肝硬化和癌症。
项目43：治疗方法，该方法包括给人或动物施用有效量的项目10-26任一项的化合物。
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