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发明领域
本发明一般涉及昆虫抑制蛋白的领域。本文公开了一类新型的表现出针对作物植物和种子的农业上相关的害虫的昆虫抑制活性的工程化的蛋白。具体地，公开的这类工程化的抑制蛋白具有针对鳞翅目昆虫害虫的杀虫活性。本文提供含有编码一种或多种公开的工程化的抑制蛋白的多核苷酸构建体的植物、植物部分以及种子。
发明背景
美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)是主要农作物(包括玉米、棉花和大豆)的重要鳞翅目害虫。被称为玉米穗虫(CEW)、棉铃虫(CBW)和大豆荚虫(SPW)的此多食性昆虫物种特别难以用来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)或其它细菌物种的杀虫蛋白来控制。由于其能够以许多不同作物为食物和目前缺乏高剂量的控制策略，美洲棉铃虫(H.zea)被认为处于对目前的昆虫控制性状形成抗性的风险中。因此，需要新的作用方式(MoA)以确保保护免遭美洲棉铃虫摄食损伤的转基因植物的耐久性。
Cry1Da1蛋白是首先由Hofte,等人“Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis.”Nucleic Acids Res.18(18)(1990):5545描述的鳞翅目活性蛋白。这种蛋白表现出对夜蛾(Spodoptera)物种(包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(草地贪夜蛾，FAW)，一类几种作物(包括玉米、棉花和大豆)的害虫)极好的杀虫活性。然而，Cry1Da1表现出对各种其它主要鳞翅目害虫，包括螟蛉(例如，棉铃虫(Helicoverpa armigera)和美洲棉铃虫)、螟虫(例如，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella))和大豆尺蠖(大豆夜蛾(Pseudoplusia includens))的低到中等的活性。由于其窄的杀虫谱和其无法提供针对一系列重要鳞翅目农业害虫(诸如CEW)的商业级保护，因此Cry1Da1杀虫蛋白具有作为转基因植物昆虫控制性状的有限价值。结果，目前没有商业品种的抗虫作物利用Cry1Da1作为植物结合杀虫剂(plant-incorporated protectant)。
尽管其窄的杀虫谱，Cry1Da1仍是一种令人关注的杀虫蛋白，因为似乎Cry1Da1蛋白使用一种替代的MoA来控制某些鳞翅目害虫。为此证据来自具有多个抗虫集落的研究。例如，对Cry1Ac中毒有抗性的小菜蛾(Plutella xylostella)(小菜蛾(diamondback moth))和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)(棉红铃虫)的田间采集(field-derived)的集落保留对Cry1Da1蛋白的充分灵敏性(Tabashnik,等人.“Cross-Resistance of Pink Bollworm(Pectinophora gossypiella)to Bacillus thuringiensis toxins.”Appl.Environ.Microbiol.66(2000):4582-4584；Tabashnik,等人.“Cross-Resistance to Bacillus thuringiensis Toxin Cry1Ja in a Strain of Diamondback Moth Adapted to Artificial Diet.”J.Invert.Pathol.76:(2000):81-83.)。这些多条证据表明，Cry1Da1识别与由目前在转基因作物中形成的鳞翅目活性蛋白识别的那些受体(包括Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1Fa、Cry2Ae和Cry2Ab2)不同的鳞翅目中肠受体。鉴于这种明显新型的MoA，优化Cry1Da1样蛋白以改善针对更广谱的棉铃虫(Helicoverpa)物种的活性，同时保持或增加它们针对夜蛾的杀虫活性将产生用于昆虫抗性管理的高价值的植物结合杀虫剂。
发明概述
在本发明中，已经鉴定了TIC844和Cry1Da支架蛋白的几种氨基酸序列变体表现出针对美洲棉铃虫显著改善的活性(与Cry1Da1天然毒素相比较)同时保留极好的针对草地夜蛾(S.frugiperda)的活性。TIC844和Cry1Da的改良变体已被工程化以在作物(例如，玉米、大豆、棉花、甘蔗)中表达，并且鉴于Cry1Da明显独特的作用方式与抗美洲棉铃虫活性的工程化改善相结合提供在植物内抗性管理和鳞翅目昆虫害虫控制的新型选择。
本文所述的工程化的鳞翅目毒性蛋白(称为“工程化的毒素蛋白”、“工程化的毒性蛋白”或“工程化的杀虫蛋白”)是天然存在的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素Cry1Da1(SEQ ID NO:2)或Cry1Da1的嵌合同源物TIC844(SEQ ID NO:14)的衍生物，TIC844包括Cry1Da1核心毒素但用Cry1Ab3原毒素替代天然Cry1Da1原毒素结构域。与在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14中的任一者中所示出的支架蛋白相比，本发明工程化的杀虫蛋白各自含有至少一个氨基酸取代、一个氨基酸添加或一个氨基酸缺失。本发明工程化的杀虫蛋白对美洲棉铃虫(玉米穗虫、大豆荚虫、棉铃虫)和草地夜蛾(草地贪夜蛾)物种的昆虫特别有毒性。尽管支架蛋白TIC844(SEQ ID NO:14)和Cry1Da1(SEQ ID NO:2)对美洲棉铃虫显示低毒性，但本发明工程化的杀虫蛋白表现出令人惊讶的和意想不到的针对鳞翅目昆虫害虫(包括美洲棉铃虫)的改善的杀虫活性和增强的杀虫谱。
在某些实施方案中，本文公开了包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列或其昆虫抑制片段的工程化的杀虫蛋白。在某些实施方案中，工程化的杀虫蛋白表现出针对鳞翅目的昆虫物种的抑制活性。通过本发明的鳞翅目毒性蛋白抑制的目标鳞翅目害虫物种至少包括草地贪夜蛾(草地夜蛾)、甜菜夜蛾(beet armyworm)(甜菜夜蛾(Spodoptera exigua))、花边粘虫(bertha armyworm)(蓓带夜蛾(Mamestra configurata))、黑切根虫(black cutworm)(球菜夜蛾(Agrotis ipsilon))、卷心菜尺蠖(cabbage looper)(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、大豆尺蠖(黄豆银纹夜蛾(Chrysodeixis includens))、黎豆夜蛾(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、苜蓿绿夜蛾(green cloverworm)(苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra))、烟草夜蛾(tobacco budworm)(烟草夜蛾(Heliothis virescens))、颗粒地老虎(粒肤地老虎(Agrotis subterranea))、行军虫(美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta))、西部切根虫(西部灰地老虎(Agrotis orthogonia))、欧洲玉米螟虫(欧洲玉米螟)、脐橙螟(navel orangeworm)(脐橙螟(Amyelois transitella))、玉米根网螟(玉米根草螟(Crambus caliginosellus))、野螟(sod webworm)(水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis))、向日葵同斑螟(sunflower moth)(向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum))、小玉米茎螟虫(南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus))、苹果蠹蛾(codling moth)(苹果小卷蛾(Cydia pomonella))、葡萄卷叶蛾(grape berry moth)(葡萄菜果蛾(Endopiza viteana))、东方果蛾(oriental fruit moth)(梨小食心虫(Grapholita molesta))、向日葵芽蛾(sunflower bud moth)(向日葵芽蛾(Suleima helianthana))、小菜蛾(小菜蛾(Plutella xylostella))、棉红铃虫(棉红铃虫(Pectinophora gossypiella))、粉茎螟虫(稻蛀茎夜蛾(Sesamia inferens))、舞毒蛾(gypsy moth)(舞毒蛾(Lymantria dispar))、棉叶虫(棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea))、果树卷叶虫(果树卷叶蛾(Archips argyrospila))、欧洲卷叶虫(蔷薇卷叶蛾(Archips rosana))、亚洲水稻螟虫或稻杆螟虫(二化螟(Chilo suppressalis))、水稻卷叶虫(稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis))、玉米根网螟(玉米根草螟(Crambus caliginosellus))、蓝草网螟(早熟禾草螟(Crambus teterrellus))、西南部玉米螟虫(西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella))、甘蔗螟虫(小蔗螟(Diatraea saccharalis))、多刺螟蛉(棉斑实蛾(Earias insulana))、斑点螟蛉(翠纹金刚钻(Earias vittella))、东半球棉铃虫(Old World cotton bollworm)(棉铃虫(Helicoverpa armigera))、玉米穗虫、大豆荚虫或棉铃虫(美洲棉铃虫)、野螟(水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis))、欧洲葡萄卷蛾(花翅卷蛾(Lobesia botrana))、柑橘潜叶蛾(桔潜叶蛾(Phyllocnistis citrella))、大菜粉蝶(large white butterfly)(大菜粉蝶(Pieris brassicae))、进口菜青虫、或小菜粉蝶(small white butterfly)(小菜粉蝶(Pieris rapae))、烟草夜蛾、或斜纹夜蛾(cluster caterpillar)(斜纹夜蛾(Spodoptera litura))和番茄斑潜蝇(tomato leafminer)(番茄斑潜蝇(Tuta absoluta))。
本文还公开了编码工程化的杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接到异源启动子，并且工程化的杀虫蛋白包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本文公开了编码工程化的杀虫蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含任选地在严格条件下与如SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41中的任一者中所示出的多核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；或编码包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列的工程化的杀虫蛋白。
本文还提供包含如在SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41中的任一者中所示出的多核苷酸的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由细菌宿主细胞或植物宿主细胞组成的组。涵盖的细菌宿主细胞包括选自由以下组成的组的细菌宿主细胞：土壤农杆菌(Agrobacterium)、根瘤菌(Rhizobium)、芽孢杆菌(Bacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、埃希氏杆菌(Escherichia)、假单胞菌(Pseudomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和欧文氏菌(Erwinia)，其中所述芽孢杆菌物种是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，所述短芽孢杆菌是侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosperous)，并且所述埃希氏杆菌是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。此外，预期是植物宿主细胞包括单子叶植物或双子叶植物。
在又一个实施方案中，本文提供了包含工程化的杀虫蛋白的昆虫抑制组合物，所述工程化的杀虫蛋白包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列或其昆虫抑制片段。可以预期，此昆虫抑制组合物还可以包含至少一种与工程化的杀虫蛋白不同的昆虫抑制剂。预期的昆虫抑制剂包括昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和昆虫抑制化学物质。可以预期的是，至少一种其它杀虫剂可以表现出针对一种或多种鳞翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目或缨翅目的害虫物种的活性。
本文还公开了包含昆虫抑制有效量的工程化的杀虫蛋白的种子，所述工程化的杀虫蛋白包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列；或SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41中的任一者中所示出的多核苷酸。
在另一个实施方案中本文还公开了一种用于控制鳞翅目害虫的方法，所述方法包括使鳞翅目害虫与抑制量的工程化的杀虫蛋白接触。
在又一个实施方案中，本文公开了包含工程化的杀虫蛋白的转基因植物细胞、植物或植物部分。还提供了用于控制鳞翅目害虫的方法，所述方法包括使害虫暴露于包含工程化的杀虫蛋白的转基因植物细胞、植物或植物部分。还预期了得自包含工程化的杀虫蛋白的植物细胞、植物或植物部分的商品产品，其中所述产品包含可检测的量的工程化的杀虫蛋白。预期的商品产品包括植物生物质、油、粕、动物饲料、面粉、薄片、麸皮、棉绒、壳和加工的种子。
本文所公开的另一种方法是生产包含工程化的杀虫蛋白的种子的方法，所述方法包括：种植至少一种包含工程化的杀虫蛋白的种子；从所述种子生长植物；和从植物收获种子，其中所述收获的种子包含工程化的杀虫蛋白。
本申请公开的又一种方法是抑制鳞翅目害虫摄食作物植物的方法，所述方法包括通过一个或多个氨基酸残基的取代来修饰SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的一个或多个氨基酸残基以产生修饰的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14；和在所述作物植物的组织内、在组织表面上或在组织附近制备可获得的鳞翅目抑制量的修饰的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14；其中SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14修饰的氨基酸残基选自由以下组成的组：282位处的丝氨酸被赖氨酸或缬氨酸取代、316位处的酪氨酸被丝氨酸取代、368位处的异亮氨酸被脯氨酸或精氨酸取代、374位处的丝氨酸被精氨酸取代、375位处的天冬酰胺被组氨酸取代、以及432位处的异亮氨酸被亮氨酸取代。
还提供了编码本发明的工程化的杀虫蛋白的重组多核苷酸分子。预期的重组多核苷酸分子包含选自由SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41组成的组的多核苷酸序列；和任选地编码不同于工程化的杀虫蛋白的昆虫抑制剂的多核苷酸序列。
本申请公开的另一种方法是增加支架蛋白的鳞翅目活性并增强鳞翅目抑制谱的方法，所述方法包括通过氨基酸残基的取代来修饰SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的一个或多个氨基酸残基以产生工程化的杀虫蛋白；其中SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14修饰的氨基酸残基选自由以下组成的组：282位处的丝氨酸被赖氨酸或缬氨酸取代、316位处的酪氨酸被丝氨酸取代、368位处的异亮氨酸被脯氨酸或精氨酸取代、374位处的丝氨酸被精氨酸取代、375位处的天冬酰胺被组氨酸取代、以及432位处的异亮氨酸被亮氨酸取代。在该方法的某些实施方案中，工程化的杀虫蛋白相对于支架蛋白在美洲棉铃虫致死率方面具有至少8倍增加。
本发明的其它实施方案、特征和优点将从以下详细描述、实施例和权利要求书中而显而易见。
附图简述
图1示出了针对两个不同的美洲棉铃虫(CEW)集落Union City和Benzon，支架蛋白TIC844(SEQ ID NO:14)与工程化的杀虫蛋白TIC844_8(SEQ ID NO:26)相比的MIC50值。
序列简述
SEQ ID NO:1是编码Cry1Da1蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是Cry1Da1蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码Cry1Da1_3蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是Cry1Da1_3蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是编码Cry1Da1_4蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是Cry1Da1_4蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是编码Cry1Da1_5蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是Cry1Da1_5蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是编码Cry1Da1_6蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是Cry1Da1_6蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是编码Cry1Da1_7蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是Cry1Da1_7蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是编码TIC844蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是TIC844蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是编码TIC844_2蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是TIC844_2蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是编码TIC844_4蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是TIC844_4蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是编码TIC844_5蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是TIC844_5蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是编码TIC844_6蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是TIC844_6蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是编码TIC844_7蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是TIC844_7蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是编码TIC844_8蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是TIC844_8蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是设计用于在植物中表达Cry1Da1蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是Cry1Da1蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是设计用于在植物中表达Cry1Da1_2.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是Cry1Da1_2.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是设计用于在植物中表达Cry1Da1_3.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是Cry1Da1_3.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是设计用于在植物中表达Cry1Da1_4.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是Cry1Da1_4.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是设计用于在植物中表达Cry1Da1_5.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是Cry1Da1_5.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是设计用于在植物中表达Cry1Da1_6.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是Cry1Da1_6.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是设计用于在植物中表达Cry1Da1_7.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:40是Cry1Da1_7.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是设计用于在植物中表达TIC844_9.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是TIC844_9.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是设计用于在植物中表达TIC844_11.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是TIC844_11.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
发明详述
本文提供了相对于其它先前已知的鳞翅目杀虫蛋白表现出令人惊讶的更高水平的针对鳞翅目物种的毒性活性和更宽的杀虫谱的工程化的杀虫蛋白。这些工程化的杀虫蛋白得自用作各种氨基酸修饰的模板的杀虫支架蛋白。此类杀虫支架蛋白的实例包括但不限于Cry1Da1和TIC844(Cry1Da1的同源物)。TIC844包含Cry1Da1核心毒素(即，结构域I、II和III)，但利用Cry1Ab3原毒素结构域以确保在苏云金芽孢杆菌(Bt)中良好表达。当使用天然Cry1Da1原毒素结构域时，Cry1Da1在Bt中的表达较差。然而，如在本申请中表明，当天然原毒素结构域被去除并且Cry1Da1核心毒素编码区段与编码Cry1Ab3原毒素结构域的区段同框融合时，Cry1Da1核心毒素的表达在Bt的无晶体(acrystalliferous)菌株中显著改善。值得注意的是，支架蛋白TIC844(SEQ ID NO:14)和Cry1Da1(SEQ ID NO:2)不表现出在工程化的杀虫蛋白中观察到的商业上有用的鳞翅目抑制谱和改善的鳞翅目抑制活性。
本文公开的工程化的杀虫蛋白通过氨基酸修饰相关，使得修饰的蛋白表现出相对于母体支架蛋白TIC844或Cry1Da1增强的鳞翅目抑制谱和/或改善的鳞翅目抑制活性。短语“活性更强”、“改善的活性”、“增强的特异性”、“增加的毒性效力”、“增加的毒性”、“改善的鳞翅目抑制活性”、“更大的鳞翅目抑制活性”和“增强的鳞翅目抑菌谱”是指针对鳞翅目昆虫而言工程化的杀虫蛋白的活性与支架蛋白(TIC844或Cry1Da1)的活性的比较，其中归因于工程化的杀虫蛋白的活性比归因于支架蛋白的活性更大。在某些实施方案中，当与支架TIC844或Cry1Da1蛋白的活性相比时，本文提供的工程化的杀虫蛋白表现出增强的鳞翅目抑制谱和/或改善的或更大的鳞翅目抑制活性，其中鳞翅目害虫物种包括但不限于美洲棉铃虫和草地夜蛾。
如本文所用，术语和短语“活性的”或“活性”；“杀虫的活性”或“杀虫的”；或“杀虫剂的活性”，“昆虫抑制性”，“杀虫剂的”或“昆虫抑制量”是指毒性剂(诸如杀虫蛋白)在抑制(抑制生长、摄食、繁殖或活力)、阻止(阻止生长、摄食、繁殖或活力)、控制(控制害虫侵扰、控制害虫在含有有效量的公开的工程化的杀虫蛋白的特定作物上的摄食活动)或杀死害虫(导致发病率、死亡率或减少繁殖力)的功效。类似地，“鳞翅目抑制量”是指毒性剂(诸如杀虫蛋白)导致鳞翅目活力、鳞翅目生长、鳞翅目发育、鳞翅目繁殖、鳞翅目摄食行为、鳞翅目交配行为的任何可测量的抑制和/或对被鳞翅目摄食的植物的不利影响的任何可测量的减少的量。这些术语旨在包括向害虫提供杀虫有效量的毒性剂的结果，其中将害虫暴露于毒性剂导致发病率、死亡率、减少的繁殖力或发育迟缓。这些术语还包括由于在植物中或在植物上提供杀虫有效量的毒性剂而引起害虫对植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞，或对植物可以生长的特定地理位置的排斥。通常，杀虫活性是指毒性剂有效抑制生长、发育、活力、摄食行为、交配行为、繁殖力，或特定目标害虫(包括但不限于鳞翅目昆虫)的由摄食该蛋白、蛋白区段、蛋白部分或多核苷酸的昆虫引起的不利影响的任何可测量的降低的能力。毒性剂可通过植物来产生，或者可以应用到植物或其中植物所位于的位置内的环境中。
当毒剂提供于目标害虫的饮食中被害虫摄取时，杀虫剂有效量的毒性剂显示出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或一种或多种本领域已知的化学剂。杀虫或杀昆虫化学剂和杀虫或杀昆虫蛋白剂可以单独使用或彼此组合使用。化学剂包括但不限于在目标害虫中靶向特定基因用于抑制的dsRNA分子、有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类和瑞诺烷(ryanoid)。杀虫或杀昆虫蛋白剂包括本申请中所述的工程化的杀虫蛋白，以及包括靶向鳞翅目害虫物种的那些其它蛋白质毒性剂，以及用于控制其它植物害虫的蛋白质毒素(诸如用于控制鞘翅目、半翅目和同翅目物种的本领域可获得的Cry蛋白质)。
术语“区段”或“片段”在本文中用于描述比描述工程化的杀虫蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续的氨基酸或核酸序列。
意图是，提及害虫(特别是作物植物的害虫)意指作物植物的昆虫害虫，特别是通过公开的工程化的杀虫蛋白控制的那些鳞翅目昆虫害虫。然而，当靶向这些害虫的毒性剂共定位或与公开的工程化的杀虫蛋白一起存在时，提及害虫还可包括植物的鞘翅目、半翅目和同翅目昆虫害虫，以及线虫和真菌。
公开的工程化的杀虫蛋白表现出对来自鳞翅目昆虫物种的昆虫害虫(包括成虫、蛹、幼虫和卵)的杀虫活性。鳞翅目的昆虫包括但不限于行军虫、切根虫、尺蠖和夜蛾科的食夜蛾，例如，草地贪夜蛾(草地夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜夜蛾)、花边粘虫(蓓带夜蛾)、黑切根虫(球菜夜蛾)、卷心菜尺蠖(粉纹夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)、苜蓿绿夜蛾(苜蓿绿夜蛾)、烟草夜蛾(烟草夜蛾)、颗粒地老虎(粒肤地老虎)、行军虫(美洲粘虫)、西部切根虫(西部灰地老虎)；来自螟蛾科的螟虫、箱蛾幼虫(casebearers)、网螟、锥形虫(coneworms)、菜青虫(cabbageworms)和骨化虫(skeletonizers)，例如，欧洲玉米螟虫(欧洲玉米螟)、脐橙螟(脐橙螟)、玉米根网螟(玉米根草螟)、野螟(水稻切叶野螟)、向日葵同斑螟(向日葵同斑螟)、小玉米茎螟虫(南美玉米苗斑螟)；卷叶虫、芽虫(budworms)、种虫(seed worms)和卷蛾科的果蠕虫，例如，苹果蠹蛾(苹果小卷蛾)、葡萄卷叶蛾(葡萄菜果蛾)、东方果蛾(梨小食心虫)、向日葵芽蛾(向日葵芽蛾)；和许多其它经济上重要的鳞翅目，例如，小菜蛾(小菜蛾)、棉红铃虫(棉红铃虫)和舞毒蛾(舞毒蛾)。鳞翅目的其它昆虫害虫包括(例如)棉叶波纹夜蛾(棉叶虫)、果树卷叶蛾(果树卷叶虫)、蔷薇卷叶蛾(欧洲卷叶虫)和其它黄卷蛾种类、二化螟(亚洲水稻螟虫或稻杆螟虫)、稻纵卷叶螟(水稻卷叶虫)、玉米根草螟(玉米根网螟)、早熟禾草螟(蓝草网螟)、西南玉米杆草螟(西南部玉米螟虫)、小蔗螟(甘蔗螟虫)、棉斑实蛾(spiny bollworm)、翠纹金刚钻(spotted bollworm)、棉铃虫(American bollworm)、美洲棉铃虫(玉米穗虫或棉铃虫)、烟草夜蛾(烟草夜蛾)、水稻切叶野螟(野螟)、花翅卷蛾(欧洲葡萄卷蛾)、桔潜叶蛾(柑橘潜叶蛾)、大菜粉蝶(大菜粉蝶)、小菜粉蝶(进口菜青虫或小菜粉蝶)、小菜蛾(小菜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜夜蛾)、斜纹夜蛾(烟草夜蛾、斜纹夜蛾)和番茄斑潜蝇(番茄斑潜蝇)。
在本申请中，提及“分离的DNA分子”或等效术语或短语，旨在意指该DNA分子是单独存在或与其它组合物组合，但不在其天然环境内的DNA分子。例如，在生物体的基因组的DNA内天然发现的核酸元件诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要元件位于生物体的基因组内并且在其天然发现的基因组内的位置处，就不被认为是“分离的”。然而，这些元件中的每一个，以及这些元件的子部分，在本公开的范围内将是“分离的”，只要该元件不在生物体的基因组内并且在其天然发现的基因组内的位置处。类似地，编码杀虫蛋白或该蛋白的任何天然存在的杀虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要该核苷酸序列不是位于天然发现编码该蛋白质的序列的细菌DNA内。编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成的核苷酸序列将被认为是为了本公开的目的而分离。为了本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即，插入植物或细菌的细胞的基因组中，或存在于染色体外载体的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论该序列是否存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，在植物或细菌的基因组内，或以可检测的量存在于得自该植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
如实施例中进一步所述，重复多轮工程化、测试和选择超过两千(2000)种TIC844和Cry1Da1的氨基酸序列变体导致某些氨基酸残基的鉴定，所述残基可被取代、插入或从给定的支架蛋白删除以产生相比于基线支架蛋白TIC844或Cry1Da1的谱和活性表现出扩大的鳞翅目抑制谱和/或改善的鳞翅目抑制活性(即，毒性更强；需要较少的杀虫蛋白以获得相同的死亡率水平)的工程化的杀虫蛋白。这些重复多轮工程化、测试和选择也导致不改变蛋白质的昆虫抑制谱或活性的TIC844和Cry1Da1支架蛋白中的中性氨基酸残基取代、插入或缺失的鉴定。本文鉴定了TIC844和Cry1Da1支架中可被修饰以产生相对于TIC844或Cry1Da1增强的鳞翅目抑制谱和/或改善的鳞翅目抑制活性的特定氨基酸残基。在某些实施方案中，相比于SEQ ID NO:14(TIC844)或SEQ ID NO:2(Cry1Da1)的支架蛋白，本文提供的工程化的杀虫蛋白可表现出针对鳞翅目害虫物种的约八倍或更大的鳞翅目抑制活性。
这些重复多轮中的“工程化”包括鉴定支架蛋白中的相关残基以修饰来生成修饰的测试蛋白，和克隆并表达所得到的修饰的测试蛋白。支架蛋白的原子结构用于引导和补充选择氨基酸残基进行修饰用于工程化的半随机方法。这些重复多轮中的“测试”包括比较修饰的测试蛋白的鳞翅目物种活性与其母体支架蛋白。这些重复多轮中的“选择”包括鉴定具有改善的活性(改良变体)和被工程化以生成这些改善的变体(这些改良变体在本文中称为“工程化的杀虫蛋白”)的相关残基的修饰的测试蛋白。
测试和选择工程化的杀虫蛋白的方法的实例包括在受控的测定条件下向昆虫害虫施用相同量的经修饰的测试蛋白和支架蛋白(TIC844或Cry1Da1)并测量和比较修饰的测试蛋白和支架蛋白的效力。用于测试和选择工程化的杀虫蛋白的另一种方法包括确定在受控的测定条件下(即，获得剂量反应曲线)引起相同的昆虫群体响应的经修饰的测试蛋白和支架蛋白(TIC844或Cry1Da1)的蛋白剂量(例如，饮食中的蛋白质浓度)。用于比较的统计学上稳健的剂量响应值是杀死50％的测试群体所需的半数致死浓度(LC50)或抑制50％蜕皮所需的中值浓度的蜕皮抑制浓度(“MIC50”)。
在某些实施方案中，本文所述的工程化的杀虫蛋白包括TIC844(SEQ ID NO:14)或Cry1Da1(SEQ ID NO:2)的下面相对位置的至少一个氨基酸修饰：282位处的丝氨酸被赖氨酸或缬氨酸取代、316位处的酪氨酸被丝氨酸取代、368位处的异亮氨酸被脯氨酸或精氨酸取代、374位处的丝氨酸被精氨酸取代、375位处的天冬酰胺被组氨酸取代、以及432位处的异亮氨酸被亮氨酸取代。工程化的杀虫蛋白还可以包括相同的工程化的杀虫蛋白序列内的至少两个、三个、四个或更多个这些氨基酸取代或缺失。
包括这些氨基酸修饰的工程化的杀虫蛋白包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44中所述的蛋白及其昆虫抑制片段。这些工程化的杀虫蛋白中的每一个具有约132k-道尔顿的测量质量。杀虫支架蛋白TIC844和Cry1Da1和由其衍生的工程化的杀虫蛋白的单独特征列于表1。
表1.TIC844、Cry1Da1和工程化的杀虫蛋白的特征。
本文所述的工程化的杀虫蛋白的片段可以呈截短形式，其中一个或多个氨基酸从N-末端、C-末端、蛋白质的中间或其组合删除，而不损失昆虫抑制活性。这些片段应保留母体工程化的杀虫蛋白的昆虫抑制活性。
类似于工程化的杀虫蛋白的蛋白质可以通过使用本领域已知的各种基于计算机的算法进行互相比较来鉴定。例如，与工程化的杀虫蛋白有关的蛋白质的氨基酸序列同一性可以使用Clustal W比对使用如下这些缺省参数进行分析：权重矩阵：blosum，缺口开放罚分：10.0，缺口延伸罚分：0.05，亲水性缺口：开，亲水性残基：GPSNDQERK，残基特异性缺口罚分：开(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。百分比氨基酸同一性通过100％乘以(氨基酸同一性/主题蛋白质的长度)的乘积进一步计算。其它比对算法也是本领域可获得的，并且提供与使用Clustal W比对获得的那些结果类似的结果。
如在本申请的实施例中进一步描述的，设计编码支架蛋白和工程化的杀虫蛋白的合成或人工序列用于在植物中使用。设计用于在植物中使用的示例性的合成的核苷酸序列在SEQ ID NO:27(Cry1Da1.nno)、SEQ ID NO:29(Cry1Da1_2.nno)、SEQ ID NO:31(Cry1Da1_3.nno)、SEQ ID NO:33(Cry1Da1_4.nno)、SEQ ID NO:35(Cry1Da1_5.nno)、SEQ ID NO:37(Cry1Da1_6.nno)、SEQ ID NO:39(Cry1Da1_7.nno)、SEQ ID NO:41(TIC844_9.nno)和SEQ ID NO:43(TIC844_11.nno)中描述。
构建含有这些合成或人工核苷酸序列的表达盒和载体，并根据转化方法和本领域已知的技术引入到玉米、棉花和大豆植物细胞。转化的细胞再生为观察到表达工程化的杀虫蛋白或支架蛋白的转化的植物。为了测试杀虫活性，使用从转化的植物获得的植物叶盘在鳞翅目害虫幼虫的存在下进行生物测定。
预期编码工程化的杀虫蛋白的重组核酸分子组合物。例如，工程化的杀虫蛋白可以用重组DNA构建体来表达，其中具有编码工程化的杀虫蛋白的ORF的多核苷酸分子可操作地连接到基因表达元件(诸如启动子)和用于在该构建体之意的系统中表达所必需的任何其它调控元件。非限制性实例包括可操作地连接到合成的工程化的杀虫蛋白编码序列用于在植物中表达工程化的杀虫蛋白的植物功能性启动子，或可操作地连接到工程化的杀虫蛋白编码序列用于在Bt细菌或其它芽孢杆菌物种中表达蛋白质的Bt功能性启动子。其它元件可以可操作地连接到工程化的杀虫蛋白编码序列，包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白质固定化标签(HIS-标签)、易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi靶位点。本文提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于可操作地连接到诸如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:43的多核苷酸的异源启动子，所述多核苷酸编码具有如SEQ ID NO:4(Cry1Da1_3)、SEQ ID NO:6(Cry1Da1_4)、SEQ ID NO:8(Cry1Da1_5)、SEQ ID NO:10(Cry1Da1_6)、SEQ ID NO:12(Cry1Da1_7)、SEQ ID NO:16(TIC844_2)、SEQ ID NO:18(TIC844_4)、SEQ ID NO:20(TIC844_5)、SEQ ID NO:22(TIC844_6)、SEQ ID NO:24(TIC844_7)、SEQ ID NO:26(TIC844_8)、SEQ ID NO:32(Cry1Da1_3.nno)、SEQ ID NO:34(Cry1Da1_4.nno)、SEQ ID NO:36(Cry1Da1_5.nno)、SEQ ID NO:38(Cry1Da1_6.nno)、SEQ ID NO:40(Cry1Da1_7.nno)和SEQ ID NO:44(TIC844_11.nno)中所示的氨基酸序列的多肽或蛋白质。异源启动子还可以可操作地连接到编码质粒靶向工程化的杀虫蛋白和非靶向工程化的杀虫蛋白的合成的DNA编码序列。可以预期的是编码本文公开的工程化的杀虫蛋白的重组核酸分子的密码子可以被同义密码子取代(在本领域中称为沉默取代)。
包含工程化的杀虫蛋白编码序列的重组DNA分子或构建体还可包含编码一种或多种毒性剂的DNA区域，所述毒性剂(一种与工程化的杀虫蛋白、昆虫抑制性dsRNA分子或辅助蛋白不同的蛋白)可被配置为与编码工程化的杀虫蛋白的DNA序列同时表达或共表达。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合伴侣，或发挥功能以助于昆虫抑制剂的有效性(例如通过帮助其表达、影响其在植物中的稳定性、优化低聚的自由能、增强其毒性并增加其活性谱)的其它试剂。例如，辅助蛋白可促进一种或多种昆虫抑制剂的摄取，或增强毒性剂的毒性作用。
重组DNA分子或构建体可被组装，使得所有蛋白质或dsRNA分子由一个启动子表达，或每个蛋白或dsRNA分子处于单独的启动子控制或其一些组合下。本发明的蛋白质可以由多基因表达系统中表达，其中工程化的杀虫蛋白由还含有其它开放阅读框和启动子的共同的核苷酸区段表达，这取决于所选的表达系统的类型。例如，细菌多基因表达系统可利用单个启动子从单个操纵子内驱动多重连接/串联开放阅读框的表达(即，多顺反子表达)。在另一实例中，植物多基因表达系统可利用多个未连接的表达盒，每个表达不同蛋白质或其它毒性剂诸如一种或多种dsRNA分子。
包含工程化的杀虫蛋白编码序列的重组核酸分子或重组DNA构建体可通过例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒颗粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体的载体递送到宿主细胞中。此类载体可以用来实现在宿主细胞中工程化的杀虫蛋白编码序列的稳定的或瞬时的表达，或编码的多肽的随后表达。包含工程化的杀虫蛋白序列编码序列且被引入到宿主细胞中的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本文中被称为“转基因”。
本文提供包含编码工程化的杀虫蛋白的任何一种或多种的多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限于土壤农杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、沙门氏菌、假单胞菌或根瘤菌细胞。术语“植物细胞”或“植物”可以包括但不限于双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。预期的植物和植物细胞包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆类、花椰菜、卷心菜、甘蓝、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜及小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了从转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，转基因植物可以从转基因种子通过切割、折断、研磨或以其它方式从该植物分离所述部分来获得。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、圆荚、叶、花、茎、根或其任何部分，或转基因植物部分的不可再生部分。如在此上下文中使用的，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能被诱导以形成完整植物的部分或不能被诱导以形成能够有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、圆荚、叶、花、茎或根的一部分。
提供制备包含鳞翅目抑制量的工程化的杀虫蛋白的转基因植物的方法。此类植物可通过将编码本申请提供的工程化的杀虫蛋白的多核苷酸引入植物细胞，并选择得自表达昆虫或鳞翅目抑制量的工程化的杀虫蛋白的所述植物细胞的植物来制备。植物可以通过再生从植物细胞、种子、花粉或分生组织转化技术衍生。转化植物的方法在本领域是已知的。
表达工程化的杀虫蛋白的植物可以通过表达其它杀虫蛋白的转基因事件和/或表达其它转基因性状如其它昆虫控制性状、除草剂耐受性基因、赋予产量或胁迫耐性性状的基因等进行育种来杂交，或者此类特征可以组合在单个向量中，使得特征全部相关。
本申请还公开加工的植物产品，其中所述加工的产品包含可检测的量的工程化的杀虫蛋白、其昆虫抑制区段或片段、或其任何特征部分。在某些实施方案中，加工的产品选自由植物部分、植物生物质、油、粕、糖、动物饲料、面粉、薄片、麸皮、棉绒、壳、加工的种子和种子组成的组。在某些实施方案中，加工的产品是不可再生的。植物产品可以包含得自转基因植物或转基因植物部分的商品或其它商业产品，其中商品或其它产品可以通过商业通过检测核苷酸片段或表达的RNA或蛋白质进行跟踪，所述RNA或蛋白质编码或包含工程化的杀虫蛋白的区别部分。
本申请还公开了用工程化的杀虫蛋白控制作物植物的昆虫(特别是鳞翅目)侵扰的方法。此类方法可包括种植包含昆虫或鳞翅目抑制量的工程化的杀虫蛋白的植物。在某些实施方案中，此类方法还可包括以下任何一种或多种：(i)向植物或产生植物的种子施加包含或编码工程化的杀虫蛋白的任何组合物；和(ii)用编码工程化的杀虫蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般地，预期的是工程化的杀虫蛋白可以组合物提供、以微生物提供、或者以赋予针对鳞翅目昆虫的昆虫抑制活性的转基因植物提供。
在某些实施方案中，工程化的杀虫蛋白是通过培养转化以在适于表达的条件下表达工程化的杀虫蛋白的重组芽孢杆菌或任何其它重组细菌细胞制备的昆虫抑制组合物的杀虫活性成分。此类组合物可以通过使表达/产生工程化的杀虫蛋白的此类重组细胞的培养物干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备。此类方法可导致芽孢杆菌或其它昆虫病原细菌细胞提取物、细胞悬液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。通过获得如此生产的工程化的杀虫蛋白，包含工程化的杀虫蛋白的组合物可包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饮食生物测定中的昆虫抑制制剂。
在一个实施方案中，为了降低形成抗性的可能性，包含工程化的杀虫蛋白的昆虫抑制组合物或转基因植物还可包含至少一种表现出针对相同的鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制活性但与工程化的杀虫蛋白不同的另外的毒性剂。此类组合物的可能的另外的毒性剂包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsRNA分子。使用此类核糖核苷酸序列控制昆虫害虫的一个实例描述于Baum等人(美国专利公布2006/0021087 A1)。用于控制鳞翅目害虫的此类一种或多种另外的多肽可选自由昆虫抑制蛋白组成的组，诸如但不限于Cry1A(美国专利No.5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公布No.10/525,318)、Cry1C(美国专利No.6,033,874)、Cry1D、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利No.7,070,982；6,962,705；和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab(美国专利No.7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045(美国专利公布2013-0117884 A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公布2013-0310543 A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公布2013-0104259 A1)、AXMI-134(美国专利公布2013-0167264A1)、AXMI-150(美国专利公布2010-0160231 A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176 A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公布2011-0030096 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布2014-0245491 A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-238(美国专利公布2014-0033363 A1)、AXMI-270(美国专利公布2014-0223598 A1)、AXMI-345(美国专利公布2014-0373195 A1)、DIG-3(美国专利公布2013-0219570 A1)、DIG-5(美国专利公布2010-0317569 A1)、DIG-11(美国专利公布2010-0319093 A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公布2014-0007292 A1)、PSEEN3174(美国专利公布2014-0007292 A1)、AECFG-592740(美国专利公布2014-0007292 A1)、Pput_1063(美国专利公布2014-0007292 A1)、Pput_1064(美国专利公布2014-0007292 A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726 A1)、GS153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、如在美国专利公布2012-0167259 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利公布2012-0047606 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利公布2011-0154536 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利公布2011-0112013 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利公布2010-0192256 A1中所述的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如在美国专利公布2010-0077507 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利公布2010-0077508 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利公布2009-0313721 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利公布2010-0269221 A1中所述的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如在美国专利No.7,772,465(B2)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在WO2014/008054 A2中所述的CF161_0085及其衍生物、如在美国专利公布US2008-0172762 A1、US2011-0055968 A1和US2012-0117690 A1中所述的鳞翅目毒性蛋白及其衍生物；如在US7510878(B2)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美国专利No.7812129(B1)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物等。
在其它实施方案中，昆虫抑制组合物或转基因植物还可包含至少一种表现出针对不受本发明的工程化的杀虫蛋白抑制的昆虫害虫(诸如鞘翅目、半翅目和同翅目害虫)的昆虫抑制活性的另外的毒性剂，以扩大获得的昆虫抑制谱。
用于控制鞘翅目害虫的此类另外的毒性剂可以选自由诸如但不限于以下的昆虫抑制蛋白组成的组：Cry3Bb(美国专利No.6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公布2013-0167264 A1)AXMI-184(美国专利公布2010-0004176 A1)、AXMI-205(美国专利公布2014-0298538 A1)、axmi207(美国专利公布2013-0303440 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-279(美国专利公布2014-0223599 A1)、AXMI-R1及其变体(美国专利公布2010-0197592 A1、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公布2010-0319092 A1)、eHIPs(美国专利申请公布No.2010/0017914)、IP3及其变体(美国专利公布2012-0210462 A1)和v-Hexatoxin-Hv1a(美国专利申请公布US2014-0366227 A1)。
用于控制鞘翅目害虫的此类另外的毒性剂可以选自由诸如但不限于以下的半翅目活性蛋白组成的组：TIC1415(US专利公布2013-0097735 A1)、TIC807(美国专利No.8609936)、TIC834(美国专利公布2013-0269060 A1)、AXMI-036(美国专利公布2010-0137216 A1)和AXMI-171(美国专利公布2013-0055469 A1)。用于控制鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫害虫的另外的多肽可以在由Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站找到(以btnomenclature.info在万维网上)。
可以使用本领域普通技术人员已知的方法诸如聚合酶链反应(PCR)、热扩增和杂交来鉴定工程化的杀虫蛋白编码序列和与工程化的杀虫蛋白具有相当大的百分比同一性的序列。例如，工程化的杀虫蛋白可用于产生特异性结合相关蛋白的抗体，并且可用于筛选和发现密切相关的其它蛋白。
此外，编码工程化的杀虫蛋白的核苷酸序列可以用作探针和引物用于使用热循环或等温扩增和杂交方法来筛选以鉴定类别的其它成员。例如，得自如SEQ ID NO:3中所示的序列的寡核苷酸可用来确定来源于商品产品的脱氧核糖核酸样本中的工程化的杀虫转基因的存在或不存在。鉴于使用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏度，预期得自如SEQ ID NO:3中的任一者中所示出的序列的寡核苷酸可用于检测源自合并来源的商品产品中各自的工程化的杀虫蛋白，仅商品产品的一部分得自含有SEQ ID NO:3中任一者的转基因植物。
本发明的其它特征和优点将从以下实施例和权利要求书中而显而易见。
实施例
鉴于上述情况，本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在公开的具体方面作出改变，并且仍然获得相似或类似的结果。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的。应当理解的是，本文引用的每个参考文献的全部公开内容在本申请的公开范围内并入。
实施例1
修饰的测试蛋白的设计和用于昆虫生物测定测试的样品制备
本实施例说明了鉴定支架蛋白中的相关氨基酸残基以修饰生成修饰的测试蛋白，以及克隆和表达所得到的修饰的测试蛋白所采用的方法。
以分层方法采用几种分子工程技术以构建具有相比于Cry1Da1和TIC844(Cry1Da1的同源物)的支架蛋白增强的鳞翅目抑制谱和/或改善的鳞翅目抑制活性的Cry1Da1改良变体。第一层或首轮设计主要是假设驱动。第二和第三层是统计学驱动的设计轮。例如，在第二层设计中，将统计学上无害的突变与推定的有益突变相结合，产生满足定义的统计学标准的双重突变。在第三层设计中，使用多种统计方法对以前测试中的所有数据进行了分析。选择仅在一种以上统计学方法中显示统计学上显著改善的突变为最终的突变库。在这一层设计的变体包含一个或两个以前确认为阳性的变异体阳性突变。因此，与第一和第二层相比，第三层设计显著丰富了活性变体。如后续实施例所示，三层设计策略的使用鉴定了单一和协同突变，相对于TIC844和Cry1Da1支架，某些改良变体针对CEW的活性显著改善。
用于产生修饰的测试蛋白的方法包括但不限于半随机修饰、TIC844/Cry1Da1与其它天然苏云金芽孢杆菌(Bt)蛋白比对变异的定向修饰，以及结构/功能辅助设计。利用分子工程技术的实例包括以下：
受体结合。鳞翅目害虫(特别是棉铃虫(CEW，美洲棉铃虫))对Cry1Da1/TIC844改良变体的易感性可以归因于不同的靶向肠受体。用于改善与肠受体结合从而增加毒性的设计包括：(1)将结构域II的顶端环中的每个位置突变为所有氨基酸类型；和(2)使结构域II的顶端环的所有可能组合与来自其它Cry1Da1同源物(例如，Cry1Db1、Cry1Dc1)和CEW活性的三结构域毒素(例如，Cry1Bb1、Cry1Ja1和Cry2Ab2)的那些交换。
基于比对的方法。Cry1Da1与其它同源物(例如，Cry1Db1和Cry1Dc1)的比对用来鉴定变异区域。作为比对的结果，鉴定了一百五十(150)个位置和二百九十五(295)个独特的单突变。这些位置位于整个三个结构域。四(4)个氨基酸内的位置彼此被分组在一起。只有来自同一亲本序列的突变才被提名为每组位置，呈现出一百三十二(132)个独特的变体。
表面诱变方法。编码支架蛋白的结构域II和III中的表面位置的多核苷酸通过扫描进行诱变。将氨基酸残基修饰为丙氨酸，其中丙氨酸尚未存在于支架蛋白中。在天然残基为赖氨酸的表面位置，除了丙氨酸突变之外还引入精氨酸突变。赖氨酸对精氨酸突变的合理性是基于以下观察：鳞翅目活性毒素倾向于具有非常少的赖氨酸和许多精氨酸，因此假设将结构域II和III中的表面赖氨酸位置改变为精氨酸将增加修饰的测试蛋白的鳞翅目活性。
蛋白水解事件的变化。蛋白水解过程被假设为鳞翅目昆虫肠中三结构域毒素活性的重要方面。为了测试这一点，进行了几组突变可能改变任何蛋白水解切割。潜在的切割位点位于N-末端以及结构域III和原毒素之间。突变位置包括从N-末端到螺旋4的开始以及从结构域III的C-末端到～40个氨基酸的原毒素的预测环区。通常，假定甘氨酸残基通过蛋白水解位点识别或通过增加蛋白质柔性来促进蛋白水解，从而使其更易于蛋白水解切割。此外，胰蛋白酶和糜蛋白酶是两种蛋白酶，被广泛接受为鳞翅目中肠中的活力蛋白酶。赖氨酸残基为胰蛋白酶提供了识别位点，并且酪氨酸残基为糜蛋白酶提供了识别位点。因此，潜在切割位点中的所选突变位置突变为甘氨酸、赖氨酸或酪氨酸。
来自其它CEW活性毒素的潜在的热点突变。分析了大量蛋白质(包括嵌合体、片段和天然序列)对CEW的活性和活性数据的缺失。通过对该数据的统计分析获得的信息用于鉴定潜在的具体突变或突变位置，这些突变或位置可能增加所得修饰的测试蛋白中的CEW活性。
使用本领域已知的方法将上述分子工程方法所得到的经修饰的测试蛋白克隆到孢子形成特异性表达启动子下游的重组Bt质粒表达载体中并转化到无晶体Bt宿主细胞。
实施例2
在针对鳞翅目害虫的饮食生物测定中测试修饰的测试蛋白
本实施例说明了由实施例1中描述的工程实践产生的修饰的测试蛋白的测试。
从实施例1中描述的工程实践中，产生了约二千五百(2,500)种重组Bt菌株，其表达超过二千三百(2,300)种不同的修饰的测试蛋白。这些修饰的测试蛋白在Bt中表达并测定对各种鳞翅目物种的毒性。用新生幼虫(孵化后<24小时)对各种鳞翅目物种进行摄食测定，所述物种包括玉米穗虫(CEW，美洲棉铃虫)和草地贪夜蛾(FAW，草地夜蛾)。用于CEW测试的昆虫卵从两个不同的实验室集落获得：Benson Research,Carlisle,PA和Monsanto Company,Union City,TN。所有表达的修饰的测试蛋白在CEW上进行测试，并且除了进行另外的生物测定以确认CEW活性之外，还在FAW上测试了与其母体支架蛋白相比表现出针对CEW的改善的活性的一些修饰的测试蛋白。
用于生物测定和评估昆虫死亡率和发育迟缓的各种方案是本领域已知的。使用方法的变型，例如在PCT专利申请公开No.WO 2012/139004和美国专利No.7,927,598中描述的方法。
实施例3
表现出改善的CEW活性的修饰的测试蛋白
本实施例说明了与多轮测试中的支架TIC844或Cry1Da1蛋白的活性相比，增强的鳞翅目抑制谱和/或一些修饰的测试蛋白的改善或更大的鳞翅目抑制活性的发现。
由实施例1所述的工程实践生成并且在实施例2所述的昆虫生物测定中测试的经修饰的测试蛋白在重复轮中进行测试，其中将经修饰的测试蛋白的鳞翅目物种活性与其各自的母体支架蛋白(即，TIC844或Cry1Da1)进行比较。在第一轮中，三百七十(370)种不同的修饰的测试蛋白在饮食生物测定中表现出相对于TIC844或Cry1Da1针对CEW的毒性增加。在每种这些饮食生物测定中，在受控的单剂量测定条件下，将相同量的蛋白质(修饰的测试蛋白或支架蛋白)提供给CEW。通过测量和比较观察到的每种修饰的测试蛋白生物测定的死亡率和发育迟缓与观察到的母体支架蛋白生物测定的死亡率和发育迟缓，来测定修饰的测试蛋白和支架蛋白的效力。
当与单剂量测定筛选中的支架蛋白相比时，显示出针对CEW的毒性增加的三百七十(370)个修饰的测试蛋白中，其中约一百八十(180)个在FAW生物测定中进一步测试，与其支架蛋白母体相比，确定这些修饰的测试蛋白是否维持或表现出增加的FAW活性。这些修饰的测试蛋白中约四十(40)至五十(50)种表现出与其母体支架蛋白相似或更好的FAW活性。还在另外的CEW生物测定中对这些进一步筛选的修饰的测试蛋白进行测试以确认CEW活性。这些轮次选择和测试修饰的测试蛋白(其表现出改善的CEW活性，同时保持或改善FAW活性)导致改良变体(本文称为“工程化的杀虫蛋白”)的最终列表。表2鉴定了这些工程化的杀虫蛋白和每种工程化的杀虫蛋白中的氨基酸突变。表2还显示了支架和工程化的杀虫蛋白针对CEW和FAW的活性(杀虫活性以LC50值(在固定的暴露持续时间内杀死50％昆虫群体所需的毒素浓度。LC50值越低，毒性越大)和MIC50值(在固定的暴露持续时间内抑制50％的幼虫蜕皮成特定龄期所需的浓度)说明)。该表显示工程化的杀虫蛋白具有改善的CEW活性，同时保持或改善FAW活性。
表2.支架蛋白和工程化的杀虫蛋白的氨基酸突变和活性数据。
*使用标准IUPAC氨基酸代码鉴定氨基酸突变。参见IUPAC-IU B生物化学命名联合委员会。Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides.Eur.J.Biochem.138:9-37(1984)。第一个氨基酸序列缩写表示给定支架蛋白中的原始氨基酸，该数字表示氨基酸的位置，第二个氨基酸序列缩写表示在改良的变体蛋白中置于该位置的氨基酸。
**Cry1Da1的核心毒素与TIC844的核心毒素相同。
进一步说明增强的鳞翅目抑制谱和改善的工程化的杀虫蛋白的鳞翅目抑制活性，工程化的杀虫蛋白TIC844_8相对于其母体支架蛋白的致死率如图1所示。图1的柱状图说明了与支架蛋白TIC844相比，TIC844_8针对两种不同的CEW集落Union City和Benzon的MIC50值。图1所示的生物测定结果从蔗糖梯度纯化的生物测定制备方法计算。用蔗糖梯度纯化制备与蛋白质的伴孢晶体制剂相反的蛋白质，这些二次生物测定的原因是确保TIC844_8的改善的活性持续进行更广泛的纯化。此外，测试Union City集落以确认在Benzon集落上观察到的改善的活性。如图1所示，TIC844_8的三个残基的突变(S282V_Y316S_I368P)相对于TIC844对于Union City集落CEW致死率提高了8倍，并且相对于TIC844对于Benzon集落CEW致死率提高了50倍。
甚至进一步证明工程化的杀虫蛋白的增强的鳞翅目抑制谱和改善的鳞翅目抑制活性，来自针对广谱鳞翅目昆虫物种进行的饮食生物测定研究中的TIC844和TIC844_8的昆虫活性概况示于表3中。在表3的生物测定研究中测试的昆虫包括黑切根虫(BCW，球菜夜蛾)、玉米穗虫(CEW，美洲棉铃虫)、草地贪夜蛾(FAW，草地夜蛾)、南部行军虫(SAW，亚热带粘虫(Spodoptera eridiania))、卷心菜尺蠖(CLW，粉纹夜蛾)、欧洲玉米螟虫(ECB，欧洲玉米螟)、西南部玉米螟虫(SWC，西南玉米杆草螟)、烟草夜蛾(TBW，烟草夜蛾)、黎豆夜蛾(VBC，黎豆夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))和甘蔗螟虫(SCB，小蔗螟)。此表3显示了与母体支架蛋白TIC844相比TIC844_8的增强的鳞翅目抑制谱，特别是对CEW和VBC具有改善的活性。
表3.TIC844和TIC844_8的昆虫活性谱。
*针对指示的昆虫物种有活性。
表4中进一步证实了工程化的杀虫蛋白的增强的鳞翅目抑制谱，其描绘了来自饮食生物测定研究的某些工程化的杀虫蛋白的昆虫活性概况。在表4的生物测定研究中测试的昆虫包括东半球棉铃虫(CBW，棉铃虫)、烟草切根虫(TCW，斜纹夜蛾)、甜菜夜蛾(BAW，甜菜夜蛾)、棉红铃虫(PBW，棉红铃虫)、粉茎螟虫(PSB，稻蛀茎夜蛾)和斑点螟蛉(SBW，翠纹金刚钻(Earias vitella))。表4中所示的结果显示了与支架蛋白Cry1Da1相比，列出的工程化的杀虫蛋白的鳞翅目抑制谱增强，特别是针对CBW、PBW(Cry1Ac抗性)、PBW(田间收集)和SBW具有改善的活性。
表4.Cry1Da1和工程化的杀虫蛋白的昆虫活性概况比较。
+针对指示的昆虫物种有活性。
实施例4
合成编码工程化的杀虫蛋白的基因和用于在植物中表达的支架蛋白
本实施例说明编码工程化的杀虫蛋白的多核苷酸和用于在植物中表达的支架蛋白的合成。
根据美国专利No.5,500,365中通常描述的方法设计和合成编码用于在植物中表达的支架蛋白和工程化的杀虫蛋白的核苷酸序列，避免某些无效问题序列诸如ATTTA和富含A/T的植物多聚腺苷酸化序列，同时保留原始支架或工程化的杀虫蛋白的氨基酸序列。用于在植物中表达的编码工程化的杀虫蛋白和支架蛋白的这些基因的核苷酸序列列于下表5中。
表5.设计用于在编码支架和工程化的杀虫蛋白的植物中使用的多核苷酸序列。
**变体名称“A2”表示与用于克隆目的的天然序列相比在氨基酸位置2处将丙氨酸残基插入植物表达载体中。
实施例5
用于在植物中表达工程化的杀虫蛋白的表达盒
本实施例说明了包含设计用于植物中的编码支架和工程化的杀虫蛋白的多核苷酸序列的表达盒的构建。
用表5中提供的用于植物表达设计的编码支架和工程化的杀虫蛋白的多核苷酸序列构建多种植物表达盒。此类表达盒可用于植物原生质体中的瞬时表达或植物细胞的转化。关于蛋白质在细胞内的最终放置设计典型的表达盒。以一种允许蛋白质翻译并保留在胞质溶胶中的方式设计一组表达盒。另外一组表达盒被设计成具有与毒素蛋白连接的转运肽，以允许靶向细胞的细胞器诸如叶绿体或质体。所有表达盒被设计为在5’端开始具有启动子，其可以由多个启动子元件、增强子元件或本领域普通技术人员已知的其它表达元件组成，可操作地连接以增强转基因的表达。启动子序列通常与一个或多个前导序列3’连续地连接至启动子。内含子序列通常提供3’到前导序列以改善转基因的表达。毒素或转运肽的编码序列和毒素的编码序列通常位于可操作地连接的启动子、前导序列和内含子构型的3’。编码序列的3’通常提供3’UTR序列，以促进转录终止并提供对所得转录物的多聚腺苷酸化重要的序列。上述所有元素可操作地连接并顺序排列，通常具有提供用于构建表达盒的另外的序列。
实施例6
含有支架或工程化的杀虫蛋白表达盒的转化载体
本实施例说明将支架或工程化的杀虫蛋白掺入植物组织中。
用于产生表达编码支架蛋白或工程化的杀虫蛋白的核酸片段的转基因植物的方法可以利用本领域熟知的方法的变型进行。通常，该方法包括用含有可操作地连接到编码一个或多个工程化的杀虫蛋白或支架蛋白的编码区的启动子的DNA片段转化合适的宿主细胞。此类编码区通常可操作地连接到转录终止区，由此启动子能够驱动细胞中编码区的转录，并因此提供细胞在体内产生多肽的能力。用于转化此类细胞的载体、质粒、粘粒和DNA片段通常包含天然或合成来源的操纵子、基因或基因衍生的序列，特别是编码所公开的工程化的杀虫蛋白的那些。这些DNA构建体还可包括诸如启动子、增强子、多接头或其它能够对特定目的基因具有调节活性的基因序列的结构。测试所得转基因植物、植物部分和植物细胞的编码的蛋白的表达和生物活性。
可以修饰以获得表达鳞翅目活性蛋白的转基因植物的方法的实例包括描述例如Cry1A蛋白(美国专利号5,880,275)、Cry1B(美国专利申请号10/525318)、Cry1C(美国专利号6,033,874)、Cry1A/F嵌合体(美国专利号7,070,982；6,962,705和6,713,063)和Cry2Ab蛋白(美国专利号7,064,249)的那些。
实施例7
稳定转化的玉米中工程化的杀虫蛋白的鳞翅目活性
本实施例说明了当在玉米植物中表达时，由工程化的杀虫蛋白针对鳞翅目害虫表现出抑制活性，并且作为对相应昆虫害虫的饮食提供。
使用含有实施例6中所述的表达盒的载体产生表达Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno蛋白的R0转基因玉米植物。将F1转基因玉米植物从通过未转化的具有来自R0转化体的花粉的野生型商业种质植物的授粉穗产生的种子生长。
通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘的生物测定与美国专利号8,344,207中所述的类似进行。使用未转化的植物获得阴性对照组织。评估来自每个二元载体的多重转化事件，并将结果列表。
在F1和R0中表达Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno蛋白的转基因玉米植物的杀虫活性，除针对在田间的F1中表达Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno蛋白的转基因玉米植物的活性外在表6中提供。具体来说，表6显示了当针对CEW、FAW和SWC测试时，相比于母体支架蛋白Cry1Da1的Cry1Da1_7.nno的鳞翅目活性概况。从表6可以看出，与Cry1Da1不同，Cry1Da1_7.nno显示了在R0和F1生物测定和F1田间测试中针对CEW和FAW的活性。
表6.在玉米植物中表达的Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno的昆虫活性概况。
+针对昆虫物种有活性；-针对昆虫物种无活性；NT未测试
实施例8
在稳定转化的棉花中工程化的杀虫蛋白的鳞翅目活性
本实施例说明了当在棉花植株中表达时由工程化的杀虫蛋白针对鳞翅目害虫表现的抑制活性，并且作为对相应昆虫害虫的饮食提供。
使用含有实施例6中所述的表达盒的载体产生表达Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno蛋白的棉花植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。棉花叶组织用于实施例7所述的生物测定中，并针对CBW、FAW、烟草夜蛾(TBW，烟草夜蛾)和SBL进行测试。表7显示了在稳定转化的R0代棉花中针对这些鳞翅目物种观察到的活性。从表7可以看出，Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno在稳定转化的R0代棉花中显示针对两种或更多种鳞翅目害虫物种的活性。
表7.在R0代棉花中表达的Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno的生物测定活性概况。
+针对昆虫物种有活性；-针对昆虫物种无活性。
选择的转化事件用于产生R1植物。测定表达Cry1Da1_7.nno的R1植物对CBW、FAW和SBL的抗性。叶、棉蕾和圆荚组织用于生物测定，除了在防虫网室(screenhouse)中进行的田间测试外。表8显示了在这些测试中观察到的活性。如表8所示，Cry1Da1_7.nno在生物测定和田间测试中显示针对CBW、FAW和SBL的活性。
表8.在R1代棉花中表达的Cry1Da1_7.nno的昆虫活性概况。
+针对昆虫物种有活性；-针对昆虫物种无活性。
实施例9
稳定转化的大豆中工程化的杀虫蛋白的鳞翅目活性
本实施例说明了当在大豆植物中表达时，工程化的杀虫蛋白针对鳞翅目害虫表现的抑制活性，并且作为对相应昆虫害虫的饮食提供。
使用含有实施例6中所述的表达盒的载体产生表达Cry1Da1_7.nno、TIC844_9.nno和TIC844_11.nno蛋白的大豆植物。收获叶组织，并用于如实施例7所述的生物测定中，或者可选地，使用冻干组织用于昆虫饮食用于生物测定。针对各种鳞翅目物种进行生物测定，包括SAW、SBL和大豆蠕虫(SPW，美洲棉铃虫)。表9显示了在稳定转化的R0代大豆中针对这些鳞翅目害虫观察到的活性。从表9可以看出，Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno显示出针对SPW、SAW和SBL的活性。TIC844_9.nno(TIC844加上用于克隆的加成丙氨酸)没有显示出针对SPW的活性。
表9.在R0代大豆中表达的Cry1Da1_7.nno、TIC844_9.nno和TIC844_11.nno的生物测定活性概况。
+针对昆虫物种有活性；-针对昆虫物种无活性。
选择的转化事件用于产生R1植物。测定表达Cry1Da1_7.nno的R1植物对SAW、SBL、SPW和黎豆夜蛾(VBC，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))的抗性。从R1代植物收获叶组织并用于摄食生物测定。表10显示了在这些测试中观察到的活性。如表10所示，Cry1Da1_7.nno显示了针对SPW、SAW和SBL的活性。
表10.在R1代大豆中表达的Cry1Da1_7.nno的生物测定活性概况。
+针对昆虫物种有活性；-针对昆虫物种无活性。
表11显示了在具有表达Cry1Da1_7.nno的稳定转化的R1代大豆植物的防虫网室中进行的田间测试的结果。用于在防虫网室中侵染植物的物种包括黑色行军虫(Black armyworm)(BLAW，考斯夜蛾(Spodoptera cosmioides))、豆根夜蛾(Bean shoot moth)(BSM，Crocidosema aporema)、南美豆虫(South American podworm)(SAPW，大豆荚虫(Helicoverpa gelotopoeon))、向日葵尺蠖(SFL，薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu))和VBC。表11显示了在这些测试中观察到的活性。如表11所示，Cry1Da1_7.nno显示针对BLAW、SAPW和SFL的活性。
表11.在防虫网室田间测试中测试的R1代大豆中表达的Cry1Da1_7.nno的活性概况。
+针对昆虫物种有活性；-针对昆虫物种无活性。
鉴于本公开内容，本文公开和要求保护的所有组合物和方法可以在没有过多实验的情况下制备和执行。虽然已经根据上述说明性实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，变型、变化、修饰和改变可以应用于组合物、方法和本文描述的方法的步骤或步骤的顺序，而不脱离本发明的真实概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。