两个黄酮及其制备方法和用途与流程

本发明属于医药技术领域，具体是从天然产物中提取活性成分。

背景技术：

炎症在医学上占有重要的地位，它是许多疾病的基本病理过程。炎症在疾病中所起的作用被认为是令机体陷入了过分活跃的免疫系统，比如哮喘、过敏和风湿性关节炎。抗炎药物分为甾体抗炎药和非甾体抗炎药两种，其中人类对非甾体抗炎药的使用从水杨酸的发现开始已经有100多年的历史。非甾体抗炎药具有确定的抗炎、镇痛的效果。此外，近年来人们正逐渐认识到炎症和慢性感染是人类不同肿瘤发生的重要因素之一。据研究估计，至少有15％的癌症是由慢性炎症发展而成的，流行病学研究已经发现，定期服用非甾体抗炎药的人比没有服用此类药物的人患癌症的风险降低。在我国，非甾体抗炎药已经成为临床上仅次于抗感染药的第二大类用药。但是，非甾体抗炎药所致不良反应的发生率之高，同样不容忽视。据现有文献和国家权威机构监测结果显示，在使用非甾体抗炎药的人群中，约有20％-25％出现不同程度的不良反应，主要表现为胃肠道反应、神经系统反应、肝肾功能反应以及心血管系统反应等。

炎性细胞能产生众多有助肿瘤形成、生长和存活的物质，其中之一是一氧化氮(no)。no是具有生物活性的气体分子，是细胞间信息传递的重要调节因子，并有介导细胞免疫和炎症毒性的功能。no的过量生成与炎症密切相关，在急性炎症部位，致炎物质和炎症介质可诱导或增加no的合成和释放，no本身具有细胞毒性，还能与游离基团反应生成如onoo-等分子，导致毒性增加，从而促进炎症部位渗出和水肿。

我国传统中药中“清热解毒”、“祛风除湿”、“扶正固本”等作用与现代医学的抗炎、免疫的观念密切相关，并且毒副作用小、资源丰富。因此通过采用现代的生物活性筛选模型，从中草药中寻找到高效、毒副作用低的抗炎活性成分或先导化合物，尤其是有效抑制no释放的黄酮类化合物，进而开发为对炎症有预防与治疗的药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供从青天葵中提取的两个黄酮及其制备方法和用途。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

8kg干燥的青天葵(nerviliafordii(hance)schltr.)药材分别加入8l的95％(体积比，下同)乙醇回流提取两次，每次2h。醇提后的药材残渣再分别用8l的蒸馏水回流提取两次，每次2h。合并两次的水提液，减压浓缩，得到粗提物1022g。将粗提物上d101大孔树脂，乙醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脱后得到6个流分，编号为fr.1-6；其中，第五个流分fr.5得到357g，用ods-c18柱层析，甲醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脱后得到6个亚流分，编号为fr.51-56；第四个亚流分fr.54得到4.8g，经制备液相分离，色谱条件：流动相为乙腈-水(25∶75)，色谱柱为ymcods-a(20×250mm，10μm)，流速8.0ml/min，紫外检测波长为265nm，即得到两个化合物，通过ms、nmr等测定其结构。

本发明的益效是：

1.提供了从青天葵中获得两个黄酮的制备方法。

2.本发明得到的两个黄酮与现有的临床合成药物相比较，不但具有抗炎活性好、毒副作用低的优点，而且来自传统中药，安全可靠，具有非常良好的药用前景，可做成包括但不限于颗粒剂、片剂、注射剂等各种剂型。

附图说明

图1为nervilifordink的¹h-nmr

图2为nervilifordink的¹³c-nmr

图3为nervilifordink的hmbc

图4为nervilifordink的hsqc

图5为nervilifordink的高分辨质谱图

图6为nervilifordinl的¹h-nmr

图7为nervilifordinl的¹³c-nmr

图8为nervilifordinl的hmbc

图9为nervilifordinl的esi-ms

图10为分离流程图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

8kg干燥的青天葵(nerviliafordii(hance)schltr.)药材分别加入8l的95％(体积比，下同)乙醇回流提取两次，每次2h。醇提后的药材残渣再分别用8l的蒸馏水回流提取两次，每次2h。合并两次的水提液，减压浓缩，得到粗提物1022g。将粗提物上d101大孔树脂，乙醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脱后得到6个流分，编号为fr.1-6；其中，第五个流分fr.5得到357g，用ods-c18柱层析，甲醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脱后得到6个亚流分，编号为fr.51-56；第四个亚流分fr.54得到4.8g，经制备液相分离，色谱条件：流动相为乙腈-水(25∶75)，色谱柱为ymcods-a(20×250mm，10μm)，流速8.0ml/min，紫外检测波长为265nm，即得到两个化合物，通过ms、nmr等测定其结构，分别命名为nervilifordink和nervilifordinl。结构如下示所示。

下表为两个化合物的nmr信号归属。

表1nmrdata(600and150mhz，resp.，indmso-d6)ofnervilifordinkandl.δinppm，jinhz.

药理学实验：

mtt法评价细胞毒性，选取无细胞毒性的药物浓度进行研究。取raw264.7小鼠巨噬细胞，按2×10⁵/ml的密度接种于96孔细胞培养板(100μl/孔)。贴壁24h后，每孔加入50μl终浓度为1μg/ml的lps(空白对照组加入等体积的磷酸盐缓冲液pbs)，在37℃、5％co2孵育2h后，实验组加入不同浓度的样品溶液(空白对照组和模型组加入等体积的无血清培养基)，每个浓度设4个复孔，培养箱内孵育24h后吸取培养上清液50μl至酶标板中，加入等体积的griess试剂a和griess试剂b(griess试剂a为0.1％n-萘乙二胺盐酸盐，griess试剂b为5％h3po4含1％对氨基苯磺酰胺，用前1∶1混合)，室温反应10min后测定540nm处的吸光值。地塞米松为阳性对照药品。

用浓度分别为0，1，5，10，20，50μmol/l的nano2绘制标准曲线，根据nano2标准曲线计算细胞培养上清液中no2^-的浓度以及对no释放的抑制率，抑制率计算公式为：

表22个黄酮对raw264.7细胞释放no的影响

结论：采用mtt法测定2个化合物对lps诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7的毒性，并测定对raw264.7细胞生成no的影响，结果发现，在对细胞正常增殖无明显影响的浓度范围内，2个化合物对lps诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7的no释放表现出不同程度的抑制活性。在抗炎药物领域的应用有较好的前景。