技术领域本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种苯丙素类化合物的制备方法。
背景技术：
从天然药物中提取分离得到的成分结构多样、活性显著，对其进行分离纯化、结构修饰、改造和全合成，一直是新药研发的一个主要思路。TNF-α：是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，然而其毒副作用也非常严重。IL-1β：在局部低浓度时协同刺激APC和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌抗体，进行免疫调节。大量产生时有内分泌效应：诱导肝脏急性期蛋白合成，引起发热和恶病质。IL-6：人类IL-6基因位于第7号染色体上；IL-6分子量在21～30KD之间。主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生。能够刺激活化B细胞增殖，分泌抗体；刺激T细胞增殖及CTL活化；刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应；促进血细胞发育。IL-6可由多种细胞合成，包括活化的T细胞和B细胞、单核－巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。IL-6作用的靶细胞很多，包括巨噬细胞、肝细胞、静止的T细胞、活化的B细胞和浆细胞等；其生物效应也十分复杂。OH为生物系统中最具活性的活性氧物质，能导致细胞及生物体内DNA，蛋白质和脂质氧化损伤。巨噬细胞能产生多种炎症介质参与炎症反应，其中，NO为重要的细胞炎症因子，NO参与多种生理病理过程，过量NO会促进炎症性疾病的发生与发展，并且还能诱导其他炎症因子。因此，寻求一种新的制备方法，从天然植物中分离出新的化合物，以抑制细胞炎症因子NO的含量及细胞炎症因子TNF-α的表达作用，抑制羟基自由基(-OH)的活性，应用于炎症性疾病的治疗，是非常有必要的。千斤拔药材为豆科(Leguminosae)千斤拔属(Flemingl.Roxb.或Moghania)植物大叶千斤拔(Moghaniamacrophylla(Willd.)O.Kuntze)的干燥根，在我国主要分布于东南部地区。该植物在中国植物志(1995，41:313)、台湾植物志(1977，3:258)、海南植物志(1965，2:311)、《中国高等植物图鉴》(1972，2:510)、中国主要植物图说(1955，pp707)和广州植物志(1956，pp361)中均有收录。千斤拔药材为广西地区的道地药材，史载于《植物名实图考》，有着广泛的民间用药基础。其性味甘，微涩，平，具有清热除湿等功效，主要用于治疗风湿骨痛、跌打损伤、慢性肾炎、痛经和白带多等妇科疾病。该药材目前已收载入2005年版《中国药典》附录。大叶千斤拔已报道的成分主要有黄酮类、甾类、萜类、蒽醌类、挥发油类成分，均具有一定的药理活性。大叶千斤拔药理活性多样，报道较多的有神经保护作用，抗炎、抗氧化作用，对病原微生物的驱虫作用、类激素作用、细胞毒作用，抗菌作用以及免疫增强作用、抗疲劳作用。千斤拔目前广泛应用于妇科、风湿痹痛等类型的中成药生产，如妇科千金片、妇科千金胶囊、金鸡冲剂、金鸡胶囊等，此类中成药主要用于妇科病(痛经、子宫寒冷不孕、子宫下垂、盆腔炎、乳腺炎、白带多、产后血虚、关节痛、产后腰膝痛、缺乳和乳疮等)，虚弱贫血(妇女贫血，气血虚弱和病后气虚等)。近年来，临床报道较多的是妇科千金片在治疗妇科炎症方面的作用。目前，在千斤拔的文献中，报道苯丙素类化合物的文献极少，寻找一种新的制备方法，从天然植物中分离出有效的苯丙素类新化合物，对其进行分离纯化、结构修饰和合成，开发新药，应用于炎症性疾病的治疗，意义重大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从大叶千斤拔的干燥根中分离得到的一种苯丙素类化合物的制备方法，通过该制备方法提取分离得到的化合物可以抑制细胞炎症因子NO的含量及细胞炎症因子TNF-α的表达作用，具有对羟基自由基的(-OH)的抑制作用，进而具有抗炎及抗氧化活性，有益于各种炎症性疾病的治疗，可以将该化合物开发成新药。具体地，本发明所述苯丙素类化合物的制备方法包括如下步骤：S1.取大叶千斤拔的根部为原料，干燥，切块，经乙醇溶液提取，将提取液合并，浓缩至无醇味，得浸膏备用；S2.将步骤S1中所得浸膏加水溶解，采用大孔吸附树脂柱对其进行洗脱，洗脱剂为乙醇-水系统，收集前3个柱体积的洗脱液，命名为MM-1，备用；S3.将步骤S2中收集到的流分MM-1用反相材料ODS柱层析进行洗脱，洗脱剂为甲醇-水系统，洗脱18个柱体积，按每3个柱体积收集一个流分的洗脱液，按顺序收集6个流分，分别命名为MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16，备用；S4.将步骤S3中收集到的流分MM-12用制备液相分离，流动相为甲醇-水-乙酸系统，按出峰顺序收集洗脱液，共收集7个流分，分别命名为MM-121，MM-122，MM-123，MM-124，MM-125，MM-126，MM-127，备用；S5.将步骤S4中收集到的流分MM-125用制备液相纯化，流动相为甲醇-水-乙酸系统，收集洗脱液，重结晶后得到所述苯丙素类化合物。所述苯丙素类化合物纯度为99.84％。所述苯丙素类化合物的结构式如式(1)所示：优选地，步骤S1中，乙醇溶液的浓度为50～80体积％，进一步优选为乙醇溶液浓度为60体积％。优选地，步骤S1中，乙醇溶液的提取次数为2～4次，每次提取1～3小时，进一步优选为乙醇溶液的提取次数为3次，每次2小时。优选地，步骤S2中，大孔吸附树脂采用D101大孔吸附树脂。优选地，步骤S2中，乙醇与水的体积比为：0:100～15:85。优选地，步骤S3中，甲醇与水的体积比为20:80～30:70，进一步优选为25:75。优选地，步骤S4中，甲醇-水-乙酸的体积比为10:90:0.01～35:65:0.01，进一步优选为15:85:0.01。优选地，步骤S4中，制备液相色谱柱为YMC，20mm*250mm，流动相流速为：5～10ml/min，优选为流速5ml/min。优选地，步骤S5中，甲醇-水-乙酸的体积比为15:85:0.01。优选地，步骤S5中，制备液相色谱柱为YMC，20mm*250mm，流动相流速为5mL/min。本发明提供所述制备方法制备得到的苯丙素类化合物。以及以所述苯丙素类化合物为原料经化学合成方法制备得到的苯丙素类化合物盐。所述盐的结构如式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示：其中，R为无机酸，R1或R2或R3为磺酸根、碱金属离子或铵根中的任意一种或任意两种或任意三种。优选地，所述无机酸为盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸或乳酸；所述磺酸根为具有芳基的磺酸根；所述碱金属离子为钾离子、钠离子、钙离子、镁离子或锂离子。优选地，所述具有芳基的磺酸根为苯磺酸根或对甲苯磺酸根。优选地，所述药学上可接受的盐为铵盐。本发明的有益效果：本发明为新的苯丙素类化合物及其药学上可接受的盐提供了一种制备方法，首次从大叶千斤拔的干燥根中分离得到的一种新苯丙素类化合物，制得的化合物可以抑制细胞炎症因子NO的含量及细胞炎症因子TNF-α的表达作用，具有对羟基自由基的(-OH)的抑制作用，进而具有抗炎及抗氧化活性，可以用作如宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或关节炎等炎症性疾病的治疗药物。本发明的目的是从传统的中药处方中，通过从妇科千金片及妇科千金胶囊的处方中，通过溶剂提取、柱层析分离、制备液相分离、纯化制得一种新苯丙素类化合物，并通过实验证实，其可以应用于炎症性疾病，如宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或关节炎等疾病的治疗。具体地，发明人通过从妇科千金片、妇科千金胶囊的处方中，科学选取大叶千斤拔的干燥根，通过溶剂提取、柱层析分离、制备液相分离、纯化，得到本发明所述苯丙素类化合物，然后对该化合物进行细胞试验，测定其对细胞炎症因子NO，TNF-α及羟基自由基(-OH)的抑制程度，实验表明，该化合物在浓度(6.88–12.38μg/mL)范围内对LPS引起的NO含量升高有明显的抑制作用，并表现出明显的剂量依赖关系。在浓度(6.88–12.38μg/mL)范围内，能显著抑制Raw264.7细胞产生炎症因子TNF-α(p＜0.05)，并呈显著的剂量依赖关系，在浓度(4.13–12.38μg/mL)范围内对LPS引起的OH含量升高有明显的抑制作用，并表现出一定的剂量依赖关系。附图说明图1为本发明所述苯丙素类化合物的核磁共振氢谱图。图2为本发明所述苯丙素类化合物的核磁共振碳谱图。图3为本发明所述苯丙素类化合物对细胞活性的影响图。图4为本发明所述苯丙素类化合物对NO的抑制作用图。图5为本发明所述苯丙素类化合物对TNF-α的抑制作用图。图6为本发明所述苯丙素类化合物对IL-1β的抑制作用图。图7为本发明所述苯丙素类化合物对IL-6的抑制作用图。图8为本发明所述苯丙素类化合物对OH的抑制作用图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本实施例所用的原料和设备均为本技术领域常规市购的原料和设备。本发明的化合物是所述式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物及式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示该化合物药学上可接受的盐。该化合物可以采用本发明提供的以大叶千斤拔为原料提取的方法制备得到，也可以根据本发明提供的结构式结合采用本领域的化学合成等方法制备得到。作为本发明所述苯丙素类化合物的盐，只要是药学上可接受的盐即可，可列举为与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸等无机酸形成的无机酸盐；与磺酸形成的磺酸盐；与钾、钠、钙、镁、锂等碱金属的氢氧化物形成的碱金属盐，与铵形成的铵盐等。本发明苯丙素类化合物可用作如宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或关节炎等炎症性疾病的治疗药物。本发明化合物可以与药学上允许的辅料和/或载体一起用作药物组合物，也可以在加入药学上允许的辅料和/或载体的情况下与金樱根、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参中的一种或几种中药材或提取物的组合用作药物组合物，本发明化合物还可以与其他药学上可接受的药效成分一起用作药物组合物。作为药物组合物，可以是片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂、软膏剂、栓剂、喷雾剂等。进一步地，片剂可以是在添加药学上允许的辅料和/或载体的情况下制成的糖衣片、薄膜衣片、肠溶性包衣片或双层片、多层片。本发明的辅料和/或载体可以如下：制成固体制剂，可以使用添加剂，例如蔗糖、乳糖、纤维素糖、麦芽糖醇、葡萄糖、淀粉类、琼脂、海藻酸盐类、甲壳素、壳聚糖类、果胶类、阿拉伯树胶类、明胶类、胶原类、酪蛋白、白蛋白、磷酸钙、山梨糖醇、甘氨酸、甘油、聚乙二醇、碳酸氢钠、滑石等。制成半固体制剂，可以使用动植物性油脂(橄榄油、玉米油、蓖麻油等)、矿物性油脂(凡士林、白凡士林、固态石蜡等)、蜡类(霍霍巴油、巴西棕榈蜡、蜂蜡等)、部分合成或全合成的甘油脂肪酸酯(月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸等)等。制成液体制剂，可使用添加剂，例如氯化钠、葡萄糖、山梨糖醇、甘油、橄榄油、丙二醇、乙醇等。尤其制成注射剂的情况下，可以使用无菌水溶液，例如生理盐水、等渗液、油性液，如麻油、大豆油。另外，还可以根据需要，并用适当的助悬剂，如羧甲基纤维素钠，非离子表面活性剂、助溶剂，如苯甲酸苄酯、苯甲醇等。这些制剂的有效成分的量为制剂的0.01～80重量％，适宜为1～50重量％，给药量根据患者的症状、体重、年龄等不同而变化。实施例1苯丙素类化合物的制备本实施例提供式(Ⅰ)所示苯丙素类化合物的一种制备方法，包括如下步骤：S1.取大叶千斤拔50kg，以根部为原料，干燥，切成小块。经8倍量60％的乙醇回流提取3次，每次2小时，将提取液合并，浓缩至无醇味，得浸膏备用；S2.将步骤S1中浓缩后的浸膏溶于10L水中，采用D101大孔吸附树脂柱对其进行洗脱，洗脱剂为水，洗脱3个柱体积，收集洗脱液，命名为MM-1，备用；S3.将步骤S2中收集到的流分MM-1用反相ODS柱层析进行洗脱，洗脱剂为甲醇-水系统，其体积比为25:75，洗脱18个柱体积，按每3个柱体积收集一个流分的洗脱液，按顺序收集6个流分，分别命名为：MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16备用；S4.将步骤S3中的收集到的流分MM-12用制备液相分离，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：5ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为25:75:0.01，按出峰顺序收集洗脱液，共收集7个流分，分别命名为MM-121，MM-122，MM-123，MM-124，MM-125，MM-126，MM-127，备用；S5.将步骤S4中收集到的流分MM-125用制备液相纯化，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：5ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为15:85:0.01，收集洗脱液，重结晶后得到所述苯丙素类化合物。实施例2苯丙素类化合物的制备本实施例提供式(Ⅰ)所示苯丙素类化合物的一种制备方法，包括如下步骤：S1.取大叶千斤拔40kg，以根部为原料，干燥，切成小块。经6倍量50％的乙醇回流提取2次，每次1小时，将提取液合并，浓缩至无醇味，得浸膏备用；S2.将步骤S1中浓缩后的浸膏溶于5L水中，采用D101大孔吸附树脂柱对其进行洗脱，洗脱剂为乙醇与水的体积比为15:85，洗脱3个柱体积，收集洗脱液，命名为MM-1，备用；S3.将步骤S2中收集到的流分MM-1用反相ODS柱层析进行洗脱，洗脱剂为甲醇-水系统，其体积比为20:80，洗脱18个柱体积，按每3个柱体积收集一个流分的洗脱液，按顺序收集6个流分，分别命名为：MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16备用；S4.将步骤S3中的收集到的流分MM-12用制备液相分离，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：10ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为35:65:0.01，按出峰顺序收集洗脱液，共收集7个流分，分别命名为MM-121，MM-122，MM-123，MM-124，MM-125，MM-126，MM-127，备用；S5.将步骤S4中收集到的流分MM-125用制备液相纯化，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：5ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为15:85:0.01，收集洗脱液，重结晶后得到所述苯丙素类化合物。实施例3苯丙素类化合物的制备本实施例提供式(Ⅰ)所示苯丙素类化合物的一种制备方法，包括如下步骤：S1.取大叶千斤拔60kg，以根部为原料，干燥，切成小块。7倍量70％的乙醇回流提取4次，每次3小时，将提取液合并，浓缩至无醇味，得浸膏备用；S2.将步骤S1中浓缩后的浸膏溶于8L水中，采用D101大孔吸附树脂柱对其进行洗脱，洗脱剂为乙醇与水的体积比为10:90，洗脱3个柱体积，收集洗脱液，命名为MM-1，备用；S3.将步骤S2中收集到的流分MM-1用反相ODS柱层析进行洗脱，洗脱剂为甲醇-水系统，其体积比为30:70，洗脱18个柱体积，按每3个柱体积收集一个流分的洗脱液，按顺序收集6个流分，分别命名为：MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16备用；S4.将步骤S3中的收集到的流分MM-12用制备液相分离，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：10ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为30:70:0.01，按出峰顺序收集洗脱液，共收集7个流分，分别命名为MM-121，MM-122，MM-123，MM-124，MM-125，MM-126，MM-127，备用；S5.将步骤S4中收集到的流分MM-125用制备液相纯化，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：5ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为15:85:0.01，收集洗脱液，重结晶后得到所述苯丙素类化合物。实施例4苯丙素类化合物的制备本实施例提供式(Ⅰ)所示苯丙素类化合物的一种制备方法，包括如下步骤：S1.取大叶千斤拔50kg，以根部为原料，干燥，切成小块。8倍量60％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，将提取液合并，浓缩至无醇味，得浸膏备用；S2.将步骤S1中浓缩后的浸膏溶于6L水中，采用D101大孔吸附树脂柱对其进行洗脱，洗脱剂为乙醇与水的体积比为5:95，洗脱3个柱体积，收集洗脱液，命名为MM-1，备用；S3.将步骤S2中收集到的流分MM-1用反相ODS柱层析进行洗脱，洗脱剂为甲醇-水系统，其体积比为25:75，洗脱18个柱体积，按每3个柱体积收集一个流分的洗脱液，按顺序收集6个流分，分别命名为：MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16备用；S4.将步骤S3中的收集到的流分MM-12用制备液相分离，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：10ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为25:75:0.01，按出峰顺序收集洗脱液，共收集7个流分，分别命名为MM-121，MM-122，MM-123，MM-124，MM-125，MM-126，MM-127，备用；S5.将步骤S4中收集到的流分MM-125用制备液相纯化，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：5ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为15:85:0.01，收集洗脱液，重结晶后得到所述苯丙素类化合物。实施例5苯丙素类化合物的制备本实施例提供式(Ⅰ)所示苯丙素类化合物的一种制备方法，包括如下步骤：S1.取大叶千斤拔50kg，以根部为原料，干燥，切成小块。8倍量80％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，将提取液合并，浓缩至无醇味，得浸膏备用；S2.将步骤S1中浓缩后的浸膏溶于6L水中，采用D101大孔吸附树脂柱对其进行洗脱，洗脱剂为乙醇与水的体积比为10:90，洗脱3个柱体积，收集洗脱液，命名为MM-1，备用；S3.将步骤S2中收集到的流分MM-1用反相ODS柱层析进行洗脱，洗脱剂为甲醇-水系统，其体积比为28:72，洗脱18个柱体积，按每3个柱体积收集一个流分的洗脱液，按顺序收集6个流分，分别命名为：MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16备用；S4.将步骤S3中的收集到的流分MM-12用制备液相分离，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：10ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为10:90:0.01，按出峰顺序收集洗脱液，共收集7个流分，分别命名为MM-121，MM-122，MM-123，MM-124，MM-125，MM-126，MM-127，备用；S5.将步骤S4中收集到的流分MM-125用制备液相纯化，制备液相色谱柱为：YMC，20mm*250mm，流速：5ml/min，流动相为甲醇-水-乙酸系统，甲醇：水：乙酸的体积比为15:85:0.01，收集洗脱液，重结晶后得到所述苯丙素类化合物。将实施例1至实施例5制备得到的化合物进行质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱的检测，结果证明所得化合物为：3’,5’-二羟基-4’-葡萄糖基-苯基-3-羟基丙酸甲酯。其结构式如式(Ⅰ)所示：其质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱的谱图数据如下：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z399.1889，结合核磁特征，可得分子式为C15H20O11，不饱和度为6。1H-NMR(600MHz,CD3OD):6.60(d,1H),6.47(d,1H),4.95(s,1H),4.94(m,2H),3.00-4.00(glc-H),2.71(m,2H)。13C-NMR(150MHz,CD3OD):170.5(C-1),150.7(C-1'),150.2(C-4'),135.5(C-3',5'),114.7(C-2',6'),101.2(C-1”),61.5-77.8(C2”-C6”),61.1(C-2),38.69(C-3)。实施例6苯丙素类化合物盐的制备苯丙素类化合物盐酸盐的制备：搅拌下将该化合物甲醇溶液中滴加饱和盐酸至pH值2-3，搅拌下滴加乙腈，抽滤，干燥得到白色粉末固体，即为苯丙素类化合物的盐酸盐。苯丙素类化合物磺酸盐的制备：在含有该化合物、溶剂、磺酸、中性油和促进剂的反应体系中加入碱金属的氢氧化物，加入溶剂、低级醇和助促进剂，通入二氧化碳，分离得到白色粉末固体，即为苯丙素类化合物的磺酸盐。苯丙素类化合物钾盐或钠盐的制备：将溶于乙醇中的KOH或NaOH加入该苯丙素类化合物中，搅拌下加热回流反应，冷制室温，搅拌下滴加乙腈，抽滤，干燥得白色固体，即为该苯丙素类化合物的钾盐或钠盐。苯丙素类化合物铵盐的制备：搅拌下将该化合物甲醇溶液中滴加饱和氨水至pH值9-11，搅拌下滴加乙腈，抽滤，干燥得到白色固体，即为苯丙素类化合物的铵盐。上述苯丙素类化合物盐的谱图数据：苯丙素类化合物盐酸盐：ESIMS显示m/z412.67，核磁特征1H-NMR(600MHz,CD3OD):1H-NMR(600MHz,CD3OD):6.63(d,1H),6.49(d,1H),5.05(s,1H),4.98(m,2H),3.00-4.00(glc-H),2.74(m,2H)。苯丙素类化合物磺酸盐：ESIMS显示为m/z504.28，核磁特征1H-NMR(600MHz,CD3OD):1H-NMR(600MHz,CD3OD):6.55(d,1H),6.36(d,1H),4.90(s,1H),4.91(m,2H),3.00-4.00(glc-H),2.51(m,2H)。苯丙素类化合物钾盐或钠盐：钾盐ESIMS显示m/z452.19，核磁特征1H-NMR(600MHz,CD3OD):6.70(d,1H),6.57(d,1H),4.94(s,1H),4.91(m,2H),3.00-4.00(glc-H),2.70(m,2H)。钠盐ESIMS显示m/z420.19，核磁特征1H-NMR(600MHz,CD3OD):6.56(d,1H),6.46(d,1H),4.74(s,1H),4.51(m,2H),3.00-4.00(glc-H),2.60(m,2H)。苯丙素类化合物铵盐：ESIMS显示m/z406.57，核磁特征1H-NMR(600MHz,CD3OD):1H-NMR(600MHz,CD3OD):6.63(d,1H),6.33(d,1H),4.94(s,1H),4.91(m,2H),3.00-4.00(glc-H),2.77(m,2H)。上述苯丙素类化合物盐的结构式如式(Ⅳ)～式(Ⅷ)所示。其中，式(Ⅳ)为制备得到的苯丙素类化合物盐酸盐，式(Ⅴ)为制备得到的苯丙素类化合物的其中一种磺酸盐，式(Ⅵ)为制备得到的苯丙素类化合物的其中一种钾盐，式(Ⅶ)为制备得到的苯丙素类化合物的其中一种钠盐，式(Ⅷ)为制备得到的苯丙素类化合物的其中一种铵盐。实验例7应用试验本发明所述化合物以及盐对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞氧化应激与炎症的影响。(为了实验过程中记录方便，以下将本发明所述的苯丙素类化合物标号为：药物MM-125，即本发明中所述的药物MM-125即是指本发明式(Ⅰ)所示苯丙素类化合物或其药学上可接受的盐。)1材料与方法1.1药品及仪器脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，MTT购自Sigma公司；小鼠巨噬细胞Raw264.7购自湘雅细胞库；PBS；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素与链霉素；全自动酶标仪；恒温CO2培养箱。小鼠白介素1-β(IL-1-β)ELISA检测试剂盒，批号：2014/06(96T)；小鼠白介素6(IL-6)ELISA检测试剂盒，批号：2014/06(96T)；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒，批号：2014/06(96T)；小鼠一氧化氮(NO)ELISA检测试剂盒，批号：2014/10(96T)；小鼠羟基自由基(OH)ELISA检测试剂盒，批号：2014/10(96T)。1.2药物制备首先用少量DMSO溶解，然后用DMEM稀释至一定的浓度，使终浓度中DMSO含量少于1‰。1.3细胞培养小鼠巨噬细胞Raw264.7培养于含10％热灭活(56℃，30min)的胎牛血清(FBS)、10U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育生长。1.4细胞活力测定细胞活力通过MTT法来测定。将细胞制成细胞悬液接种于96孔板(1×104个/孔)孵育24h，再同步化24h，然后将不同浓度的药物作用于细胞2h，然后再加入LPS(30μg/mL)刺激24h，吸弃原培养基，每孔加入100μL的MTT(0.5mg/mL)继续孵育4h，吸弃培养基，每孔加入150μL的DMSO，摇床振摇10min，在490nm处测定吸光度。1.5NO含量测定Raw264.7细胞接种于96孔板24h，再同步化24h，然后将不同浓度的药物作用于细胞2h，然后再加入LPS(30μg/mL)刺激24h，最后收集上清液，并于10000rpm离心5min，分装上清并置于-80℃保存备用。通过小鼠NO试剂盒测定NO含量。1.6炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6测量样品取1.5制备好的样品用于后续炎症因子测定。细胞产生TNF-α,IL-1β,IL-6的量通过小鼠TNF-α,IL-1β,IL-6试剂盒来测定。1.7OH含量测定样品取1.5制备好的样品用于OH因子测定。通过OH试剂盒测定含量。1.8统计分析采用SPSS17.0软件，实验数据以(x±s表示；所得数据通过用单因素方差分析，方差齐性用LSD检验，方差不齐用DunnettT3检验。2实验结果2.1细胞活力药物对细胞活力的影响通过MTT法来评价。如图3所示，药物MM-125在1.37-12.37μg/mL浓度范围内对Raw264.7细胞活力没有显著影响；因此在此范围浓度下的药物浓度对于后续实验是合适的。2.2药物抑制NO的产生如图4所示，通过LPS刺激Raw264.7细胞，其产生NO(48.66±1.66IU/mL)含量与正常组NO(29.05±0.85IU/mL)相比明显升高(p＜0.01)。药物MM-125在浓度(6.88±12.38μg/mL)范围内对LPS引起的NO含量升高有明显的抑制作用，并表现出明显的剂量依赖关系。2.3药物抑制TNF-α,IL-1β,IL-6的产生如图5至图7所示，通过LPS刺激Raw264.7细胞，Raw264.7细胞炎症因子TNF-α(127.98±4.65pg/mL)，IL-1β(347.55±9.56pg/mL)，IL-6(201.67±10.32pg/mL)含量与正常组TNF-α(67.12±4.00pg/mL),IL-1β(160.88±13.10pg/mL),IL-6(111.13±8.06pg/mL)相比含量明显升高(p＜0.01)；说明LPS能够刺激Raw264.7细胞产生大量炎症因子。药物MM-125在浓度(6.88-12.38μg/mL)范围内能够显著抑制Raw264.7细胞产生炎症因子TNF-α(p＜0.05)，并呈显著的剂量依赖关系；在各浓度下，不能显著抑制Raw264.7细胞产生IL-1β，IL-6(p＞0.05)。2.4药物抑制OH的产生如图8所示，通过LPS刺激Raw264.7细胞，其产生OH(106.00±3.90ng/mL)含量与正常组OH(64.62±2.18ng/mL)相比明显升高(p＜0.01)。药物MM-125在浓度(4.13-12.38μg/mL)范围内对LPS引起的OH含量升高有明显的抑制作用，并表现出一定的剂量依赖关系。本实验经体外培养，研究了药物MM-125对小鼠巨噬细胞NO,TNF-α,IL-1β,IL-6,OH生成的影响。药物MM-125对因子NO的产生有明显抑制作用，并且对TNF-α也有一定的抑制作用，但其对IL-1β,IL-6无明显抑制作用，说明其有一定的抗炎活性；其对OH的产生有明显的抑制效果，说明其有较好的抗氧化活性。实施例8片剂的制备：按实施例1方法先制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及利用该化合物与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或碱金属的氢氧化物(如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂)或铵制成的盐，按该化合物或其任意一种盐与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。实施例9散剂的制备：按实施例1方法先制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及利用该化合物与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或碱金属的氢氧化物(如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂)或铵制成的盐，按常规散剂制法制成散剂。实施例10胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及利用该化合物与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或碱金属的氢氧化物(如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂)或铵制成的盐，按该化合物或其任意一种盐与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制成胶囊剂或颗粒剂。实施例11注射剂的制备：按实施例1方法先制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及利用该化合物与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或碱金属的氢氧化物(如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂)或铵制成的盐，按常规注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射剂。实施例12一种药物组合物，含有实施例1方法制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及利用该化合物与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或碱金属的氢氧化物(如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂)或铵制成的盐，以及金樱根、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参制成的粉末，和辅料。实施例13一种药物组合物，含有实施例1方法制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及金樱根、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参制成的粉末，和辅料。实施例14一种药物组合物，含有实施例1方法制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及金樱根、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参的提取物，和辅料。提取物是按专利公告号CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、CN1296072C、CN1296073C的任意一件或几件专利文件中提取方法制备得到。实施例15一种药物组合物，含有实施例1方法制得式(Ⅰ)所示的苯丙素类化合物，以及利用该化合物与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或碱金属的氢氧化物(如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂)或铵制成的盐，以及金樱根、单面针、鸡血藤、功劳木、穿心莲、当归、党参的提取物，和辅料。提取物是按专利公告号CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、CN1296072C、CN1296073C的任意一件或几件专利文件中提取方法制备得到。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优势。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。