一种抑制植物病毒传播的制剂及其应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种抑制植物病毒传播的制剂及其应用。

背景技术：

桃蚜(Myzus persicae)是一种几乎遍布全球的多食性害虫，其不仅可以为害十字花科蔬菜、蔷薇果树、茄科作物等，还可为害烟草、菠菜及某些中草药等植物。另外，桃蚜作为媒介昆虫，可以传播115种植物病毒。媒介昆虫带毒是植物病毒病的主要传播途径。一旦媒介昆虫获得病毒，利用其迁移和迁飞的特性，会将其携带的病毒进行广泛传播，最终导致植物病毒病的大面积发生，给丰产丰收带来了严峻的挑战。因此，防治媒介昆虫或降低媒介昆虫的获毒量成为了防治植物病毒病的关键。目前，生产中防治媒介昆虫主要依赖于化学药剂，这使得部分药剂在一些地区的昆虫防治过程中已经出现极高水平的抗药性，故通过降低媒介昆虫获毒量来有效减少植物病毒病的发生已经迫在眉睫，而了解并掌握媒介昆虫的传毒机制则是前提。

桃蚜表皮蛋白是一类蛋白质的总称。Dombrovsky等人先后分离出了表皮蛋白MpCuP(编码的基因Mpcp1)、MpCuP1(编码的基因Mpcp4)、MpCuP2(编码的基因Mpcp2、Mpcp5)、MpCuP3(编码的基因Mpcp3)。对于以上分离出的表皮蛋白已有研究证实：基因Mpcp2、Mpcp5编码的蛋白MpCuP2与南瓜黄化花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)的Hc-pro是互作的(Dombrovsky A,Gollop N,Chen S,2007)。而目前尚未有关于桃蚜表皮蛋白参与植物病毒传播的相关报道。因此，有必要对参与桃蚜获毒过程的蛋白因子进行深入研究，了解媒介昆虫的传毒机制，从而为植物病毒病的防控提供理论基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够通过影响虫体获毒过程进而抑制植物病毒传播的制剂。

为达到以上目的，发明人对桃蚜参与植物病毒传播的机制进行了深入的研究，意外的发现桃蚜表皮蛋白MpCuP1(编码基因Mpcp4)能够影响虫体对植物病毒的获取能力，参与了植物病毒经由桃蚜刺吸式吸口器传播的过程。基于以上研究成果，本发明提供了一种抑制植物病毒传播的制剂，所述制剂的活性成分包括使编码桃蚜表皮蛋白的基因MPCP4沉默的试剂。

其中，所述编码桃蚜表皮蛋白的基因MPCP4的序列如SEQ ID No.1所示。

所述病毒为经昆虫刺吸式吸口器传播的植物病毒，优选为黄瓜花叶病毒。

优选的，所述使编码桃蚜表皮蛋白的基因MPCP4沉默的试剂为编码桃蚜表皮蛋白的基因MPCP4的dsRNA干扰片段。所述dsRNA干扰片段优选是由如SEQ ID No.2所示的核苷酸片段所编码的。

本发明中，所述dsRNA干扰片段可以通过以下方式制备获得：以基因MPCP4的cDNA模板设计引物进行PCR扩增，获得PCR产物并纯化，以PCR产物为模板利用RNAi试剂盒进行dsRNA的制备，例如可以利用RNAi试剂盒(Ambion，USA)进行dsRNA的制备。

本发明所述的制剂可以为口服剂或注射剂，所述制剂还可以包括助剂和/或载体。

当所述制剂为口服剂时，可以包括口服剂可接受的助剂和/或载体，使得所述制剂可以通过饲喂的方式使用。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂是将dsRNA干扰片段与适合被蚜虫取食的饲料混合制成的。

可选的，在所述制剂中，dsRNA干扰片段的浓度为50-200ng/μl，优选为100ng/μl时，可以保证蚜虫在被施用所述试剂后能够产生65％以上的基因沉默效果。

可选的，所述病毒为经昆虫刺吸式吸口器传播的植物病毒。当所述病毒为黄瓜花叶病毒时，能够取得优异的抑制病毒传播的效果。

可以理解的是，本发明所述的制剂还包括能够用于使基因MPCP4沉默的表达单元、重组载体或表达系统。其中，所述表达单元为可以用于表达桃蚜表皮蛋白MpCuP1的编码DNA序列、RNA序列等。其中，所述重组载体为携带有基因MPCP4的核苷酸序列的用于保存、携带或者在目的生物中表达所述基因MPCP4的核苷酸序列。其中，所述表达系统可以为用于表达所述桃蚜表皮蛋白MpCuP1的宿主细胞，所述宿主细胞优选为微生物细胞或桃蚜细胞。

本发明的另一个方面还提供了使编码桃蚜表皮蛋白的基因MPCP4沉默的制剂在抑制植物病毒传播中的应用，包括将上述制剂通过饲喂和/或注射的方式施用于桃蚜，从而使基因MPCP4沉默。

优选的，所述应用包括给桃蚜饲喂和/或注射编码桃蚜表皮蛋白的基因MPCP4的dsRNA干扰片段，本发明对于每头桃蚜每次dsRNA干扰片段的施用量没有特别的限制，本领域技术人员可以理解，在能够引起基因沉默效果的最小用量以及桃蚜可接受的最大用量之间均可实现本发明的有益效果。一般的，桃蚜摄取食物的量为0.06-0.08mg/h，每次饲喂1小时。

本发明中，当施用所述试剂后，在24-72h内可以取得较好的基因沉默效率。优选的，使编码桃蚜表皮蛋白的基因MPCP4的沉默效率可以达到65％。

当所述制剂为口服剂时，可以包括口服剂可接受的助剂和/或载体，使得所述制剂可以通过饲喂的方式使用，例如可以将所述制剂添加于可以被蚜虫取食的饲料获得混合饲料，在所述混合饲料中，所述dsRNA干扰片段的浓度为50-200ng/μl。

可选的，所述病毒为经昆虫刺吸式吸口器传播的植物病毒。当所述病毒为黄瓜花叶病毒时，能够取得优异的抑制病毒传播的效果。

本发明所提供的制剂，可抑制桃蚜在带毒植物上利用刺吸式吸口器获得植物病毒的能力，可以减少蚜虫在取食后对植物病毒的摄入量，减少桃蚜对植物病毒的携带。从而通过减少媒介昆虫获毒来防治植物病毒病，为防治病毒病提供了有效手段。

附图说明

图1为本发明重组质粒的双酶切鉴定电泳图。

其中，M：DNA marker Trans 2K PlusⅡ；1：pGBKT7；2：pGBKT7-CMV-SXCH-CP；3：pGADT7；4：pGADT7-MPCP1；5：pGADT7-MPCP2；6：pGADT7-MPCP4；7：pGADT7-MPCP5。

图2为桃蚜表皮蛋白MpCuPs与CMV Cp在酵母细胞中的互作；Positive control表示阳性对照，Negative control表示阴性对照，CMV CP&MPCP1表示CMV CP与MPCP1的相互作用结果；CMV CP&MPCP2表示CMV CP与MPCP2的相互作用结果；CMV CP&MPCP4表示CMV CP与MPCP4的相互作用结果；CMV CP&MPCP5表示CMV CP与MPCP5的相互作用结果。

图3为本发明dsRNA合成质量的电泳图。

其中，M：DNA marker Trans2K PlusⅡ，1：dsmpcp4，2：GFP。

图4为本发明沉默基因MPCP4后，各浓度与时间条件下，桃蚜体内基因MPCP4的相对表达量；

图5为本发明沉默基因MPCP4后桃蚜体内CMV CP的相对表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1桃蚜表皮蛋白MpCuP与CMV CP的相互作用

1.酵母双杂交载体的构建

用TRIzol法提取桃蚜以及CMV-SXCH发病烟草叶片的总RNA，用Oligo dT进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板经PCR扩增分别得到CMV-SXCH-CP、MPCP1、MPCP2、MPCP4、MPCP5基因开放阅读框(open reading frame，ORF)的片段，然后克隆到pMD18T，得到pMD18T-CMV-SXCH-CP、pMD18T-MPCP1、pMD18T-MPCP2、pMD18T-MPCP4、pMD18T-MPCP5并测序。以pMD18T-CMV-SXCH、pMD18T-MPCP1、pMD18T-MPCP2、pMD18T-MPCP4、pMD18T-MPCP5模板，分别用引物(表1)经PCR扩增得到CMV-SXCH-CP、MPCP1、MPCP2、MPCP4、MPCP5基因ORF的片段，然后分别克隆到pGBKT7、pGADT7载体，得到pGBKT7-CMV-SXCH-CP、pGADT7-MPCP1、pGADT7-MPCP2、pGADT7-MPCP4、pGADT7-MPCP5，对其进行双酶切验证，酶切产物的电泳图显示从重组质粒上切下了目标条带(图1)，经测序证明读框正确。

表1用于载体构建的引物列表

2.桃蚜表皮蛋白MpCuPs与CMV CP相互作用

为研究CMV CP与MpCuPs(MPCP1、MPCP2、MPCP4、MPCP5)的互作关系，分别将pGBKT7-CMV-SXCH-CP与pGADT7-MPCP1、pGBKT7-CMV-SXCH-CP与pGADT7-MPCP2、pGBKT7-CMV-SXCH-CP与pGADT7-MPCP4、pGBKT7-CMV-SXCH-CP与pGADT7-MPCP5共转化到酵母菌株Y2H Gold，同时设共转化pGBKT7与pGADT7-MPCP1的组合为阴性对照，共转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT的组合为阳性对照。结果表明：只有阳性对照和共转入pGBKT7-CMV-SXCH-CP与pGADT7-MPCP4组合的转化子能在SD/-Leu，-Trp，-Ade，-His平板上长出菌落(图2)。此实验重复进行了3次，得到了一致的结果，说明CMV CP只与基因MPCP4编码的蛋白MpCuPs1互作，不与其他桃蚜表皮蛋白互作。

实施例2基因MPCP4沉默可减少桃蚜对病毒的摄取。

1.dsRNA的制备：首先，利用基因MPCP4的cDNA模板及设计好的引物(表2)进行PCR扩增，然后进行PCR产物的纯化，以此为模板利用RNAi试剂盒(Ambion，USA)进行dsRNA的制备。制备后用Nanodrop 2000检测dsRNA浓度，并取稀释400倍后的dsRNA于1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的质量(图3)。

表2 dsRNA的DNA模板扩增引物

2.dsRNA作用时间和浓度的优化

分别设置了24h、48h、72h三个时间梯度以及50ng/μl、100ng/μl、200ng/μl三个浓度梯度(dsRNA与饲料混合后，获得的混合物料中dsRNA的浓度)，采用饲喂法进行条件的优化。首先，挑选大小一致、健康的桃蚜约30头，饥饿处理3h；然后将不同浓度的dsRNA与人工饲料(具体成分：向蔗糖溶液中加入100mmol/L丝氨酸，100mmol/L蛋氨酸，100mmol/L天冬氨酸配成浓度为20％的蔗糖溶液作为饲养液)混合并用于饲喂桃蚜；饲喂时间持续1h。之后将不同浓度和时间条件下的活虫收集；最后，对收集的样品进行q-PCR检测。图4可以看出，在48h、100ng/μl条件下，基因沉默效率最高，可以达到约65％。故将此条件用于后续实验。

3.沉默后桃蚜体内病毒的积累情况

首先，挑选大小一致、健康的桃蚜，饥饿处理3h；然后将dsRNA与人工饲料(具体成分：向蔗糖溶液中加入100mmol/L丝氨酸，100mmol/L蛋氨酸，100mmol/L天冬氨酸配成浓度为20％的蔗糖溶液作为饲养液)混合并用于饲喂桃蚜；其中，dsRNA的终浓度为100ng/μl，饲喂时间持续1h。

将基因MPCP4沉默后的桃蚜置于带毒和健康的烟草植株上，分别在放置6h、12h、24h、48h、72h(每个时间点20头)收集带毒和健康烟草上的桃蚜，对收集的样品进行q-PCR检测。在基因MPCP4沉默后，桃蚜获取的CMV开始减少，24h达到最低，约减少了33％(图5)。

如上所述，本发明提供了一种桃蚜表皮蛋白MpCuPs1应用的新途径。因此，本发明对进一步确定桃蚜传毒机制的研究具有重要意义，并为通过减少媒介昆虫获毒来防治植物病毒病提供了理论基础，同时为研究新的防治病毒病的产品奠定了基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。