一种基于耐热DNA聚合酶和连接酶的体外快速无缝组装DNA的方法与流程

文档序号:13213153阅读:来源:国知局
技术特征:
1.一种体外快速组装DNA的方法,其特征在于,是基于耐热DNA聚合酶和连接酶,首先对需要组装的DNA片段进行PCR以获得具有重叠末端的亚片段,所得亚片段经包括变性、退火、切割、连接的热循环反应进行重组;所述切割由具有5'-3'和3'-5'外切酶活性的耐热DNA聚合酶催化;所述连接由具有单链无间隙缺口连接功能的耐热DNA连接酶催化。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述对需要组装的DNA片段进行PCR,是根据设定的DNA片段的组装顺序,针对每个需要重组的DNA片段分别设计正反向两条引物,用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有20-70bp的序列完全匹配,使扩增得到的各亚片段之间具备用于体外组装的同源臂。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有30bp的序列完全匹配。4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物中还引入了需要突变的序列或简并序列。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述热循环反应中变性温度为98-85℃,退火温度为35-70℃;切割温度为45-72℃,切割时间5-35min;连接温度40-68℃,连接时间1-10min;热循环数为1-15个循环。6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,引物或者亚片段的5'末端的羟基进行磷酸化反应。7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的DNA聚合酶为具有5'-3'外切酶活性的TaqDNA聚合酶和具有3'-5'外切酶活性的PfuDNA聚合酶。8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述连接酶为TaqDNA连接酶。9.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于,所述热循环反应中变性温度为94℃,退火温度为50℃;切割温度为68℃,切割时间30min;连接温度50℃,连接反应时间5min;热循环数为3。10.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于,取制备好的亚片段各50ng,同时加入1.5μl10xTaqDNAligasebuffer,0.2μlPfuDNApolymerase,0.2μlTaqDNApolymerase,1μlTaqDNAligase,补足水至15μl体系;按如下程序反应:94℃2min,【94℃30s,50℃1min,68℃30min,50℃5min】x3,66℃10min。
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