技术领域本发明涉及一种基于耐热DNA聚合酶和连接酶的体外快速无缝组装DNA的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
上个世纪分子生物学领域显著的成就是限制性内切酶和DNA连接酶的发现，奠定了体外DNA重组构建的基础技术。DNA重组技术极大的促进了人们在基因的结构、功能领域的认识，为酶工程、代谢工程和合成生物学的快速发展奠定了基础。然而，在实际的操作过程中，由于受制于限制性酶切位点，DNA片段的重组构建，特别是多个片段的组装构建，传统的常规酶切连接技术就显得捉襟见肘。酶切位点的数量限制，特别是繁琐缓慢的分步克隆重组操作根本难以满足现代代谢工程和合成生物学中复杂的代谢途径和调控元件的快速组装构建。因此，构建一种不依赖序列的DNA快速重组技术显得尤为迫切。随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，能够产生粘性末端的单链核酸外切酶被发现，由此建立起来的不依赖序列和连接的克隆重组技术(SLIC)应运而生并且在代谢工程和合成生物领域快速发展和应用。例如，最经典的方法，是基于T5核酸外切酶和T4DNA聚合酶的LIC系统，该系统作为一种高效的方法被应用于大规模的基因克隆及载体构建。该方法在设计PCR扩增引物时需添加特定长度(≥15nt)的与邻近重组的DNA片段(载体)末端同源的序列作为重组区段，这段区域可以不受序列的限制。PCR扩增制备好需要组装构建的片段后，利用T4DNA聚合酶或者T5核酸外切酶的3'-5'和5'-3'外切酶活性，水解单链使载体和克隆片段末端产生5'或者3'末端突出的单链粘性末端。该反应产物在退火条件下而不需要连接酶的作用即可通过突出的粘性末端发生较为稳定的配对复性，并借助于宿主大肠杆菌内的DNA修复系统重新环化成新的质粒。随后在此基础上改进的技术，例如一步等温组装反应等，通过在反应中加入DNA聚合酶(聚合活性补齐缺口)和DNA连接酶(缺口补平)，由T5核酸外切酶产生的单链DNA突出端，相互结合并由DNA聚合酶延伸补齐缺口，最后由连接酶把缺口修复补平形成完整的DNA双链，这使得不依赖序列的克隆技术效率进一步显著提高。然而，上述方法中，核酸外切酶产生的单链长度不可精确地控制，导致短片段不适宜组装，并且4个片段以上的组装效率急剧下降；并且涉及三种酶。与此同时，大量的利用其它序列特异性的核酸内切酶接到的组装方法也发展迅速，例如GoldenGate组装和单链缺口切割酶组装，尽管这种组装技术可以快速实现一步组装6-10个基因片段，然而依然受到限制性酶切位点的限制，特别是组装构建的片段重组区域会留下一段6-10bp疤痕序列，这极大限制了它在应用。再者，酵母介导的体内同源重组技术也相应发展起来，该方法在设计PCR引物扩增目标片段时，需添加一定长度(≥40nt)的与邻近重组的DNA片段(载体)末端同源的序列作为同源重组区段，这段区域可以不受序列的限制。所有带有同源末端序列的片段和酵母载体一同电转酿酒酵母，可以在酵母体内一次实现多达25个基因片段的组装，并且无序列依赖性和无痕重组。这一技术对合成生物学和代谢工程的发展相当有吸引力。但是，由于需要的同源区域较长，极大的增加了引物的合成费用，特别是对于非酿酒酵母途径的构建，比较复杂和耗时(长达10-15天)。因此，迫切需要开发一种体外不依赖序列，可以高通量操作和无痕的组装技术以满足现代快速发展的合成生物学。
技术实现要素：
本发明提供了一种基于耐热DNA聚合酶和连接酶体外快速组装DNA的方法，可快速组装2-10个基因片段，并且可以用于基因的组合组装突变应用。本发明首先对需要组装的DNA片段进行PCR以获得具有重叠末端的亚片段，所得亚片段经包括变性、退火、切割、连接的热循环反应进行重组。所述对需要组装的DNA片段进行PCR，是根据设定的DNA片段的组装顺序，针对每个需要重组的DNA片段(靶基因)分别设计正反向两条引物，用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有20-70bp的序列完全匹配，使扩增得到的各亚片段之间具备体外组装的同源臂。所述热循环反应在能兼顾各酶活性的缓冲液中进行。所述热循环反应中变性温度为98-85℃，退火温度为35-70℃；切割温度为45-72℃，切割时间5-35min；连接温度40-68℃，连接时间1-10min；热循环数为1-15个循环。所述的切割由具有5'-3'和3'-5'外切酶活性的耐热DNA聚合酶催化。所述的连接由具有单链无间隙缺口连接功能的耐热DNA连接酶催化。在本发明的一种实施方式中，所述用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有30bp的序列完全匹配。在本发明的一种实施方式中，所述用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物中还引入了需要突变的序列或简并突变序列。可用于组合突变DNA。在本发明的一种实施方式中，引物或者亚片段的5'末端的羟基进行磷酸化反应。所述磷酸化反应可由T4多聚核苷酸激酶进行催化。在本发明的一种实施方式中，所述的DNA聚合酶为具有5'-3'外切酶活性的TaqDNA聚合酶和具有3'-5'外切酶活性的PfuDNA聚合酶。在本发明的一种实施方式中，所述的DNA连接酶为TaqDNA连接酶。在本发明的一种实施方式中，所述热循环反应在TaqDNA连接酶的缓冲液中进行。在本发明的一种实施方式中，所述热循环反应中变性温度为94℃，退火温度为50℃；切割温度为68℃，切割时间30min；连接温度50℃，连接反应时间5min；热循环数为3。在本发明的一种实施方式中，取制备好的亚片段各50ng，同时加入1.5μl10xTaqDNAligasebuffer，0.2μlPfuDNApolymerase，0.2μlTaqDNApolymerase，1μlTaqDNAligase，补足水至15μl体系；按如下程序反应：94℃2min，【94℃30s，50℃1min，68℃30min，50℃5min】x3,66℃10min。本发明方法可用于DNA重组构建、合成途径的组装、蛋白组装进化和代谢途径组合改造等，所得产物可以保存在-20℃或者直接进行转化感受态细胞。所述的亚片段可以是结构基因、载体。本技术采用耐热缺口连接酶和DNA聚合酶介导的体外重组DNA片段技术。根据设定的组装顺序，向合成引物中引入相应的同源序列，借助变性退火温度循环，DNA聚合酶的外切酶活性和连接酶活性实现DNA的无痕组装。参见图1，用于组装的片段两端分别含有20-30bp的同源序列与邻近组装的片段一致，采用PCR热循环反应体系，DNA经94℃变性后退火至50-60℃，同源臂互补匹配结合，随后形成如图中所示的“flap”结构，“flap”可以为5'或者3'末端序列，此部分多出的“flap”序列借助TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶的5'-3'和3'-5'外切酶活性在68℃下反应进行切除，形成具有缺口的契合链，再借助耐热TaqDNA连接酶在50℃进行缺口补平连接，从而形成完整的重组片段。此技术由于采用的均为耐热酶，可以进行多次热循环反应(变性-退火-切割-连接)以增加重组体。此外，本发明技术也可用于DNA突变文库的构建，比如蛋白突变文库和代谢途径的突变文库，即在用于扩增各亚片段的引物中引入简并或者特定的碱基序列，通过PCR技术获得含有多样性极其丰富的亚片段突变文库，再采用本发明体外重组技术将亚片段快速无痕地一步组装，获得多样性极其丰富的完整基因或者合成途径的突变文库。本发明克服了上述组装技术序列限制，效率低，耗时长和成本高等因素，在2h内一次可以实现2-6个片段的高效快速的无缝组装。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效进化改造上，引入丰富的组合突变多样性，进行快速定向进化和合成生物学操作。附图说明图1所示为DATEL体外组装技术的原理示意图。图2所示为PCR验证两个片段(gfp和pUC19)组装的正确率，箭头所示为正确组装的gfp目标条带。图3所示为DATEL组装技术中同源臂长度和切割反应时间对组装效率的影响。图4所示为DATEL组装技术快速组装多个DNA片段示意图(a)和效率(b)。图5所示为DATEL组装技术快速构建β-胡萝卜素合成途径的组合文库示意图。图6所示为随机挑选组合文库中的重组菌株进行PCR验证β-胡萝卜素合成基因的组装核酸电泳图，正确片段为箭头所示的5.8kb条带。图7所示为重组菌株β-胡萝卜素的质谱鉴定图：(a)β-胡萝卜素标准对照品质谱图；(b)重组菌株产物β-胡萝卜素的质谱图。图8所示为9株来源于组合途径文库的重组菌株产β-胡萝卜素的能力。序列表中为核苷酸序列信息说明(1)SEQIDNO.1为绿色荧光蛋白编码基因gfp的核苷酸序列；(2)SEQIDNO.2为rpoS基因的组成型启动子PrpoS的核苷酸序列；(3)SEQIDNO.3为酯酶编码基因estC23的核苷酸序列；(4)SEQIDNO.4为卡那霉素编码基因kan的核苷酸序列；(5)SEQIDNO.5为Pantoeaagglomerans来源的β-胡萝卜素合成途径基因crtE编码序列；(6)SEQIDNO.6为Pantoeaagglomerans来源的β-胡萝卜素合成途径基因crtX编码序列；(7)SEQIDNO.7为Pantoeaagglomerans来源的β-胡萝卜素合成途径基因crtY编码序列；(8)SEQIDNO.8为Pantoeaagglomerans来源的β-胡萝卜素合成途径基因crtI编码序列；(9)SEQIDNO.9为Pantoeaagglomerans来源的β-胡萝卜素合成途径基因crtB编码序列。具体实施方式实施例1对DATEL组装技术的反应系统优化以绿色荧光蛋白基因gfp和pUC19载体为例，进行组装反应优化。首先对组装反应的“同源臂”长度和切割反应时间进行优化，根据gfp片段和载体序列分别设计6组带有20bp、30bp、40bp、50bp、60bp和70bp同源臂的gfp扩增引物，和一对载体pUC19扩增引物。引物如下所示：TEL/puc19-F：TTCTTCTCCCTTACCCATGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTTEL/puc19-R：TGGATGAACTATACAAATAACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTEL/gfp-P20F：CCATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTEL/gfp-P20R：TTATTTGTATAGTTCATCCATGCCTEL/gfp-P30F：CATGATTACGCCATGGGTAAGGGAGAAGAATEL/gfp-P30R：CGACGGCCAGTTATTTGTATAGTTCATCCATEL/gfp-P40F：CAGCTATGACCATGATTACGCCATGGGTAAGGGAGAAGAATEL/gfp-P40R：CGTTGTAAAACGACGGCCAGTTATTTGTATAGTTCATCCATEL/gfp-P50F:ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCATGGGTAAGGGAGAAGAATEL/gfp-P50R:CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTTATTTGTATAGTTCATCCATEL/gfp-P60F:TAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCATGGGTAAGGGAGAAGAATEL/gfp-P60R:CAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTTATTTGTATAGTTCATCCATEL/gfp-P70F:TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCATGGGTAAGGGAGAAGAATEL/gfp-P70R:TGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTTATTTGTATAGTTCATCCA引物或者DNA片段磷酸化步骤如下：在50μl反应体系中含有100pmol引物(或者1μgDNA片段),1×T4DNAligasebuffer(NEB,NewEnglandBiolabs,USA),and8Upolynucleotidekinase(NEB).反应体系在37℃孵育30min，再放置75℃10min失活磷酸化酶。所有引物首先均按上述磷酸化步骤进行磷酸化反应。以引物TEL/puc19-F和TEL/puc19-RPCR扩增制备组装反应用的载体片段pUC19；采用上述6对引物和PCR技术分别扩增6组gfp基因片段，每个片段的两末端分别带有与载体末端对应长度(20-70bp)的同源臂序列，PCR反应体系如下：2×预混superpfumix(杭州宝赛生物)25μl，上下游引物各1μl(10μM)，模板核酸1μl(10ng)，加水补足50μl。反应程序为：94℃4min预变性；【94℃30s变性，58℃30s，72℃】×32；72℃5min。PCR结束后，反应液各添加1μlDpnI限制性内切酶，混匀后在37℃孵育30min消化模板DNA。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂盒按说明书推荐方法回收PCR产物。上述制备的载体和PCR片段采用NaNoDrop2000测定核酸浓度。DATEL组装反应操作，按如下体系配置组装反应液15μl体系：1.5μl10×TaqDNAligasebuffer(NEB)，50nggfp片段，50ngpUC19载体，0.2μlsuperpfuDNApolymerase，0.2μlTaqDNApolymerase，1μlTaqDNAligase，补足水至15μl体系。按如下热循环程序反应：94℃2min，【94℃30s，45℃1min，68℃5-35min，50℃5min】×3，60℃10min。热循环反应结束后。产物可以保存早-20℃，或者直接转化感受态细胞，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养后，对长出的克隆进行菌落PCR验证和测序。在本实施例中，对同源臂长度和组装反应中的切割时间(在68℃下，分别进行切割5min、10min、15min、20min、25min、30min和35min的切割时间)进行组合交叉分析对组装效率的影响。分别对每种组合因素(同源臂长和切割时间)转化长出的克隆进行计数和PCR验证，随机挑取部分转化重组子送样测序。结果如图2所示，每个组装反应的转化子中随机选取的132个菌落PCR结果显示，所有的转化子均成功的组装，进一步测序结果也证实了DATEL组装技术实现了两个片段的100％正确率的重组。进一步对长出的克隆数量进行统计分析，结果如图3所示，在20至70bp的同源臂中，具有30bp同源臂的组装效率最高，达到每微克DNA产生29150个菌落形成单位(CFU)。随着反应时间的延长，组装效率提高非常明显。带有30bp同源臂的组装切割时间从5min延长到30min，组装效率提高了2.29倍，但不再有明显的提高，即使再延长时间，这说明在30min内，DNA聚合酶基本彻底能够完成对30bp长度的“flap”单链的切割。实施例2应用DATEL快速组装多个片段为了验证DATEL组装多个片段的效率和正确率，以大肠杆菌rpoS基因的组成型启动子PrpoS、酯酶基因estC23、绿色荧光蛋白基因gfp、卡那霉素基因kan和pbluesscriptIISK(+)载体为例，进行3-5个片段的组装(图4a)。所有引物首先均进行磷酸化反应。引物信息如下：MFA/pSK-R:GGTAATGGCAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACMFA/pSK-4F:CTCGATGAGTTCTTCTAACCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACMFA/pSK-3F:GTTCATCCGCGCCAACGCCGAGTAACCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACMFA/pSK-2F:ATTACACATGGCATGGACGAACTATACAAATAACCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACMFA/Prpos-F:AGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCCATTACCCAGGCCGACGCAGCMFA/Prpos-R:CTTCTCCCTTACCCATAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCMFA/gfp-F:GTAGGAGCCACCTTATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACMFA/gfp-R:TTATTTGTATAGTTCGTCCATGCCATGMFA/est-F:ATTACACATGGCATGGACGAACTATACAAATAAATGTCACAACAACAGCTTGAATCAMFA/est-R:TTACTCGGCGTTGGCGCGGATGAACMFA/kan-F:GTTCATCCGCGCCAACGCCGAGTAAATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCMFA/kan-R:CAATTTCACACAGGTTAGAAGAACTCATCGAGCATC用于组装3、4和5个片段的pbluesscriptIISK(+)载体分别用磷酸化的引物对MFA/pSK-R和MFA/pSK-2F、MFA/pSK-R和MFA/pSK-3F、MFA/pSK-R和MFA/pSK-4F进行PCR扩增。启动子PrpoS、酯酶基因estC23、绿色荧光蛋白基因gfp、卡那霉素基因kan片段分别采用上述磷酸化的引物对进行扩展。按上述PCR反应体系和程序操作，结束后反应液各添加1μlDpnI限制性内切酶，混匀后在37℃孵育30min消化模板DNA。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂盒按说明书推荐方法回收PCR产物。上述制备的载体和PCR片段采用NaNoDrop2000测定核酸浓度。DATEL组装反应操作，按如下体系配置组装反应液15μl体系：1.5μl10×TaqDNAligasebuffer(NEB)，DNA插入片段和相应的载体各50ng(3个片段组装：PrpoS、estC23和pSK载体；4个片段组装：PrpoS、estC23、estC23和pSK载体；5个片段组装：PrpoS、estC23、estC23、gfp和pSK载体；)，0.2μlsuperpfuDNApolymerase，0.2μlTaqDNApolymerase，1μlTaqDNAligase，补足水至15μl体系。按如下PCR程序反应：94℃2min，【94℃30s，50℃1min，68℃30min，50℃5min】×3，60℃10min。热循环反应结束后。产物直接转化感受态细胞，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板(5个片段的组装转化子涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB平板)，37℃过夜培养后，对长出的克隆进行统计分析，结果如图4b所示，3-5个片段的组装效率分别达到每微克DNA产生4100,1600and550个菌落形成单位数。经过随机挑去部分转化子进行PCR验证和DNA测序分析，结果显示，3-5个片段的组装正确率分别达到100％,92％and85％(图4b)。本部分实施例说明，本发明技术可以快速高效的无痕组装多个DNA片段。实施例3应用DATEL快速构建β-胡萝卜素合成途径的组合文库为了验证DATEL多个片段的组装能力，采用成团泛菌来源的β-胡萝卜素合成基因簇的crtEXYIB进行组装应用。将该基因簇分为五个DNA片段crtE、crtX、crtY、crtI和crtB(如图5所示)，并按此顺序设计组装进载体pUC19中。特别指出的，作为DATEL无痕组装技术一个显著的功能应用(组合组装改造蛋白和代谢途径的突变)，对每一个上游正向引物中的RBS序列进行简并设计，采用此引物PCR扩增的每个基因片段上游都带有一个多样性(蛋白翻译强度)极其丰富的RBS文库。本实施例的引物信息如下：CPA/puc19-F：TGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCCPA/puc19-R：CCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGCPA/crtE-F:CTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGRRRRRDDDDATGATGACGGTCTGTGCAGAACAACACGCPA/crtE-R:TTAACTGACGGCAGCGAGTTTTTTCTCCPA/crtX-F:TTTGAGAAAAAACTCGCTGCCGTCAGTTAARRRRRDDDDATGAGCCACTTTGCGGTCATTGCACCGCCPA/crtX-R:TTAGACTGCTGCGTAGTCTCTCCTGGTGAGGACCGGCTGCPA/crtY-F:CTCACCAGGAGAGACTACGCAGCAGTCTAARRRRRDDDDATGCCGCGGTATGATCTGATTCTGGCPA/crtY-R:TCATTGCATCGCCTGTTGACGGTGAGCPA/crtI-F:CTCCTCACCGTCAACAGGCGATGCAATGADDRRRRRDDDDATGAATAGAACTACAGTAATTGGCGCPA/crtI-R:TCAAGCCAGATCCTCCAGCATCAATCCPA/crtB-F:CAGGATTGATGCTGGAGGATCTGGCTTGADDRRRRRDDDDATGGAGGTGGGATCGAAAAGCTTTGCPA/crtB-R:GCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATTAAACGGGGCGCTGCCAGAGATCAG载体pUC19采用引物CPA/puc19-F和CPA/puc19-R进行PCR扩增。五个DNA片段crtE、crtX、crtY、crtI和crtB分别采用相应的引物对进行扩增制备。按上述PCR反应体系和程序操作，结束后反应液各添加1μlDpnI限制性内切酶，混匀后在37℃孵育30min消化模板DNA。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂盒按说明书推荐方法回收PCR产物。上述制备的载体和PCR片段采用NaNoDrop2000测定核酸浓度。DATEL组装反应操作，按如下体系配置组装反应液15μl体系：1.5μl10×TaqDNAligasebuffer(NEB)，五个DNA片段crtE、crtX、crtY、crtI和crtB各50ng，50ngpUC19载体，0.2μlsuperpfuDNApolymerase，0.2μlTaqDNApolymerase，1μlTaqDNAligase，补足水至15μl体系。按如下PCR程序反应：94℃2min，【94℃30s，50℃1min，68℃30min，50℃5min】×3，60℃10min。热循环反应结束后。产物直接转化感受态细胞，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养后，对长出的克隆进行统计分析，对6个片段的组装(8.4kb)效率达到每微克DNA产生800个菌落形成单位(CFU)。进行菌落PCR验证和测序。如图6所示，PCR验证结果显示，大约有15％左右的克隆显示组装插入的片段条带偏小(不正确的组装)，而85％的克隆显示正确大小的目标条带。进一步测序分析显示，所有PCR验证的正确条带的克隆均成功实现了正确无误的组装。而15％错误组装的克隆为其中几个片段的丢失而导致错误的构建。为了表征本组装技术对代谢途径文库的快速组合优化效果，挑取颜色差异明显的一部分克隆进行摇瓶培养验证β-胡萝卜素的产量。克隆分别接种于5ml的LB培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)，37℃200rpm过夜培养16h。第二天转接于50ml的LB培养基(含有50g/L的葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)，37℃200rpm培养30h。收集适量的菌体，在10000rpm离心5min，去除干净发酵液上清，菌体采用等体积的丙酮重悬，并在黑暗条件和55℃条件下孵育15min。下一步进14000rpm离心10min，收集含有β-胡萝卜素的丙酮上清液。采用高效液相/离子阱-质量飞行时间器(LCMS-IT-TOF，岛津)对β-胡萝卜素进行定性和定量分析。C18柱(250mm×4.6mm,5mm,Waters)，流动相为methanol,acetonitrile和dichloromethane(21:21:8)的混合溶液，流速为1ml/min。β-胡萝卜素的标样购自sigma公司。重组菌株的产物定性测定结果如图7所示，在27.5min左右的位置，标样和重组菌株均出现了一个536.43的提取离子流峰(阴离子)，且质荷比(m/z)一致，说明重组菌株产物为β-胡萝卜素。进一步定量分析，结果如图8所示，最大的产量达到3.56mg/L，与最小的产量0.18mg/L相比，呈现出20倍的差距，这足以证明本组装技术能够组装构建多样性丰富的代谢途径。因此可以应用于代谢途径的组合优化和组装改造。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。