一种双吲哚马来酰亚胺生物碱HD‑ZWM288在制备抗肿瘤微管抑制剂药物的应用的制作方法

本发明涉及一种双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288的抗肿瘤新用途，具体涉及双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288在制备抗肿瘤微管抑制剂的应用。

背景技术：

肿瘤是目前严重危害人类健康和生活质量的一类疾病，作用于微管的抗肿瘤药物是最有效的一类应用于临床的药物。该类药物利用微管的动力学特性，或促进其解聚或促进其聚合，从而达到直接影响细胞有丝分裂，并影响细胞的诸多正常生理功能，使细胞分裂停止于有丝分裂期（G2/M期），最终以细胞凋亡的形式引起肿瘤细胞死亡。但是，已有的微管蛋白抑制剂，例如，临床上广泛应用的长春新碱、紫杉醇普遍存在着耐药性、毒副作用等问题，极大的限制了这些药物的疗效和应用，因而，低毒抗耐药的新型微管抑制剂的发现是肿瘤治疗的一个研究热点，对抗肿瘤新药的发现具有重要而深远的意义。

双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288是以天然产物为先导物优化修饰得到的新双吲哚马来酰亚胺类生物碱。吲哚马来酰亚胺生物碱类化合物具有蛋白激酶C抑制活性，但是是否具有其他重要的靶点作用及药理活性，值得深入研究。基于这一原因，我们利用微管靶点的筛选系统，发现HD-ZWM288具有促进微管解聚、破坏微管动态不平衡性、破坏纺锤体、阻滞细胞有丝分裂、引起细胞凋亡的通路和机制；具有肿瘤抗新生血管作用，并且动物抗肿瘤试验有效。是一种非常具有开发前景的化疗药物。

技术实现要素：

本发明的目的是研究双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288抗肿瘤微管抑制剂的新用途。

为了进行本发明的实验研究，首先合成得到双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288纯品，制成实验用药样品。双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288合成路线附图1 ：

双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288促进微管蛋白的解聚、影响微管的动态平衡作用

免疫荧光实验：

将盖玻片铺于24孔板中，取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞接种到24孔培养板中的圆形盖玻片上，置于培养箱中培养过夜爬片，然后用 HD-ZWM-288处理细胞24 h。然后取出，进行免疫荧光染色：

（1）弃培养液，PBS洗涤2次，用甲醇/丙酮1:1室温固定5 min。

（2）PBS洗涤5 min。

（3）加入0.1%的Triton-100 10 min。

（4）用PBS-TX洗涤3次，每次5 min。

（5）加入一抗，室温避光孵育4h

（6）吸掉一抗，PBS-TX洗涤3次，每次5 min。加入二抗室温避光1-2h。

（7）吸掉二抗，，DAPI（2 μg/ml）室温避光染色15 min，条件下进行。

（8）吸掉PBS-TX后，在载玻片上滴加抗荧光淬灭剂，将爬片反盖于载玻片上。共聚焦显微镜下观察并拍照。

结果见附图2A

提取细胞微管

取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞接种到6孔培养板中，置于培养箱中培养过夜，然后用0.1 μM VCR（长春新碱）和HD-ZWM-288（0.25 μM和0.5 μM）分别处理细胞24 h。

（1）弃培养液，PBS洗涤2次。

（2）加入100 μl微管提取低渗溶液，置于37度5 min. 度

（3）4度下14000 rpm 离心10分钟，取上清于新EP管中，这一部分为可溶的微管二聚体，沉淀则含有不溶性的聚合微管，将沉淀重新溶解在100 μl低渗溶液中。

（4）将两部分还有蛋白的溶液加入与之等体积的2×SDS-PAGE sample buffer，置于95度灭活5 min，之后用Western blot方法对蛋白含量进行分析。

结果见附图2B

影响微管的动态平衡

方法：牛脑微管蛋白（>97％纯的微管蛋白）加入10ML的G-PEM缓冲液（80 mM PIPES, 2 mg MgCl2, 0.5 mM EGTA, 1.0 mM GTP, pH 6.9）、5％甘油、0.1％DMSO中于 4℃混悬，然后加入供试品，按照试剂盒(Cat. BK004)的方法(Cytoskeleton Inc., Denver, USA)，样品转入96孔板，340nm荧光分光光度计(Perkin–Elmer/Wallac Inc., Freiburg, Germany) .测定，每分钟一次共1h。

结果见附图3

细胞周期的抑制作用

（1）取对数生长期的将人乳腺癌MCF-7细胞接种到6孔板中细胞密度为3×104/mL，培养过夜贴壁，用不同浓度的HD-ZWM-288作用于细胞24小时。

（2）消化收集细胞，2000 rpm 离心5分钟，并用PBS洗2次，转移至EP管中。

（3）每管用150 μL冷PBS悬浮细胞，滴加350 μL预冷的乙醇固定过夜。

（4）PBS洗涤2次，加入100 μL PBS重悬细胞，并加入1.5 μL RnaseA（10 mg/ml）于37度孵育30 min

（5）每管加入5 μL PI（1 mg/mL）,于4度避光1 h。加入适量PBS于流式管中，调整细胞浓度为1×106/mL上流式细胞仪检测。计数20 000个细胞，检测完后用CELLQuest软件分析细胞群体中G1、S、G2/ M期细胞百分率。

结果见附图4

双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288对肿瘤细胞的生长抑制作用

方法：取对数生长期的以上细胞株制成细胞悬液，接种于96 孔板，每孔100 μl，细胞密度为5000-10000/孔。置于37度、5% CO2的细胞培养箱中培养过夜贴壁后，分别用不同浓度的HD-ZWM-288处理细胞，同时设阴性对照组，即细胞中含有相同浓度的DMSO的对照组。继续培养12 h、24 h和48 h后，每孔加入MTT（5 g/L）溶液12 μl，37度培养4 h，吸去上清液，加入150 μl DMSO，避光10 min后，振荡摇匀，使结晶充分溶解。用酶标分析仪于570 nm测定各孔OD值。重复三次取平均值。并且用软件计算IC50值。

结果见表1

表1 HD-ZWM-288对多种肿瘤细胞和正常细胞的的细胞毒活性

MTT实验测定HD-ZWM-288对多种肿瘤细胞和正常细胞的的细胞毒活性，将细胞置于不同浓度的HD-ZWM-288处理细胞12-24 h，HD-ZWM-288作用于肿瘤细胞MCF-7、MDA-MB-231、U87、K562、A549、HELA和正常细胞RPE-1和 HUVEC 48 h后的IC50结果如表1所示，从中发现HD-ZWM-288能够显著抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231的增殖，尤其对MCF-7细胞株的毒性效果最好，IC50是0.62 μM，并呈现剂量依赖性和时间依赖性。同时检测了HD-ZWM-288对另外两种正常细胞（RPE-1和HUVEC）的细胞毒活性。如表所示，HD-ZWM-288对这两种正常细胞的细胞毒活性比肿瘤细胞低，HD-ZWM-288处理48 h，RPE-1和HUVEC的IC50分别是4.01和5.92 μM。

双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288抗新生血管作用

划痕实验

（1）先用Marker笔在6孔板背后用直尺均匀划横线，大约每隔0.5-1 cm一道，每孔至少穿过5条线。

（2）在每个孔中加入约5×105个细胞，过夜贴壁。

（3）用进口200 μL的枪头比着直尺尽量重叠于横线划痕。

（4）用PBS冲洗细胞三次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

（5）放入置于37度，5% CO2细胞培养箱中培养，每间隔一定时间拍照。

结果见附图5

管形成实验

（1）从-20度冰箱中取出Matrigel胶，在4度放置约1 h使其融化。融化后将其铺于96孔板，每孔50 μL，置于37度培养箱中使其凝固。

（2）将HUVEC细胞悬液铺于已有凝固的Matrigel胶的孔内，每孔100 μL。加入不同浓度的HD-ZWM-288，置于培养箱中孵育。

（3）观察到出现管形成后，置于10×objective lens下观察，选取五个视野拍照。

（4）用Motic Image Plus 2.0软件处理。管形成定义为分支点的形成。

结果见附图6

鸡胚尿囊膜实验

（1）鸡胚准备：选购新鲜北京白鸡种蛋若干枚，先用蒸馏水洗净，用1:1000新洁尔灭浸泡3 min，置于温度为37度、湿度为40%-60%的培养箱中孵育7天，气室朝上放于蛋托上。

（2）用照蛋灯观察筛选出有正常血管的种蛋，并造假气室，即在气室顶端用牙科钻打1-2 mm小孔。同时在正对鸡胚的位置也打磨一个小孔，并滴一滴灭菌水，再用洗耳球在气室小孔处吸气。最后，用医用胶布贴住蛋身小孔，此孔向上置于孵箱中稳定1-2天。

（3）开窗：在蛋身小孔的位置,两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位，用牙科细砂轮打一个约1.5 cm×1 cm的长方形窗口，用镊子揭去蛋壳，在壳膜上滴加1滴灭菌水，使尿囊膜与蛋壳分开，并剪除卵壳膜。

（4）加药：在开窗的位置，将无菌明胶海绵小块置于相对无血管区，然后用微量注射器向小块内加入稀释药物。分为阴性对照组（生理盐水组）和给药组（HD-ZWM-288组，10 μg、50 μg、100 μg、200 μg和300 μg）。给药后用医用透明胶纸封闭窗口，37℃孵育3天后观察。

（5）结果观察：揭去透明胶，在体式显微镜下进行观察与拍照。

结果见附图7

双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288体内移植瘤抑制作用

（1）建立MCF-7皮下移植瘤裸鼠模型：取处于对数生长期的MCF-7细胞，进行胰酶消化后，l000rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤沉淀两次，弃掉上清。用生理盐水重悬细胞沉淀，使细胞密度为107个/只，用注射器吸取200 μL细胞悬液皮下接种到Balb/c无胸腺雌性裸鼠腋下。一个月后，待肿瘤长到合适大小，再取出捣碎用穿刺针将瘤块接种到16-18g的SPF级Balb/c无胸腺雌性裸鼠腋下，于IVC-II型(智能型)独立送风隔离笼具中进行饲养。

（2）分组及给药：待肿瘤组织长至100mm3时，将裸鼠按照肿瘤大小随机分为4组，每组6只，分别为阴性对照组（vehicle）、阳性对照长春新碱组（vincristin）和 HD-ZWM-288 高、低剂量组。每三天腹腔注射给药，vincristin 注射液0.5 mg/kg，HD-ZWM-288 溶液15 mg/kg和30 mg/kg，同时阴性对照组给予等体积溶剂。给药持续15天。

（3）肿瘤体积和裸鼠体重测量：分组后，每三天测量裸鼠的体重，并用游标卡尺测量肿瘤组织的长（L）和宽（W），计算肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)计算公式为：L×W2×0.5

计算每组内所有小鼠肿瘤体积和体重的平均值，用Origin 8.0制作成体重和肿瘤体积增长折线图。

（4）给药结束后，将所有裸鼠处死取出肿瘤组织，进行拍照并称重。每组拿出部分瘤块用4%多聚甲醛固定用于切片，一部分储存于-80℃保存，用于提取肿瘤蛋白。

HE染色

（1）将石蜡切片常规脱蜡至水：将石蜡切片置于60-70℃恒温烤箱中烘烤2 h,依次将载玻片放入二甲苯4 h、二甲苯4 h、二甲苯过夜。在依次转入100%乙醇、100%乙醇、95%酒乙醇、75%乙醇，每次5分钟。

（2）苏木素-伊红染色：将脱蜡后的片子用清水冲洗后，浸泡于苏木素中染色30s，然后用自来水冲洗充分冲洗后放入伊红染液5s，再用自来水冲洗。

（3）脱水：将染色后的片子置于自来水中冲洗后，依次将载玻片放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇，每次5分钟。再依次转入二甲苯、二甲苯，每步10分钟)，置于通风柜中挥干二甲苯。

（4）封片：用中性树胶滴在组织面用盖玻片盖上，免产生气泡。封好片子后置于通风柜中晾干，再置于显微镜下观察及拍照。

免疫组化染色

（1）将石蜡切片常规脱蜡至水：将石蜡切片置于60-70℃恒温烤箱中烘烤2 h,依次将载玻片放入二甲苯4 h、二甲苯4 h、二甲苯过夜。在依次转入100%乙醇、100%乙醇、95%酒乙醇、75%乙醇，每次5分钟。

（2）抗原修复，采用电炉加热修复。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（PH 6.0）的容器中，电炉加热至沸腾后断电。间隔5-10 min后，反复1-2次。冷却至室温。

（3）3%H2O2去离子水孵育5-10 min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，3 min×3次。

（4）滴加SP-9000试剂盒中的A液，室温孵育10-15 min，甩去多余液体，勿洗。

（5）滴加适当比例稀释的一抗，于湿盒中4度孵育过夜。PBS冲洗，3 min×3次。

（6）滴加B液，室温或37度孵育10-15 min，PBS冲洗，3 min×3次。

（7）滴加C液，室温或37度孵育10-15 min，PBS冲洗，3 min×3次。

（8）显色剂DAB显色：准备1 mL双蒸水，加入DAB试剂盒中的试剂A一滴，混合均匀，然后将试剂B和C各一滴加入其中，再次混匀。现用现配，滴加到切片上。室温显色2-10 min后，用自来水充分冲洗。

（9）苏木素复染：用苏木素染色液进行细胞核染色。置于自来水中冲泡，甩净水。

（10）0.1%盐酸酒精分色5-10 s，取出自来水冲洗10 min

（11）脱水：将染色后的片子置于自来水中冲洗后，依次将载玻片放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇，每次5分钟。再依次转入二甲苯、二甲苯，每步10分钟)，置于通风柜中挥干二甲苯。

（12）封片：用中性树胶滴在组织面用盖玻片盖上，免产生气泡。封好片子后置于通风柜中晾干，再置于显微镜下观察及拍照。

结果见附图8

附图1 HD-ZWM288的合成路线

附图2 (A) α-tubulin和DAPI免疫荧光染色叠加图片。观察HD-ZWM288 对微管蛋白(tubulin)（绿色）结构的影响，并与长春新碱对比，发现药物处理后，微管分布发生改变，细胞内微管长度缩短，微管由丝状解聚为颗粒状的微管蛋白，管状的结构成为散点状，密度变稀，高浓度下可见某些细胞内纤维状微管断裂甚至消失，与微管解聚剂长春新碱的作用类似；微管动态平衡破坏, 多极纺锤体形成, 细胞不能分裂）。(B) Western blot结果显示，HD-ZWM-288能够使聚合形式的tubulin蛋白表达水平下降，对可溶性微管蛋白的略有影响，总体的微管蛋白水平变化不大。

附图3体外双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288对微管动态平衡的影响。结果表明，双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288以剂量依赖的方式减少的吸光度，影响微管蛋白的聚合速率，显著抑制微管蛋白的聚合。

附图 4 流式细胞仪测定结果表明，HD-ZWM288显著使细胞周期阻滞在G2/M期

附图 5结果所示， HD-ZWM-288可以以时间和剂量依赖的方式抑制HUVEC细胞的迁移。在低剂量下，从12 h至24 h，抑制率可以从40.1% 达到92.2%，在最高剂量1 μM下，抑制率从55.0%达到94.3%

附图 6结果表明，HD-ZWM-288有较好的抑制管形成作用。作用一定的时间之后，HD-ZWM-288在浓度0.25 μM,，0.5 μM和1 μM，与溶剂对照组相比，管分支点的数量分别下降至47.1%,33.3%和12.7%。

附图7 以明胶海绵载药，载药量分别为0 μg、10 μg、50 μg、100 μg、200 μg和300 μg，置于尿囊膜上孵育3天后观察并进行血管的统计。由于鸡胚不断运动使得大部分鸡胚尿囊膜上的载药明胶海绵发生移位无法准确观察，因此只计数海绵周围及其下方一定范围内的血管数。如图所示，72 h 后，与溶剂对照组相比，50 µg 的血管数组表现出轻微的抑制，而100 µg和200 µg组有效地减少了鸡胚尿囊膜上的血管数，并且伴随着HD-ZWM-288剂量的增加，血管网络有逐渐破坏的趋势，统计结果表现出显著性差异。结果表明，HD-ZWM-288能够抑制鸡胚尿囊膜的新生血管。

附图8 (A, B) 与对照组裸鼠的肿瘤体积相比,给药组（阳性药VCR组和HD-ZWM-288组）的肿瘤体积增加明显缓慢，说明HD-ZWM-288可以抑制肿瘤的生长。（C）给药组的裸鼠体重不同程度减轻，阳性药VCR组较HD-ZWM-288组毒性更大。(D) HE染色结果表明，对照组的肿瘤组织表现出丰富的血管和良好的增殖活力，而给药组的肿瘤细胞则呈现出不同的程度的坏死。以上结果表明, HD-ZWM-288能显著地抑制肝癌HepG-2肿瘤的生长，毒性较小。