一种检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针的制作方法

本发明涉及一种用于癌细胞内溶酶体pH成像的新型比率型荧光探针及其应用，属于分析化学技术领域。

背景技术：

细胞内pH值作为新陈代谢的一个重要的参数，在细胞周期调控、细胞的z增值与凋亡、离子转运、酶活性、钙调控、肌肉收缩等细胞生理调控和病理过程中发挥着非常重要的作用。同时，细胞的内吞作用以及受体配体的内化作用也同样受细胞内pH的影响。细胞内pH异常会导致生物体内细胞和组织器官的生理功能紊乱、酶和蛋白质活性受到抑制、人体的免疫力下降，最终引发炎症、癌症以及阿尔茨海默症等疾病。研究表明，在细胞凋亡初期，癌细胞通常会产生起细胞内的酸化作用，因此细胞内酸化已成为细胞凋亡的一个重要的早期特征。此外，细胞内 pH变化同时与细胞凋亡密切相关。因此，对细胞内 pH进行准确地进行原位实时监测，有助于从细胞水平上研究细胞的生理和病理过程。

溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，通常具有单层膜包被的囊状结构，多为球形，大小约0.025~0.8微米。溶酶体内含蛋白酶、核酸酶、脂肪酶及硫酸脂酶等许多酶，为细胞内的消化器官，可分解各种蛋白质等大分子物质，具有溶解或消化的功能。溶酶体内的降解酶在弱酸性条件下（pH约为5）发挥最佳活性，但是当溶酶体内的pH异常时，由于各种降解酶的活性发生变化，其溶解消化功能会受到不同程度的影响，进而导致类风湿关节炎、肿瘤等疾病的发生。因此，迅速准确地检测细胞内溶酶体的pH值可为研究相关生理和病理过程，以及预防关节炎、癌症等相关疾病提供重要的信息。

荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种生物小分子的检测。目前，用于检测细胞内pH值的荧光探针也得到了迅速发展，其中一些已经商品化。但是，目前报道的和已经商品化的溶酶体pH荧光探针大都不具备溶酶体靶向，一般对所有细胞都有相应。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，且具有癌细胞靶向的溶酶体pH荧光探针具有重要的意义。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明提供了一种新型检测癌细胞内溶酶体pH的新型荧光探针及其应用。

本发明所述的新型检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针为含有生物素基团的萘酰亚胺衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（ ）所示，其中生物素部分具有癌细胞靶向性：

式（）

本发明所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针的制备方法为：将式（Ⅱ）所示的化合物a1 (1 mmol)、a2 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL)加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到浅黄色产物即为本发明所述检测癌细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针。

式（Ⅱ）

本发明所述的荧光探针在检测癌细胞内溶酶体pH的应用。

本发明所述的荧光探针可应用于癌细胞内溶酶体pH的检测评价。该探针作为癌细胞溶酶体pH的特异性探针，可在不同pH环境下，通过萘酰亚胺部分吗啉基团的质子化，生成具有不同荧光发射能力的形态，通过检测不同形态的荧光强度来测定癌细胞溶酶体中的pH。

具体测定方法为：室温条件下，配制5 μM荧光探针乙醇溶液，加入到具有不同pH值的B-F缓冲液体系中，测定溶液荧光强度作为pH的评价指标。

本发明所述的荧光探针在酸性条件下，萘酰亚胺荧光团的吗啉部分将会发生质子化，从吗啉到萘酰亚胺荧光团的PET作用将被抑制，此时荧光探针可以发射萘酰亚胺荧光团的绿色荧光（峰值约为531 nm）；在碱性条件下，萘酰亚胺荧光探针的荧光因来自于吗啉的PET作用而得到淬灭，此时萘酰亚胺荧光团的绿色荧光（峰值约为531 nm）将减弱。同时，由于生物素具有癌细胞靶向性，吗啉具有溶酶体靶向功能，因此该荧光探针可以用于检测癌细胞溶酶体内的pH。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为380 nm，在420~700 nm之间进行荧光发射光谱的检测。

荧光探针在生物成像应用研究主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细胞和活组织荧光成像。采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对细胞的毒性。借助流式细胞仪，检测细胞在加入荧光探针培育之后的染色比例，进而考察荧光探针对细胞的染色能力。在此基础上，应用本发明所述的荧光探针对癌细胞溶酶体内的pH进行荧光成像，可以达到对癌细胞中的pH快速准确检测的目的，进而为分析癌症的发病阶段提供依据。

本发明的有益效果为：

本发明所述的检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。

本发明所述的检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针在进行相应pH检测过程中不受其他生物组分的干扰，可用于活癌细胞内溶酶体pH的实时测定，具有广阔的应用前景。

本发明所述的检测细胞内溶酶体pH的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（400~500 nm），通过绘制标准曲线进行细胞内溶酶体pH测定，可以实现对细胞中的pH快速准确检测的目的。

附图说明

图1是荧光探针的¹H NMR图谱。

图2是荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱。

图3是荧光探针与pH的线性关系数据。

图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱。

图5是荧光探针在活细胞中的成像应用。

A图：绿色通道为探针（10 μM）在癌细胞HeLa细胞中的成像，红色通道表示溶酶体定位试剂Lyso-Tracker Red的细胞成像，该图表明探针具有溶酶体靶向；B图：探针（10 μM）在HeLa不同pH条件下的细胞成像，随着pH的增大，细胞荧光强度逐渐降低。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护内容不仅限于此。

实施例1

本发明所述检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针的制备

将式（Ⅱ）所示的化合物a1 (1 mmol)、a2 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL)加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌24小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到浅黄色产物即为本发明所述检测细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇=20:1 ) 纯化，得到黄色产物，即为本发明所述检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针1a，产率56%。

上述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针的¹H NMR图谱见图1。

实施例2

本发明所述检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱

预先准备10份5mL的 5 μM探针B-F缓冲溶液，含5%甲醇，pH 依次为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0。然后进行荧光检测（λ_Ex= 445 nm）；计算各体系中荧光强度；评估该探针对pH的响应性能（见图2）。分析溶液pH从3.0升到9.0时，531nm处的荧光强度逐渐减弱，见图3。其中，分析溶液pH在4.5~6.5范围内，531nm处的荧光强度与pH的线性关系，可用公式Y = 12022 - 1723 * X （R = 0.9886）表示，Y为荧光强度，X为pH值。

实施例3

荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱

预先准备10份5mL的 5 μM探针B-F缓冲溶液(含5%甲醇，pH = 7.4)，然后分别向该体系中依次加入50 μL浓度为10 mM的Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、NO、H₂O₂、HClO₄、Cys、GSH、NaNO₂、VC等的PBS溶液。然后进行荧光检测（λ_Ex= 445 nm）；计算各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性（见图4）。通过图4可以看出，在溶液pH为4.5或7.4时，加入Hcys、Na₂S、Na₂SO₃等小分子时，溶液的荧光强度基本不变，这表示检测结果基本不受其他干扰物质的影响。

实施例4

荧光探针在活细胞中的成像应用

将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清)中，放置于条件为37℃、5% CO₂和20% O₂的培养箱中培养24 -48h。用微量进样器吸取本发明所述检测细胞内溶酶体pH的荧光探针(10 μM)和溶酶体定位试剂 Lyso-Tracker Red注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。之后用PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞3次，然后进行荧光成像。

结果见图5。 图5中A，绿色通道的荧光来自于荧光探针，红色通道的荧光来自于溶酶体定位试剂 Lyso-Tracker Red，这两种荧光具有很好的重叠度，因此可以认为该探针具有溶酶体靶向。从图5中B可以看出，随着pH的增大，荧光强度逐渐减弱，表明该探针可以用于检测溶酶体内的pH。