本发明涉及一类检测细胞膜附近一氧化氮的双光子荧光探针，其属于精细化工技术领域。
背景技术：
一氧化氮是氮的氧化物，其化学性质活泼，20世纪末期被证明具有重要的生理调节功能，例如在心血管系统、神经系统中调解血管的舒张，在免疫系统中具有杀菌、抗肿瘤等作用；而其在细胞或组织内的代谢紊乱，会引起高雪氏病、空腔癌等疾病。因此，高灵敏、高选择性的检测机体内的一氧化氮具有重要的医学意义。
荧光显微技术作为一种直观实时的监测手段适合用于活细胞或组织的实时检测。而作为细胞的门户，细胞膜是接受外界信号分子调解作用的第一站；对于个别细胞系细胞膜也是一氧化氮生成的主要位置，即为一氧化氮调解作用的发起点。然而目前尚无可用于检测细胞膜附近一氧化氮的荧光探针。因此，我们设计了一系列具有细胞膜靶向功能的一氧化氮荧光探针分子，为一氧化氮相关疾病的研究提供更直观和简洁的研究工具。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一系列用于靶向细胞膜并能检测细胞膜附近一氧化氮分子的荧光探针及其制备方法，系列探针可快速稳定定位于细胞膜，并能通过单光子及双光子激光激发进行荧光成像。
本发明采用的技术方案是：靶向细胞膜并能检测细胞膜附近一氧化氮的荧光探针，以萘酰亚胺为母体，具有如下结构通式：
通式中n＝0、1、2、3或4；
一类用于检测细胞膜附近一氧化氮分子的荧光探针的制备方法，所述荧光探针制备方法为：
以1摩尔含有2-氯乙胺(或碳数更多的氯代伯胺)与相应的仲胺溶于dmf、乙腈、丙酮或dmso等溶剂，加入与2-氯乙胺摩尔比为1:5的碳酸钾和碘化钾在30-130℃下反应3-24h，得到中间体a1；中间体a1与化合物a2以摩尔比为5:1-1:1在无水醋酸钠(与a2为0.1-10.0摩尔当量)的催化下加热至100-130度反应5-9h，通过氧化铝柱分离提纯，得到中间体a3；中间体a3溶于过量的5mol/l的硫酸中，回流反应2h－5h，停止反应，趁热倒入碎冰中，使用naoh调节ph至弱碱性，有黄色固体从溶液中析出，过滤得到中间体a4，无需提纯直接用于下一步反应；中间体a4与4-溴-1，8-萘二甲酸酐加入到20ml冰醋酸中，加热回流6h，停止反应，反应液倒入碎冰中，使用氢氧化钠调节至碱性，使用二氯甲烷萃取，利用中性氧化铝柱分离提纯，得到中间体a5；中间体a5和过量烷基胺加入到8mldmso中，100-150℃搅拌3h，使用二氯甲烷与水萃取，有机相使用硅胶柱分离提纯，得到中间体a6；将a6溶于少量二氯甲烷中，室温搅拌，加入季氨化试剂，继续搅拌1－24h，中间体a7从溶剂中析出，过滤得到固体中间体a7；a7在四氢呋喃中使用钯碳催化，加氢还原48h，滤液减压旋干，使用二氯甲烷和正己烷重结晶提纯，得到黄色粉末，即目标探针；所述荧光探针与含有不同阴离子的钠盐或是钾盐在甲醇中搅拌24h，使之进行离子交换，得到含有不同反离子的荧光探针。
所述荧光探针可以快速、稳定的停留在细胞膜上，并通过荧光信号的增强指示细胞膜附近一氧化氮分子的存在；系列探针分子不仅可以通过单光子激光激发进行荧光成像，更可实现690nm－950nm的双光子激光进行荧光成像，适合细胞及深层次生物组织内部进行荧光检测。
本发明的有益效果是：该探针以萘酰亚胺为母体，引入不同亲水性邻苯二胺衍生物以及疏水性长烷基链得到目标探针分子。该系列探针分子对具有两亲性的类磷脂结构，可以快速稳定的定位于细胞膜；其邻苯二胺结构对一氧化氮分子敏感，结合后组织探针分子内的pet效应，使得探针分子恢复荧光发射，进而指示一氧化氮分子的存在；与一氧化氮响应后的探针分子在540nm左右发射强荧光，对神经元细胞细胞荧光成像和对小鼠脑切片组织荧光成像，显示了该系列探针不仅可以通过单光子激光激发进行荧光成像，更可实现690nm－950nm的双光子激光进行荧光成像，适合细胞及深层次生物组织内部进行荧光检测。探针分子固体状态性质稳定，易于保存，可作为探究一氧化氮相关生理过程的检测试剂。
附图说明
图1是探针p-1在溶液中荧光光谱随一氧化氮浓度的变化。
图2是探针p-1在溶液中对一氧化氮选择性的检验。
图3是探针p-1对神经元细胞细胞染色后对外源性一氧化氮的荧光成像。
图4是探针p-1对小鼠脑切片组织染色后对外源性一氧化氮的荧光成像。
具体实施方式
实施例1
2-氯乙胺盐酸盐1g与二甲胺盐酸盐3.5g溶于30mldmf中，加入碳酸钾6g和碘化钾1.4g，在30℃下反应8h，反应结束后，相反应液中加入200ml乙醚，用水萃洗3遍，保留乙醚相，无水硫酸镁干燥后，减压蒸馏除去乙醚，得到中间体a1-1；将化合物a2-14g，无水醋酸钠2.5g和a34.09g混合，加热到100℃反应5h，溶液由红色变为黑色，停止反应冷却反应混合物至室温，使用二氯甲烷溶解混合物，水洗三次，干燥有机相，过滤，减压除去溶剂，柱层析分离提纯，得到中间体a3-1；将化合物a31.2g溶于20ml浓度为5mol/l的硫酸中，回流反应2h，停止反应，趁热将反应液倒入碎冰中，加入氢氧化钠使溶液变为弱碱性，溶液由暗红色变为黄绿色浑浊液，析出黄色沉淀，过滤的到中间体a4-1，无需提纯直接用于下一步反应；中间体a4-10.5g与4-溴-1，8-萘二甲酸酐0.65g加入到20ml冰醋酸中，加热回流6h，停止反应，反应液倒入碎冰中，使用氢氧化钠调节至碱性，使用二氯甲烷萃取，利用中性氧化铝柱分离提纯，得到中间体a5-1；中间体a5-10.2g和过量十八烷基胺加入到8mldmso中，100℃搅拌3h，使用二氯甲烷与水萃取，有机相经无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，使用硅胶柱分离提纯，得到中间体a6-1；将a6-10.13g溶于5ml二氯甲烷中，室温搅拌，加入碘甲烷，继续搅拌24h，中间体a7-1从溶剂中析出，过滤得到固体中间体a7-1；a7-10.1g溶于30ml四氢呋喃中，加入0.1g10％钯碳，加氢还原48h，滤液减压旋干，使用二氯甲烷和正己烷重结晶提纯，得到黄色粉末，上述黄色粉末与过量的溴化钠在甲醇中搅拌24h，使之进行离子交换，得到荧光探针p-1。
实施例2
3-氯丙胺盐酸盐1g与吗啉3.8g溶于50ml乙腈中，加入碳酸钾5g和碘化钾1.2g，在30℃下反应8h，反应结束后，相反应液中加入200ml乙醚，用水萃洗3遍，保留乙醚相，无水硫酸镁干燥后，减压蒸馏除去乙醚，得到中间体a1-2；将化合物a2-24g，无水醋酸钠2.5g和a34.09g混合，加热到100℃反应5h，溶液由红色变为黑色，停止反应冷却反应混合物至室温，使用二氯甲烷溶解混合物，水洗三次，干燥有机相，过滤，减压除去溶剂，柱层析分离提纯，得到中间体a3-2；将化合物a3-21.2g溶于20ml浓度为5mol/l的硫酸中，回流反应2h，停止反应，趁热将反应液倒入碎冰中，加入氢氧化钠使溶液变为弱碱性，溶液由暗红色变为黄绿色浑浊液，析出黄色沉淀，过滤的到中间体a4-2，无需提纯直接用于下一步反应；中间体a4-20.5g与4-溴-1，8-萘二甲酸酐0.55g加入到20ml冰醋酸中，加热回流6h，停止反应，反应液倒入碎冰中，使用氢氧化钠调节至碱性，使用二氯甲烷萃取，利用中性氧化铝柱分离提纯，得到中间体a5-2；中间体a5-20.2g和过量烷基胺加入到8mldmso中，100℃搅拌3h，使用二氯甲烷与水萃取，有机相经无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，使用硅胶柱分离提纯，得到中间体a6-2；将a6-20.13g溶于5ml二氯甲烷中，室温搅拌，加入过量丙磺酸内酯，继续搅拌24h，中间体a7-2从溶剂中析出，过滤得到固体中间体a7-2；a7-20.1g溶于30ml四氢呋喃中，加入0.1g10％钯碳，加氢还原48h，滤液减压旋干，使用二氯甲烷重结晶提纯，得到黄色粉末，上述黄色粉末与过量的高氯酸钠在甲醇中搅拌24h，使之进行离子交换，得到荧光探针p-2。
实施例3
4-氯丁胺5g与吡咯4g溶于30ml乙腈中，加入碳酸钾5g和碘化钾1.2g，在30℃下反应12h，反应结束后，相反应液中加入200ml乙醚，用水萃洗3遍，保留乙醚相，无水硫酸镁干燥后，减压蒸馏除去乙醚，得到中间体a1-3；将化合物a2-34g，无水醋酸钠2g和a33.5g混合，加热到100℃反应5h，溶液由红色变为黑色，停止反应冷却反应混合物至室温，使用二氯甲烷溶解混合物，水洗三次，干燥有机相，过滤，减压除去溶剂，柱层析分离提纯，得到中间体a3-3；将化合物a3-32g溶于20ml浓度为5mol/l的硫酸中，回流反应2h，停止反应，趁热将反应液倒入碎冰中，加入氢氧化钠使溶液变为弱碱性，溶液由暗红色变为黄绿色浑浊液，析出黄色沉淀，过滤的到中间体a4-3，无需提纯直接用于下一步反应；中间体a4-30.5g与4-溴-1，8-萘二甲酸酐0.6g加入到20ml冰醋酸中，加热回流6h，停止反应，反应液倒入碎冰中，使用氢氧化钠调节至碱性，使用二氯甲烷萃取，利用中性氧化铝柱分离提纯，得到中间体a5-3；中间体a5-30.2g和过量十六烷基胺加入到8mldmso中，120℃搅拌3h，使用二氯甲烷与水萃取，有机相经无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，使用硅胶柱分离提纯，得到中间体a6-3；将a6-30.1g溶于5ml二氯甲烷中，室温搅拌，加过量对苯二苄氯，继续搅拌24h，中间体a7-3从溶剂中析出，过滤得到固体中间体a7-3；a7-30.1g溶于30ml四氢呋喃中，加入0.1g10％钯碳，加氢还原48h，滤液减压旋干，使用二氯甲烷和正己烷重结晶提纯，得到黄色粉末，上述黄色粉末与过量的碘化钠在甲醇中搅拌24h，使之进行离子交换，得到荧光探针p-3。
实施例4
5-氯戊胺5g与环戊胺4g溶于30ml乙腈中，加入碳酸钾5g和碘化钾1.2g，在30℃下反应12h，反应结束后，相反应液中加入200ml乙醚，用水萃洗3遍，保留乙醚相，无水硫酸镁干燥后，减压蒸馏除去乙醚，得到中间体a1-4；将化合物a2-44g，无水醋酸钠2g和a33.5g混合，加热到100℃反应5h，溶液由红色变为黑色，停止反应冷却反应混合物至室温，使用二氯甲烷溶解混合物，水洗三次，干燥有机相，过滤，减压除去溶剂，柱层析分离提纯，得到中间体a3-4；将化合物a3-42g溶于20ml浓度为5mol/l的硫酸中，回流反应2h，停止反应，趁热将反应液倒入碎冰中，加入氢氧化钠使溶液变为弱碱性，溶液由暗红色变为黄绿色浑浊液，析出黄色沉淀，过滤的到中间体a4-4，无需提纯直接用于下一步反应；中间体a4-40.5g与4-溴-1，8-萘二甲酸酐0.6g加入到20ml冰醋酸中，加热回流6h，停止反应，反应液倒入碎冰中，使用氢氧化钠调节至碱性，使用二氯甲烷萃取，利用中性氧化铝柱分离提纯，得到中间体a5-4；中间体a5-40.2g和过量支链十八烷基胺加入到8mldmso中，120℃搅拌3h，使用二氯甲烷与水萃取，有机相经无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，使用硅胶柱分离提纯，得到中间体a6；将a6-40.1g溶于5ml二氯甲烷中，室温搅拌，加过量丙烯醛，继续搅拌24h，中间体a7-4从溶剂中析出，过滤得到固体中间体a7-4；a7-40.1g溶于30ml四氢呋喃中，加入0.1g10％钯碳，加氢还原48h，滤液减压旋干，使用二氯甲烷和正己烷重结晶提纯，得到黄色粉末，上述黄色粉末与过量的高碘酸钠在甲醇中搅拌24h，使之进行离子交换，得到荧光探针p-4。
实施例5
荧光探针p-1用于活细胞中细胞膜上和脑组织中一氧化氮的检测,不仅可以通过单光子激光激发进行荧光成像，更可实现690nm－950nm的双光子激光进行荧光成像,适合细胞及深层次生物组织内部进行荧光检测。
在探针p-1水溶液中外加一氧化氮时探针荧光强度随一氧化氮加入量的变化，由图1可以明显看出，随一氧化氮的加入探针的荧光强度首先呈现线性增强，随后达到最大值。
探针p-1水溶液中加入不同活性氧物质时荧光强度的变化，由图2可以看出只有在加入一氧化氮水溶液时，探针会有显著的荧光增强，而加入其它活性氧物质并不会使探针荧光增强，说明探针具有良好的选择性。
图3为探针对神经元细胞的荧光成像，细胞经1μm探针p-1染色30min并使用pbs洗两遍后进行成像实验，荧光采集范围500-700nm。其中图a为未加入一氧化氮水溶液时的荧光成像，激发波长为405nm，可以看出荧光强度很弱；图b为加入一氧化氮水溶液后的荧光成像，激发波长为405nm，可以看出荧光强度很高，细胞轮廓清晰，说明探针可以在细胞膜上实现对一氧化氮分子的检测；图c为使用900nm双光子激光激发时的荧光成像，可以看出具有与图b同样的成像效果，说明探针可以很好的实现双光子激发下的荧光成像。
图4为探针对鼠脑切片的荧光成像，鼠脑切片经1μm探针p-1染色30min后使用pbs洗两遍后进行成像实验，荧光采集范围500-700nm。图d为鼠脑切片的明场影像；图e为未加入一氧化氮水溶液时在100μm深度的脑组织荧光成像，激发波长为900nm，可以看出荧光强度很弱；图f为加入一氧化氮水溶液后在100μm深度的脑组织荧光成像，激发波长为900nm，可以看到有显著的荧光增强，说明探针可以很好的实现双光子激发下在组织深处进行荧光成像。