具有荧光共振能量转移性能的化合物及其用途的制作方法

本发明涉及一种具有荧光共振能量转移(fret)性能的化合物及其用途；具体地说，涉及一种由三甲川菁染料(cy3)和五甲川菁染料(cy5)构建的具有fret性能的化合物及其用途。

背景技术：

活性氧是由氧气通过电子转移直接或者间接形成的氧自由基及其衍生物。常见的活性氧(ros)和活性氮(rns)包括：次氯酸根(clo^-)，过氧亚硝酸根(oono^-)，过氧化氢(h2o2)，单线态氧(¹o2)，超氧阴离子(o2·^-)，一氧化氮(no)，过氧叔丁基(roo·)，氢氧自由基(·oh)等。

在生物体内，活性氧的主要来源是中性粒细胞，吞噬细胞等的线粒体、内质网和细胞膜。在生物体中，ros和rns可以通过有氧活动持续产生、转移和消耗，是细胞核生物体内氧化还原反应的主要分子来源。他们可以与多种生物分子发生反应，一方面可以调控生理过程的信号传导，另一方面也会造成许多病理损伤，例如，活性氧的含量过高或者其产生于消除的平衡被破坏都会造成dna、蛋白质等的氧化损伤，进而导致糖尿病、动脉硬化、癌症和神经退行性等疾病。

因此，开发可靠、灵敏、高选择性的检测ros和rns的荧光探针将有助于更好地研究ros和rns在体内的分布和作用情况，并且有潜力为相关疾病的早期诊断提供研究工具。备受科学家的关注。

然而，现有检测ros和rns的荧光探针大多依赖单通道检测，只依赖荧光强度的增强，受到探针浓度，细胞微环境等的干扰较大，因此该类探针尚有改进余地。

技术实现要素：

本发明的发明人经大量的母体化合物的筛选，并对筛选获得的母体化合物进行适当的化学修饰后，获得一类化合物。该类化合物具有荧光共振能量转移(fret)作用，可以比率型检测ros和rns，不受探针浓度，背景荧光和仪器误差等因素的影响，且具有较高的fret效率。

本发明一个目的在于，提供一种结构新颖的、且具有较高的fret效率的化合物。

所述的化合物为式z所示化合物、或其在药学上可接受的盐：

式z中，r1～r16分别独立选自：氢(h)，卤素(f、cl、br或i)，氨基(-nh2)，c1～c6直链或支链烷基，c1～c6直链或支链烷氧基，羧基(-cooh)或磺酸基(-so3h)中一种；

ra和rb分别独立选自：c1～c6直链或支链烷基或由羧基(-cooh)或/和磺酸基(-so3h)取代的c1～c6直链或支链烷基中一种；

x为nh，o，s，亚甲基(ch2)或由c1～c3直链或支链烷基取代的亚甲基；

m为1～5的整数；n为1～5的整数；y为二价的含至少两个氮(n)的杂环基；p为阴离子酸根(如卤素(f、cl、br或i)或含氧酸根等)。

本发明另一个目的在于，揭示上述具有fret性能的化合物的一种用途，即：式z所示化合物、或其在药学上可接受的盐在制备检测活性氧(ros)和活性氮(rns)的荧光探针中的应用；以及，式i所示化合物、或其在药学上可接受的盐作为检测ros和rns的荧光探针的应用。

此外，本发明还提供一种制备式z所示化合物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)由式a所示化合物(原料之一)制备中间体：式b所示化合物的步骤；

(2)由式c所示化合物(原料之二)制备中间体：式d所示化合物和式e所示化合物的步骤；

(3)由式f所示化合物(原料之三)与反应，制得式g所示化合物的步骤；

(4)由式g所示化合物与式d所示化合物反应，制得式h所示化合物的步骤；

(5)式b所示化合物与式h所示化合物反应，制得式i所示化合物的步骤；

(6)由式j所示化合物(其制备参见步骤(2))与反应，制得式k所示化合物的步骤；

(7)由式l所示化合物(其制备参见步骤(1))与式k所示化合物反应，制得式m所示化合物的步骤；和。

(8)式m所示化合物与式i所示化合物反应，制得目标物(式z所示化合物)的步骤。

附图说明

图1.为化合物z-1(探针pncy3cy5)在ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中(含0.2％dmf)检测oono^-的紫外光谱响应图。

图2.为探针pncy3cy5(2μm)在ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中(含0.2％dmf)检测oono^-(0-5eq)的荧光发射光谱响应图(激发波长为530nm)。

图3.为化合物i-1(探针cy3boc)在ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中(含0.2％dmf)检测clo^-的紫外光谱响应图。

具体实施方式

在本发明一个优选的技术方案中，r1～r16均为h。

在本发明另一个优选的技术方案中，ra和rb分别独立选自：c1～c3直链或支链烷基中一种；

进一步优选的技术方案是：ra和rb分别独立选自：甲基或乙基中一种。

在本发明又一个优选的技术方案中，x为c(ch3)2。

在本发明又一个优选的技术方案中，y为二价的含至少两个n的5～6元杂环基；

进一步优选的技术方案是：y为二价的含至少两个n的5～6元杂环基；

更进一步优选的技术方案是：y为二价的含至少两个n的6元杂环基；

本发明推荐的y为二价的哌嗪(曲线标记处为取代位)。

在本发明又一个优选的技术方案中，前文所述活性氧(ros)包括：自次氯酸或其共轭碱(clo^-/hclo)，过氧亚硝酸或其共轭碱(hoono/oono^-)，过氧化氢(h2o2)，单线态氧(¹o2)，超氧阴离子(o2·^-)，一氧化氮(no)，过氧叔丁基(roo·)和氢氧自由基(·oh)。

在本发明又一个优选的技术方案中，前文所述活性氮(rns)包括：过氧亚硝酸或其共轭碱(hoono/oono^-)和一氧化氮(no)。

下面通过实施对本发明做进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，所举之例不限制本发明的保护范围。

实施例1

(1)2,3,3-三甲基-3h-吲哚的合成(化合物d-1)

在100ml的单口瓶中依次加入30ml的无水乙醇，苯肼(9.82ml，0.1mol)(化合物c-1)，3-甲基-2-丁酮(12ml，0.11mol)，再加入3滴冰醋酸，加热回流，tlc跟踪至原料转化，冷却后减压蒸发乙醇，得到红色油状液体；继续在红色油状液体中加入30ml冰醋酸，氩气保护，加热回流，tlc跟踪至原料转化，冷却后水泵减压蒸发除去大部分冰醋酸，然后慢慢加入饱和的nahco3水溶液，调节ph至中性。用无水乙醚萃取(3×20ml)，合并有机层，无水na2so4干燥，得到黑红色油状粗产物，柱层析分离(pe/ea＝40:3，v/v；rf＝0.15)得到浅黄色油状液体12.7g(化合物d-1)，产率80％。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)：δ7.55(d，j＝8.0hz，1h)，7.26～7.29(m，2h)，7.20(dd，j＝8.0hz，1h)，2.28(s，3h)，1.29(s，6h)。

¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δ15.18，23.01，53.54，119.79，121.26，125.16，127.57，145.52，153.32，188.11。

gc-ms：计算值c11h13n[m]＝159.1048，实验值[m]＝159.1。

(2)1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚(化合物e-1)的合成

在250ml的单口瓶中依次加入化合物d-1(4.773g，30mmol)，碘乙烷(24.11ml，300mmol)，乙腈60ml，氩气保护，加热回流，tlc跟踪至原料转化，冷却后旋干碘乙烷，抽滤，滤饼用丙酮洗涤，收集滤饼，乙醇重结晶得到黄色片状晶体4.246g(化合物e-1)，产率45％。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)：δ7.77(d，j＝4.0hz，1h)，7.60～7.61(m，3h)，4.76(q，j＝8.0hz，2h)，3.16(s，3h)，1.62～1.66(m，9h)。

¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δ13.70，17.00，23.10，45.37，54.66，115.39,，123.49，129.54，130.16，140.49，141.66，195.38。

lc-ms：计算值c13h18n⁺i^-[m-i]＝188.1434，实验值：188.1。

(3)n,n’-二苯基甲脒的合成

在100ml单口瓶中依次加入苯胺(18.3ml，200mmol)，原甲酸三乙酯(16.6ml，100mmol)，加热回流反应，tlc跟踪至原料转化，冷却后析出大量固体，过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，收集滤饼，无水乙醇重结晶得到白色针状固体14.7g(标题化合物)，产率75％。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)：δ10.31(s，1h)，8.33(s，1h)，7.38(t，j＝8.0hz，4h)，7.17(t，j＝8.0hz，2h)，7.13(d，j＝8.0hz，4h)。

¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δ119.31，123.41，129.46，145.43，150.34。

lc-ms：计算值：c13h12n2[m+h]＝197.1000，实验值：[m]＝197.1。

(4)1-乙基-2-(β-苯胺基)乙烯基-3,3-二甲基吲哚(化合物b-1)的合成

在250ml单口烧瓶中依次加入化合物e-1(4.05g，12.8mmol)，n,n’-二苯基甲脒(2.76g，14.1mmol)，冰醋酸60ml，充氩气保护，加热回流，tlc跟踪至原料转化，减压旋转蒸发除去大部分冰醋酸，用ch2cl2萃取(3×70ml)，合并有机层，无水na2so4干燥，柱层析分离(pe/ea＝2:1，dcm/ea＝3:1，v/v)，得到浅黄色屑状固体1.38g(化合物b-1)，产率26％。

¹hnmr(400mhz，dmso)：δ11.92(s，1h)，8.70(d，j＝12.0hz，1h)，7.71(d，j＝8.0hz，1h)，7.46～7.59(m，6h)，7.29～7.37(m，2h)，6.27(d，j＝16.0hz，1h)，4.19(d，j＝8.0hz，2h)，1.72(s，6h)，1.36(t，j＝8.0hz，3h)。

¹³cnmr(100mhz，dmso)：δ12.34，28.10，50.06，91.33，112.11，118.68，123.1，126.5，129.06，130.3，138.79，141.5，141.6，152.18，177.73。

hrms计算值c20h23n2⁺i^-[m-i]＝291.1856实验值291.1869。

(5)4-(2-溴-乙酰)-哌嗪-1-乙酸-四丁基酯(化合物g-1)的合成

在25ml的烧杯中称取boc-哌嗪(化合物f-1，0.558g，3mmol)溶于10ml无水ch2cl2中，称无水na2co3(0.848g，8mmol)于7ml去离子水中，将二者倒入100ml单口瓶中，冰浴下搅拌20min，将溴乙酰溴(0.568ml，6.6mmol)溶于10ml无水ch2cl2中，快速滴入单口瓶中，滴加完毕后再加入dmap(36.7mg，0.3mmol)，继续搅拌，tlc跟踪至原料转化，转移到室温反应1h。用ch2cl2萃取(3×30ml)，合并有机层，无水na2so4干燥，柱层析分离(ch2cl2/meoh＝60:1，v/v)得到乳白色固体598mg(化合物g-1)，产率65％。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)：δ3.85(s，2h)，3.56(t，j＝8.0hz，2h)，3.47(d，j＝4.0hz，2h)，1.44(s，9h)。

¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δ25.62，28.35，41.93，46.55，80.45，154.45，165.42。

gc-ms：计算值c11h19brn2o3[m]＝306.0579，实验值[m]＝306.0。

(6)化合物h-1的合成：

在50ml单口瓶中加入化合物d-1(477mg，3mmol)，化合物g-1(1.38g，4.5mmol)，乙腈15ml，充氩气保护，加热回流，tlc跟踪至原料转化，减压旋转蒸发除去乙腈，剩余物用尽量少的ch2cl2溶解，加入大量乙醚，析出固体，将固体小心地吸出到锥形瓶中，一定要使固体表面依然有乙醚存在，立即用氩气将乙醚吹干，锥形瓶用封口膜封住隔绝空气保存。产物为粉红色固体700mg(化合物h-1)，产率50％。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)：δ7.53(s，4h)，6.37(s，2h)，3.45～3.89(m，8h)，2.98(s，3h)，1.65(s，6h)，1.47(s，9h)。

lcms计算值c22h32n3o3⁺br^-[m-br]＝386.2438实验值386.2。

(7)化合物i-1的合成：

在50ml单口烧瓶中依次加入化合物b-1(1.57g，3.76mmol)，化合物h-1(2.17g，4.67mmol)，醋酐8ml，吡啶8ml，氩气保护下加热回流，tlc跟踪至原料转化，旋转蒸发除去醋酐和吡啶，柱层析分离(ea，rf＝0.2)，得到红色屑状固体615mg(化合物i-1)，产率28％。

¹hnmr(400mhz，cd3od)：δ8.51(t，j＝4.0hz，1h)，7.54(t，j＝4.0hz，2h)，7.26～7.44(m，6h)，6.72(d，j＝16.0hz，1h)，6.60(d，j＝12.0hz，1h)，5.28(s，2h)，4.24(d，j＝8.0hz，2h)，3.76(d，j＝8.0hz，4h)，3.60(s，2h)，3.51(s，2h)，1.79(s，6h)，1.73(s，6h)，1.49(s，9h)，1.40(t，j＝8.0hz，3h)。

¹³cnmr(100mhz，cd3od)：δ11.68，26.84，27.20，27.32，39.31，41.86，44.66，45.69，49.20，49.36，80.30，102.85，103.00，110.68，111.09，122.00，122.26，124.99，125.59，128.39，128.67，140.27，141.09，141.44，142.65，151.08，154.83，163.88，174.62，175.76。

hrms计算值c36h47n4o3⁺[m⁺]＝583.3643，实验值[m⁺]＝583.3655。

(8)式i-1a所示化合物(化合物i-1a)的合成：

在50ml两口烧瓶中依次加入化合物i-1(500mg，0.7mmol)，无水ch2cl210ml，充氩气保护，将三氟乙酸的ch2cl2溶液(1:5，v/v)慢慢滴加如烧瓶中，tlc跟踪至原料转化，减压旋转蒸发，柱层析分离(ch2cl2/meoh＝20:1v/v)得到红色屑状产物300mg(化合物i-1a)，产率70％。

¹hnmr(400mhz，cd3od)：δ8.57(t，j＝12.0hz，1h)，7.56(d，j＝4.0hz，1h)，7.53(d，j＝8.0hz，1h)，7.46(t，j＝8.0hz，1h)，7.32～7.41(m，3h)，7.28(t，j＝8.0hz，2h)，5.27(s，2h)，4.25(q，j＝8.0hz，2h)，4.03(s，2h)，3.89(s，2h)，3.55(s，2h)，1.82(s，6h)，1.76(s，6h)，1.42(t，j＝8.0hz，3h)。

¹³cnmr(100mhz，cd3od)：δ11.50，26.74，38.73，39.21，41.72，42.79，43.01，45.27，49.19，49.43，102.63，102.90，110.60，111.11，121.95，122.22，125.01，125.69，128.36，128.68，140.22，141.12，141.40，142.57，151.20，163.98，174.89，175.82。

hrms计算值c31h39n4o⁺[m⁺]＝483.3118，实验值483.3138

(9)1-(ε-羧戊基)-2,3,3-三甲基吲哚(化合物k-1)的合成

称取6-溴己酸(4.85g，25mmol)，溶于10ml邻二氯苯中，加入化合物d-1(1.59g，10mmol)加热到110℃，氩气保护下反应，tlc跟踪至原料转化，冷却后，小心地倾倒出邻二氯苯，剩余物在红外烘箱中烘干，得到黑棕色产物1.3g(化合物k-1)，产率37％。

¹hnmr(400mhz，dmso)：δ12.04(s，1h)，8.01(d，j＝4.0hz，1h)，7.86(d，j＝4.0hz，2h)，4.48(t，j＝8.0hz，2h)，2.88(s，3h)，2.22(t，j＝8.0hz，2h)，1.84(t，j＝8.0hz，2h)，1.54(s，8h)，1.44(s，2h)。

¹³cnmr(100mhz，dmso)：δ14.73，22.49，24.50，25.86，27.43，33.86，47.99，54.64，116.02，124.02，129.39，129.83，141.51，142.33，174.79，197.00。

hrms计算值c17h24no2⁺br^-[m-br]＝274.1802，实验值274.1806。

(10)1-乙基-2-(δ-苯胺基)乙烯基-3,3-二甲基吲哚(化合物l-1)的合成：

在250ml单口瓶中依次加入化合物e-1(6.3g，20mmol)，β-苯胺基丙烯醛缩苯胺盐酸盐(5.69g，22mmol)，冰醋酸50ml，充氩气保护，加热回流，tlc跟踪至原料转化，减压旋转蒸发除去大部分冰醋酸，用ch2cl2萃取(3×100ml)，合并有机层，无水na2so4干燥，柱层析分离(ea，rf＝0.2)，得到黑绿色屑状固体1.678g(化合物l-1)，产率20％。

¹hnmr(400mhz，dmso)：δ12.24(s，1h)，8.87(d，j＝12.0hz，1h)，8.36(t，j＝12.0hz，1h)，7.62(d，j＝4.0hz，1h)，7.41～7.46(m，6h)，7.21～7.27(m，2h)，6.38～6.47(m，2h)，4.16(q，j＝8.0hz，2h)，1.67(s，6h)，1.27(t，j＝8.0hz，3h)。

¹³cnmr(100mhz，dmso)：δ12.85，27.58，49.47，101.50，111.46，117.88，122.96，125.29，125.73，128.91，130.18，140.25，141.57，141.88，156.16，157.89，174.11。

hrms计算值c22h25n2⁺i^-[m-i]＝317.2012实验值317.2017。

(11)1-(ε-羧戊基)-1’-乙基-3,3,3’3’-四甲基吲哚二碳菁(化合物m-1)的合成：

在100ml单口瓶中依次加入化合物l-1(1.005g，2.2mmol)，化合物k-1(1g，2.8mmol)，醋酐10ml，吡啶10ml，充氩气保护，加热回流，tlc跟踪至原料转化，减压旋转蒸发除去醋酐和吡啶，柱层析分离(ch2cl2/meoh＝30:1，v/v)得到蓝色屑状固体(化合物m-1)466mg，产率42％。

¹hnmr(400mhz，cd3od)：δ8.25(t，j＝16.0hz，2h)，7.49(dd，j1＝4.0hz，j2＝4.0hz，2h)，7.38～7.43(m，2h)，7.24～7.30(m，4h)，6.64(t，j＝12.0hz，1h)，6.30(dd，j1＝j2＝4.0hz，2h)，4.15(q，j＝8.0hz，2h)，4.10(t，j＝8.0hz，2h)，2.25(t，j＝4.0hz，2h)，1.83(t，j＝8.0hz，2h)，1.72(s，12h)，1.69(q，j＝8.0hz，2h)，1.49(t，j＝8.0hz，2h)，1.38(t，j＝4.0hz，3h)。

¹³cnmr(100mhz，cd3od)：δ11.28，25.06，26.55，26.65，26.86，35.28，38.66，43.52，49.16，102.72，163.01，110.43，110.87，122.03，122.08，124.81，124.86，125.37，128.36，128.39，141.29，141.42，141.69，142.16，154.05，154.15，172.87，731.21，178.75。

hrms计算值c33h40n2o2[m+h]＝497.3168实验值497.3179。

(12)目标化合物(化合物z-1)的合成

在100ml的三口瓶中依次加入化合物m-1(253mg，0.51mmol)，hbtu(580mg，1.53mmol)，无水dmf10ml，充氩气保护，冰浴下搅拌30min；称取化合物i-1a(467mg，0.77mmol)，溶在10ml无水dmf中，并于冰浴下滴加入三口瓶中；再称取dipea(0.18ml，1mmol)，溶在5ml无水dmf中，并于冰浴下滴加入三口瓶中。冰浴下搅拌6h后，撤去冰浴，室温25℃下搅拌过夜，tlc跟踪至原料转化，减压旋转蒸发除去大部分dmf，用ch2cl2萃取(3×40ml)，合并有机层，无水na2so4干燥，柱层析分离(ch2cl2/meoh＝100:1v/v)得到紫色固体(化合物z-1)200mg，产率35％，纯度(hplc)为99％。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)：δ8.42(t，j＝12.0hz，1h)，7.94(t，j＝12.0hz，2h)，7.34～7.39(m，8h)，7.05～7.27(m，8h)，6.30(s，2h)，4.11(q，j＝8.0hz，2h)，4.03(t，j＝8.0hz，2h)，3.63～3.80(m，8h)，2.45(q，j＝8.0hz，2h)，1.85(m，2h)，1.77(s，6h)，1.72(s，5h)，1.70(s，11h)，1.54(t，j＝8.0hz，2h)，1.40(q，j＝8.0hz，6h)。

¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δ175.62，174.01，173.03，172.60，171.63，163.04，153.39，153.32，151.15，142.46，141.97，141.58，141.47，141.40，141.27，140.83，139.89，129.04，128.96，128.72，128.65，125.87，125.68，125.27，125.19，122.36，122.29，121.89，110.98，110.87，110.71，110.38，103.86，103.79，103.47，103.35，103.10，49.43，49.40，49.28，49.24，45.31，44.86，44.55，44.08，42.15，40.93，39.52，39.15，32.79，32.53，29.69，28.27，27.91，27.86，27.75，27.71，26.51，24.86，24.71，12.43，12.25。

hrms计算值c64h78n6o22²⁺[m²⁺]＝962.6175，实验值[m/z]＝481.2429。

探针对活性氧的检测

实施例2

将探针pncy3cy5(化合物z-1)经过真空干燥及称量后，置于10ml容量瓶中，用n，n-二甲基甲酰胺定容，配成10^-3m溶液作为探针母液。配制成2μm的溶液后分别测定紫外吸收光谱和荧光发射光谱。具体结果见图1和图2。

实施例3

将化合物i-1(探针cy3boc)经过真空干燥及称量后，置于10ml容量瓶中，用n，n-二甲基甲酰胺定容，配成10^-3m溶液作为探针母液。配制成2μm的溶液后分别测定紫外吸收光谱和荧光发射光谱。具体结果见图3。

探针的fret性能

实施例4

本发明所述探针pncy3cy5中cy3和cy5之间的连接臂长度约为14埃，文献中报道的连接臂长度约为21埃(fu,n.；xiong,y.；squier,t.c.j.am.chem.soc.2012,134,18530；conley,n.r.；biteen,j.s.；moerner,w.e.thejournalofphysicalchemistryb2008,112,11878)。

相较于本发明所述的探针pncy3cy5而言，现有检测ros和rns的荧光探针，尤其是检测过氧亚硝酸根(oono^-)的探针大部分是基于单通道的，只依赖荧光强度的升高。而本发明所述探针pncy3cy5可以通过双通道方式检测过氧亚硝酸根(oono^-)，实现比率型的检测。