本发明涉及一种细胞活性素的制备方法，具体涉及一种胎皮肤培养细胞活性素的制备方法，并提供了该方法获得的细胞活性素的用途。
背景技术：
羊胎素是一个笼统的概念，一般来说包含了羊胎盘素(the Extract of Sheep’s Placental)和羊胚胎素(the Extract of Goat’s Embryo)两个不同的产品。
羊胎盘素(ESP)是经由羊胎盘提取出来的一种具有生物活性的物质，广泛应用于各种化妆品、药品及健康食品中。
羊胚胎素(EGE)则是存在于胎羊体内，经提取后也是广泛用于各种化妆品、药品及健康食品中。
1912年瑞士科学家卡尔教授首次发现羊胚胎细胞中有一种能使细胞恢复活力的物质，这种活性物质可以促使细胞分裂次数的增加，能迫使已衰退或老化的细胞重新活化或被淘汰，从而使机能衰退的器官恢复旺盛活力。卡尔教授因此而获得诺贝尔奖。该物质即为上所述的羊胚胎素。
1931年，瑞士保罗尼翰医生首次将从小羊胚胎中提取的一种活性物质注射到一名甲状旁腺受损的临危病人体内，并成功挽救了其生命，这就是羊胚胎素细胞活化疗法的最初起源，它的发现对人类在抗衰老领域的医学发展有着里程碑式的意义。亦即羊胚胎素的初次运用。
从羊胚胎中提取活性物质要比从胎盘中提取活性物质困难得多，也珍贵得多，活性物质的成分也大不相同。羊胚胎素能够激活人体老化细胞、促进细胞再生与分裂。
目前市场上羊胎素类产品主要来源于上述羊胎盘、羊胚胎两个方面，并以羊胎盘粉、羊胚胎粉、羊胎盘提取物冻干粉、羊胚胎提取物冻干粉等不同的形式用于保健品、护肤品、药品等领域。各种产品的生产方法五花八门，生产方法专利也很多，但这些方法大多不切合实际，不够科学严谨，难以正式生产形成生产力。并且目前羊胎提取物在针对皮肤上存在特异性不强、免疫原性高、生物活性差、效果不明显等缺点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：目前羊胎提取物在针对皮肤上存在特异性不强、免疫原性高、生物活性差、效果不明显等缺点。本发明的目的在于提供适用于工业化生产且针对皮肤修复效果佳的一种胎皮肤培养细胞活性素的制备方法，并提供了该方法获得的细胞活性素的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种胎皮肤培养细胞活性素的制备方法，包括：
步骤一、获取胎皮肤，胎皮肤经过清洗、消毒、预培养后获得全层细胞；
步骤二、采用细胞培养基对全层细胞进行原代培养，当全层细胞适应培育条件且细胞培养基中具有两种以上类别的细胞时，收集细胞上清液；
步骤三、将细胞上清液经过膜分离或/和层析分离，收集2KD～100KD的生物活性物质得到细胞活性素。
本发明中的胎皮肤是指胎羊、胎牛、胎鼠等处于胎期的动物的皮肤组织。
本发明中的细胞活性素只从与胎皮肤组织有最密切关系的多种皮肤细胞中培养和制备提取，与其他方法和细胞提取的活性素不同，本发明仅采用物理方法对细胞上清液进行纯化，全程没有有机试剂或者其他化学物质的介入，不但保持了提取物的纯净，且最大限度的保留了羊胎皮肤中的活性物质。
本发明的制备方法简便易操作，适于大规模生产制备细胞活性素；且本发明方法获得的细胞活性素能够更好地实现皮肤修复，安全、环保、低能耗，易于标准化、规模化生产。
本发明方法获得的细胞活性素中包含有成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、内皮细胞生长因子、神经细胞生长因子、胰岛素样成长因子、集落刺激因子、各型胶原蛋白、白细胞介素等。本发明的细胞活性素能更好地剌激外胚层和内胚层起源的各种细胞增殖迁移，加快皮肤细胞的新陈代谢，增加皮肤含水量，进而增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效。
进一步，所述步骤三中采用SephadexG-100分子筛层析柱，收集OD280nm吸收峰，获得精制的细胞活性素。
更进一步，所述全层细胞中包括成纤维细胞、表皮细胞、内皮细胞、神经细胞。
为了使获得的细胞活性素效果最佳，所述原代培养中收集细胞上清液的时间为培育的第5～45天。
最大限度的保留了羊胎皮肤中的活性物质，所述原代培养的培育条件为：37℃恒温培养，二氧化碳气体的体积分数为5％。所述步骤一中全层细胞的获取过程为：用含有青链霉素的清洗液冲洗胎皮肤一次以上，用消毒液浸泡消毒，将胎皮肤剪成小块后平铺于平皿中，向平皿中加入蛋白酶后在4℃条件下过夜培养，获得全层细胞。
优选地，所述清洗液为PBS、BSS、生理盐水或去离子水，消毒液为双氧水、70％乙醇水溶液或酒精。
本发明还公开了上述工艺制备的细胞活性素在制备化妆品中的应用。
该细胞活性素在制备化妆品中的应用为：将具有总重量2～90％的细胞活性素添加到化妆品基料中制成的化妆品。
进一步地，所述化妆品基料中含有胶原蛋白、透明质酸、γ-聚谷氨酸中的至少一种。本发明的细胞活性素中均为生物活性物质，不含有化工制造化妆品中含有的重金属等有毒有害物质，确保了产品的使用安全性，不会产生过敏反应。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明细胞活性素的生产方法，全程没有有机试剂或者其他化学物质的介入，不但保持了提取物的纯净，且最大限度的保留了羊胎皮肤中的活性物质；并且操作简便，生产技术要求不高，能够在生物技术生产车间大规模长时间开展生产过程，制造成本较低，且产品功效很好，具有很高的实用价值；
2、本发明制备的细胞活性素能更好地剌激外胚层和内胚层起源的各种细胞增殖迁移，加快皮肤细胞的新陈代谢，增加皮肤含水量，进而增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效；
3、本发明细胞活性素制成的化妆品中均为生物活性物质，不含有化工制造化妆品中含有的重金属等有毒有害物质，确保了产品的使用安全性，不会产生过敏反应。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种胎皮肤培养细胞活性素的制备方法，具体过程如下：
步骤一、获取胎羊皮肤组织，用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液冲胎羊皮肤组织3次，浸泡消毒，将皮肤组织剪成小块后平铺于平皿中，向平皿中加入蛋白酶过夜培养获得全层细胞，该蛋白酶为中性蛋白酶或胰蛋白酶；
该步骤中将皮肤组织剪成0.5～1mm3的小块；过夜培养的条件为4℃过夜培养；
步骤二、将过夜培养得到的全层细胞在培养皿中进行原代培养，原代培养过程中每三天清洗更换一次细胞培养基；原代培养的条件为：向培养皿中加入0.5ml细胞培养基于37℃恒温培养，二氧化碳气体的体积分数为5％；
本实施例中细胞培养基采用美国Life Technology公司的细胞培养基，该培养基缓冲体系为4-羟乙基哌嗪乙磺酸和重碳酸盐，该细胞培养基成分为：500ml基础培养基、10ml胎牛血清、5ml细胞生长添加物溶液。
由于不同细胞培养基会使不同细胞的适应期和存活期不同，本实施例中该全层细胞适应培育的时间是1～7天，原代培养的细胞培养基中具有两种以上类别的细胞时的时间为培育的1～25天，因而本实施例优选从第10天开始收集培养皿中的细胞上清液，连续收集10天后混合；
步骤三、将混合后的细胞上清液经过膜分离或者层析分离纯化，收集2KD～100KD的生物活性物质得到细胞活性素；该步骤制得细胞活性素再采用SephadexG-100分子筛层析柱，收集OD280nm吸收峰，获得精制的细胞活性素，经过检测，该细胞活性素的产率为0.1g/100g胎羊皮肤。
实施例2
本实施例的目的是提供一种实施例1中细胞活性素在化妆品中的应用方法，并公开了两种具有本发明细胞活性素的化妆品构成。下述组成均以重量份计。
其中一种化妆品的构成如下：
羊胎皮肤活性素4-6份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，透明质酸0.02-1份，水80-90份。
另一种化妆品的构成如下：
羊胎皮肤活性素4-6份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，胶原2-3份，水80-90份。
实施例3
本实施例是实施例1的对比实施例，本实施例中公开了两组对比例，其中对照例1是原代培育处于适应期时采集的细胞活性素，对照例2是原代培养液中仅仅只有一种或者两种活细胞类型时采集的细胞活性素。
即本实施例的对照例1是采用原代培育第1～10天的细胞上清液制成的细胞活性液制成细胞活性素，对照例2是采用原代培育第20～30天的细胞上清液制成的细胞活性液制成细胞活性素。
实施例4
本实施例是对样品进行表皮细胞增殖活性影响，以及对血管内皮细胞(HUVEC)增殖、贴壁和迁移影响的检测。本实施例中的样品包括实施例1和3制成的细胞活性素成品、表皮生长因子以及胶原蛋白。
一、表皮细胞增殖活性影响的检测
1.表皮细胞取材以及培养：
包皮环切术后标本，PBS洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25％trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000rpm×10min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37℃，5％CO2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80％时，根据需要传代或冻存细胞。
2.MTT法测定细胞的增殖：
取对数生长期细胞1.5×105接种于96孔培养板内，每孔100μl，设6个复孔。加各种测试样品及调零孔加100μl培养液，继续培养48h，结束前4h，加10μl MTT，常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490nm。按下列公式计算相对增殖率：RGR＝给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100％。
二、血管内皮细胞(HUVEC)增殖、贴壁和迁移影响的检测
1.HUVEC的细胞培养
HUVEC细胞经免疫荧光鉴定，eNOS和vWF均为阳性。实验所用细胞为第6-8代，所有培养瓶/板/皿预先用0.2％明胶包被。培养基为含20％胎牛血清、60mg/L内皮细胞生长添加剂和0.005U/L肝素的M199。将HUVEC置37℃、5％CO2培养箱内静置培养。
2.样品对HUVEC生长增殖的影响
将细胞接种于24孔板，待贴壁良好，生长至60％-70％饱和时，用无血清培养液处理24h，然后加入不同样品处理2d(对照组加入等量PBS)，胰酶消化，白细胞计数板计数细胞，观察样品对HUVEC增殖的影响。每组设3孔，重复3次。
同时采用[3H]胸腺嘧啶核苷掺入实验观察样品对HUVEC细胞DNA合成的影响。将4×104HUVEC细胞接种于24孔板，待到生长至60％-70％饱和时，加入不同样品处理细胞24h，对照组加入等量PBS。在实验结束前4h加入[3H]胸腺嘧啶核苷(3.7×103Bq/L)，[3H]胸腺嘧啶核苷将掺入到新合成的DNA中。实验结束时用冷PBS漂洗细胞3次，加入0.5mL10％三氯醋酸，4℃处理2h，95％乙醇漂洗1次，加入0.2mol/L NaOH室温裂解细胞，收集细胞，加入至7mL闪烁液，混匀，液体闪烁计数仪上测定[3H]放射强度(counts/min)，计算抑制率。每组设3孔，重复3次。
3.样品对HUVEC贴壁的影响
样品处理HUVEC 2d(对照组加入等量PBS)后，用胰酶消化细胞，计数细胞。将等量的细胞(1×105)接种于纤连蛋白(Sigma)包被过的35mm的培养皿，培养30min后，将未贴壁的细胞用PBS洗去，用3.7％的多聚甲醛固定40min，然后用0.1％结晶紫染色40min，10％醋酸脱色，570nm比色，观察样品对HUVEC贴壁的影响。本实验独立进行3次。
4.样品对HUVEC迁移的影响
根据文献，通过划伤实验观察样品对内皮迁移的影响。将等量HUVEC种至35mmol/L的培养皿，培养至90％饱和。加入不同浓度样品处理HUVEC2d。用1mL的加样吸头在培养皿中间分别划伤2道伤口，PBS冲洗2遍，加入新鲜培养液及样品，拍照计算迁移前的划痕距离。继续培养，于划伤后20h分别拍照，计算机软件沿细胞边缘划2条曲线，计算2条曲线之间的平均距离，然后计算相对迁移率:相对迁移率＝(初始宽度-20h的平均距离)/初始宽度×100％，观察样品对HUVEC迁移的影响。本实验独立进行3次。
本实施例中的样品对表皮细胞增殖活性影响，以及对血管内皮细胞(HUVEC)增殖、贴壁和迁移影响的检测结果如表1所示。
表1
对照组是不添加样品时的对照实例，通过表1中的数据可知：本发明方法获得的细胞活性素的效果与单一活性分子相比，其效果更加优秀。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。