高效CIK细胞制备及检测方法与流程

本发明涉及一种CIK细胞制备方法，特别是涉及一种高效CIK细胞制备及检测方法。

发明背景

过继性免疫治疗已经成为继手术、放疗和化疗等三大传统治疗方法后的第四种治疗方法，特别是细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)，因其具有增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高、对正常骨髓造血前体细胞毒性小、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、可与传统治疗手段相结合等特点而得到广泛认可，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞。

CIK细胞在正常外周血中极其少见，仅为1％～5％。CIK细胞制备技术的发现使其应用于临床成为可能。CIK细胞最早由美国科学家于20世纪九十年代首次报道，他们发现通过多种细胞因子(IFN-γ、CD3单克隆抗体、IL-2和IL-1)的共同刺激，外周血单个核细胞可以被诱导出大量具有肿瘤杀伤活性的细胞。因该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，所以其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性又具有自然杀伤细胞的非MHC限制性的双重特性。该制备方法作为传统的CIK细胞制备方法沿用至今，但获得的CIK细胞在细胞毒活性和增殖倍数等方面并不是很理想。随着科技的进步，无血清培养技术的应用以及新的细胞生长刺激物的发现等为CIK细胞制备方法提供了改进空间。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种高效CIK细胞制备方法，本发明的目的还在于提供该方法制备的CIK细胞检测方法。本发明的目的旨在针对传统方法所得CIK细胞存在增殖倍数低、CD3+CD56+双阳表达率不高、制备工艺不稳定等问题，对传统的CIK细胞制备方法进行了改进。

为实现上述目的，本发明高效CIK细胞制备方法包括如下步骤：

(1)全血检验与血样保存：用移液管将原血从采血管中转移至离心管中，反复吹打混匀后：取出血样用于微生物检测、取血样于冻存管中冷藏保存，作为档案以备后续检验；

(2)血浆处理：将盛有原血的离心管放入离心机中，配平后离心，将上层血浆转移到离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活，灭活后离心弃沉淀，留上清保存待用；

(3)分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀得稀释血样；用移液管把稀释血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子离心；稀释血样要加到FicoLL的上层，切勿打破分界面；

将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将生理盐水血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀得单核细胞稀释液；

(4)单核细胞洗涤：将上步收集好的单核细胞稀释液进行离心弃上清液；再重复加生理盐水混合均匀离心弃上清液多次，最后收集得到的沉淀即为单核细胞；

(5)单核细胞培养。具有避免了外源潜在的病源微生物的感染，制备工艺稳定，操作简单；明显提高CIK细胞增殖倍数和细胞毒活性的优点。

作为优化，单核细胞培养是：

Day0+因子1：用无血清培养基重悬(4)步单核细胞，加入IFN-γ因子1得细胞悬液，将细胞悬液转移到培养瓶中，旋紧透气瓶盖，置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行细胞培养；

Day1+因子2：培养后，加入含CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α的因子2置于培养箱中进行细胞培养；并根据需要扩增培养，以后扩增细胞加入培养基时，在新鲜的培养基中加入IL-2的量要加倍；

Day3+50：上步细胞培养三天后，在显微镜下观察到：细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色时，加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基以满足细胞生长的需要；

Day5+100：随着细胞进入快速增殖期，生长迅速，需要每日显微镜下对细胞进行观察，观察指标同上步Day3，并补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基；

Day7BC(Bag CuLtivation)：显微镜下观察细胞状态，观察指标同上步Day5；在生物安全柜中用移液管反复吹打混匀细胞，取出细胞悬液样于离心管中，用赤藓红染色计算细胞密度，当细胞密度达到要求时，通过注射器连接细胞培养袋，将细胞培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶，将洗涤培养基合并至细胞培养袋中；

Day10+600：间隔四天后，培养基颜色明显变黄，细胞数量明显增多，补加新鲜培养基，操作同上步day7BC；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)：细胞收获前两天，对培养体系做微生物检测；

Day14H(Harvest)：

1)从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中离心弃上清液，用涡旋振荡器振散细胞团块；

2)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，依此操作将离心管合并为至少两个，离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

3)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，吸取细胞样本于离心管中进行细胞计数，向合并多次洗得细胞悬液中加入生理盐水离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

4)加入生理盐水并混匀，加入人血白蛋白混匀得细胞悬液；取出细胞悬液样品进行内毒素及微生物检测，并留样冻于冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后转入细胞转移袋中封口，待检测合格即为制成。

作为优化，

Day0+因子1步：细胞接种浓度为1-3×10⁶/mL，IFN-γ工作浓度为500-1000U/mL；

Day1+因子2步：CD3McAb工作浓度为50-100ng/mL、CD28McAb工作浓度为50-100ng/mL、IL-2工作浓度为500-1000U/mL，IL-1α工作浓度为500-1000U/mL；以后扩增细胞加入培养基时，要在新鲜的培养基中按1000-2000U/mL加入IL-2；

Day7BC(Bag CuLtivation)步；细胞密度达到的要求为细胞密度达到1.0×10⁶；

Day14H(Harvest)步；4)加入适量人血白蛋白的终浓度为1％)。

作为优化，

Day0+因子1步；重悬细胞的无血清培养基是50mL，培养瓶为T175培养瓶；

Day1+因子2步；培养后是培养24h后；

Day3+50步：加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基后，体积定量为50mL；

Day5+100步：补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基，体积定量为100mL；

Day7BC(Bag CuLtivation)步：反复吹打用的移液管为10mL移液管，取出细胞悬液样于离心管中是取出约0.5mL细胞悬液于1.5mL离心管中，连接细胞培养袋的注射器是60mL注射器，细胞培养瓶是T175细胞培养瓶，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶是用400mL新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分2次洗涤T175培养瓶；

Day10+600步：补加新鲜培养基是补加600mL新鲜培养基；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)步：对培养体系做微生物检测是将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用5mL注射器抽取约1mL细胞样本，做微生物检测；

Day14H(Harvest)步：

1)步：离心管为250mL离心管，离心是2000rpm离心5min；

2)步：用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次是用已加入适量人血白蛋白的25mL×3次生理盐水洗离心管，将离心管合并为至少两个离心弃上清是，将四个离心管并为两个，2000rpm离心5min，弃上清；

3)步：用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次是用已加入适量人血白蛋白的25mL×2次生理盐水洗离心管，吸取细胞样本于离心管中是吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，加入生理盐水离心弃上清是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min，弃上清；

4)步：加入生理盐水并混匀是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入人血白蛋白是加入适量人血白蛋白使人血白蛋白终浓度为1％，取出细胞悬液样品是取出约1.5mL细胞样品，留样冻于冰箱是留样冻于-80℃冰箱，过细胞筛后转入细胞转移袋是过细胞筛后，通过60mL注射器连接100mL细胞转移袋；所述细胞筛是100μm细胞筛。

作为优化，(1)全血检验与血样保存步：采血前，先根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量mL＝80/淋巴细胞绝对值，将采血管用75％酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀，开启采血管；用移液管将原血从采血管中转移至离心管中是用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中；取出血样用于微生物检测、取血样于冻存管中冷藏保存是取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱。

作为优化，(2)血浆处理步：盛有血液的离心管是盛有血液的250mL离心管；配平后离心是配平后，2500rpm升10降10离心10min；灭活是灭活30min；灭活后离心是灭活后，3000rpm离心10min；留上清FicoLL保存待用是留上清FicoLL，将处理好的血浆置于4℃保存待用。

作为优化，(3)分离单核细胞步：盛有FicoLL的离心管是分别加入15mLFicoLL的离心管，每个离心管加入稀释血样的量为30mL，离心是2000rpm升7降4离心20min；

4)单核细胞洗涤步：将上步收集好的单核细胞稀释液进行离心弃上清液是将上述收集好的细胞稀释液进行离心，1600rpm离心10min，弃上清液；混合均匀离心是混合均匀，1200rpm离心8min。

作为优化，(3)分离单核细胞步：用移液管小心将生理盐水血浆层尽量吸弃干净是用10mL移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，吸取转移到若干离心管中是吸取转移到若干50mL离心管中，添加生理盐水是等体积添加生理盐水；

(4)单核细胞洗涤步：再重复加生理盐水混合均匀离心弃上清液多次，最后收集得到的沉淀即为单核细胞是用生理盐水定容到45mL，混合均匀，1200rpm离心8min；重复洗涤细胞1次，离心前吸取约0.5mL样本，赤藓红染色计数，最后收集得到的沉淀即为单核细胞。

更具体包括如下步骤：

(1)全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量(mL)＝80/淋巴细胞绝对值。将采血管用75％酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀。开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。

(2)血浆处理：将盛有血液的250mL离心管放入离心机中，配平后，2500rpm离心10min(升10降10)。离完心将上层血浆转移到50mL离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活30min，灭活后，3000rpm离心10min，弃沉淀，留上清。将处理好的血浆置于4℃保存待用。

(3)分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的50mL离心管的个数，离心管中分别加入15mLFicoLL；用25mL移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，每管加入30mL血液，旋紧盖子，2000rpm离心20min(升7降4)。注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。

将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层。用10mL移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干50mL离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。

(4)单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，1600rpm离心10min，弃上清；用生理盐水定容到45mL，混合均匀，1200rpm离心8min；重复洗涤细胞1次，离心前吸取约0.5mL样本，赤藓红染色计数。最后收集得到的沉淀即为单核细胞。

(5)单核细胞培养：

Day0+因子1：用50mL无血清培养基重悬细胞，一般情况下细胞接种浓度为1-3×10⁶/mL。向离心管中加入因子1(IFN-γ工作浓度为500-1000U/mL)，将细胞悬液转移到T175的培养瓶中，旋紧瓶盖(透气盖)，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

Day1+因子2：培养24h后，加入因子2(由CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α等配制而成，CD3McAb工作浓度为50-100ng/mL、CD28McAb工作浓度为50-100ng/mL、IL-2工作浓度为500-1000U/mL，IL-1α工作浓度为500-1000U/mL)。以后扩增细胞加入培养基时，要在新鲜的培养基中按1000-2000U/mL加入IL-2。

Day3+50：细胞培养三天后，在显微镜下观察细胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化(体积、形状等)、数量(集落)变化、培养基颜色变化等；一般情况下细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色，因为随着细胞数量的增多，其代谢产物也会增多，会导致培养体系PH的变化而引起培养基颜色改变，这种情况下，要给培养体系加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基以满足细胞生长的需要，体积定量为50mL。

Day5+100：随着细胞进入快速增殖期，生长迅速，需要每日对细胞进行观察，观察指标同Day3，并补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基，体积定量为100mL

Day7BC(Bag CuLtivation)：显微镜下观察细胞状态，观察指标同Day5；在生物安全柜中用10mL移液管反复吹打混匀细胞，取出约0.5mL细胞悬液于1.5mL离心管中，用赤藓红染色计算细胞密度，当细胞密度达到1.0×10⁶时，通过60mL注射器连接细胞培养袋，将T175细胞培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，用400mL新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分2次洗涤T175培养瓶，将洗涤培养基合并至细胞培养袋中

Day10+600：间隔四天后，一般情况下培养基颜色明显变黄，细胞数量明显增多，补加600mL新鲜培养基，操作同day7BC。

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)：细胞收获前两天，要对培养体系做微生物检测。将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用5mL注射器抽取约1mL细胞样本，做微生物检测

Day14H(Harvest)：

1)从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干250mL离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

2)用25mL×3次生理盐水(已加入适量人血白蛋白)洗离心管，细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；依此操作，将四个离心管并为两个，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

3)用50mL×2次生理盐水(已加入适量人血白蛋白)洗离心管，合并细胞悬液，共100mL，吸取约0.5mL细胞样本于1.，5mL离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

4)加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白(终浓度为1％)；取出约1.5mL细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过100μm的细胞筛后，通过60mL注射器连接100mL细胞转移袋，将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂检测。

本发明制备方法制取的单核细胞检测方法包括：

(1)细胞数量与活性检测：将Day14-4)步中制取的细胞样本混匀，取细胞悬液用赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求3-6×10⁹，细胞活性要求≥95％；

(2)细胞无菌检测：将Day14-4)步中制取的细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，两日后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性；

除此之外，还对全血、第一次细胞接种、Day7BC及Day710+600步、细胞收获前两天Day12MT、出厂时分别做一次血平板检测，用这两种方法监控细胞有无细菌污染；

(3)支原体检测：用支原体检测试剂盒进行检测；

(4)内毒素检测：用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，内毒素标准≤0.25EU；

(5)细胞表型检测：根据每种抗体1x 10⁶个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

作为优化，(1)细胞数量与活性检测中：取细胞悬液用赤藓红染色是取20μL细胞悬液用20μL赤藓红染色；

(2)细胞无菌检测中：两日后观察结果是48-72h后观察结果；

(3)支原体检测：用支原体检测试剂盒进行检测是将Day12MT步中制取的细胞样本混匀，取适量用于支原体检测；

(4)内毒素检测步骤如下：

1)标准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；

2)鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14-4)步中制取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1mLBET水；

3)放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格；

(5)细胞表型检测：去除未标记的抗体是在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体。

更具体是：

(1)细胞数量与活性检测：将Day14-4操作中取的细胞样本混匀，取20μL细胞悬液用20μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求3-6×10⁹，细胞活性要求≥95％。

(2)细胞无菌检测：将Day14-4操作中取的细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。

除此之外，还需要对全血、第一次细胞接种、BC及+600操作、细胞收获前两天(Day12MT)、出厂时分别做一次血平板检测。用这两种方法可以监控细胞有无细菌污染。

(3)支原体检测：支原体个体小，较一般细菌更难检测，本公司用支原体检测试剂盒进行检测。方法是将Day12MT操作中取的细胞样本混匀，取适量用于支原体检测。

(4)内毒素检测：用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测。内毒素标准≤0.25EU。操作如下：

1)标准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；

2)鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14-4操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1mLBET水。

3)放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。

(5)细胞表型检测：根据每种抗体1x 10⁶个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

该方法采血量少，不使用单采机，对患者免疫系统没有破化；全程采用无血清培养，避免了外源潜在的病源微生物的感染；制备工艺稳定，操作简单；明显提高CIK细胞增殖倍数和细胞毒活性，扩增细胞倍数达200-1000倍以上，CD3+CD56+双阳表达率≥30％。

本发明是：根据淋巴细胞绝对值计算采血量(采血量＝80/淋巴细胞绝对值)，无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水等倍稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞；在CIK细胞诱导过程中，先后加入因子1(IFN-γ)和因子2(CD3mAb、CD28mAb、IL-2及IL-1α)，经过2-3周的无血清培养收获细胞，制成CIK细胞制剂。

采用上述技术方案后，本发明高效CIK细胞制备及检测方法具有避免了外源潜在的病源微生物的感染，制备工艺稳定，操作简单；明显提高CIK细胞增殖倍数和细胞毒活性的优点。

附图说明

图1是本发明高效CIK细胞制备及检测方法的CIK细胞原代分离培养流程示意图；

图2是本发明高效CIK细胞制备及检测方法的CIK细胞收获操作流程示意图。

具体实施方式

本发明高效CIK细胞制备方法包括如下步骤：

(1)全血检验与血样保存：用移液管将原血从采血管中转移至离心管中，反复吹打混匀后：取出血样用于微生物检测、取血样于冻存管中冷藏保存，作为档案以备后续检验；

(2)血浆处理：将盛有原血的离心管放入离心机中，配平后离心，将上层血浆转移到离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活，灭活后离心弃沉淀，留上清FicoLL保存待用；

(3)分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀得稀释血样；用移液管把稀释血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子离心；稀释血样要加到FicoLL的上层，切勿打破分界面；

将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将生理盐水血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀得单核细胞稀释液；

(4)单核细胞洗涤：将上步收集好的单核细胞稀释液进行离心弃上清液；再重复加生理盐水混合均匀离心弃上清液多次，最后收集得到的沉淀即为单核细胞；

(5)单核细胞培养。

具体：单核细胞培养是：

Day0+因子1：用无血清培养基重悬(4)步单核细胞，加入IFN-γ因子1得细胞悬液，将细胞悬液转移到培养瓶中，旋紧透气瓶盖，置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行细胞培养；

Day1+因子2：培养后，加入含CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α的因子2置于培养箱中进行细胞培养；并根据需要扩增培养，以后扩增细胞加入培养基时，在新鲜的培养基中加入IL-2的量要加倍；

Day3+50：上步细胞培养三天后，在显微镜下观察到：细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色时，加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基以满足细胞生长的需要；

Day5+100：随着细胞进入快速增殖期，生长迅速，需要每日显微镜下对细胞进行观察，观察指标同上步Day3，并补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基；

Day7BC(Bag CuLtivation)：显微镜下观察细胞状态，观察指标同上步Day5；在生物安全柜中用移液管反复吹打混匀细胞，取出细胞悬液样于离心管中，用赤藓红染色计算细胞密度，当细胞密度达到要求时，通过注射器连接细胞培养袋，将细胞培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶，将洗涤培养基合并至细胞培养袋中；

Day10+600：间隔四天后，培养基颜色明显变黄，细胞数量明显增多，补加新鲜培养基，操作同上步day7BC；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)：细胞收获前两天，对培养体系做微生物检测；

Day14H(Harvest)：

1)从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中离心弃上清液，用涡旋振荡器振散细胞团块；

2)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，依此操作将离心管合并为至少两个，离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

3)用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次，多次洗得细胞悬液并入另一离心管中，吸取细胞样本于离心管中进行细胞计数，向合并多次洗得细胞悬液中加入生理盐水离心弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

4)加入生理盐水并混匀，加入人血白蛋白混匀得细胞悬液；取出细胞悬液样品进行内毒素及微生物检测，并留样冻于冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后转入细胞转移袋中封口，待检测合格即为制成。

更具体：

Day0+因子1步：细胞接种浓度为1-3×10⁶/mL，IFN-γ工作浓度为500-1000U/mL；

Day1+因子2步：CD3McAb工作浓度为50-100ng/mL、CD28McAb工作浓度为50-100ng/mL、IL-2工作浓度为500-1000U/mL，IL-1α工作浓度为500-1000U/mL；以后扩增细胞加入培养基时，要在新鲜的培养基中按1000-2000U/mL加入IL-2；

Day7BC(Bag CuLtivation)步0细胞密度达到的要求为细胞密度达到1.0×10⁶；

Day14H(Harvest)步：4)加入适量人血白蛋白的终浓度为1％)。

更具体：

Day0+因子1步：重悬细胞的无血清培养基是50mL，培养瓶为T175培养瓶；

Day1+因子2步：培养后是培养24h后；

Day3+50步：加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基后，体积定量为50mL；

Day5+100步：补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基，体积定量为100mL；

Day7BC(Bag CuLtivation)步：反复吹打用的移液管为10mL移液管，取出细胞悬液样于离心管中是取出约0.5mL细胞悬液于1.5mL离心管中，连接细胞培养袋的注射器是60mL注射器，细胞培养瓶是T175细胞培养瓶，用新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分多次洗涤培养瓶是用400mL新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分2次洗涤T175培养瓶；

Day10+600步：补加新鲜培养基是补加600mL新鲜培养基；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)步：对培养体系做微生物检测是将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用5mL注射器抽取约1mL细胞样本，做微生物检测；

Day14H(Harvest)步：

1)步：离心管为250mL离心管，离心是2000rpm离心5min；

2)步：用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次是用已加入适量人血白蛋白的25mL×3次生理盐水洗离心管，将离心管合并为至少两个离心弃上清是，将四个离心管并为两个，2000rpm离心5min，弃上清；

5)步：用加入人血白蛋白的生理盐水洗离心管多次是用已加入适量人血白蛋白的25mL×2次生理盐水洗离心管，吸取细胞样本于离心管中是吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，加入生理盐水离心弃上清是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min，弃上清；

6)步：加入生理盐水并混匀是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入人血白蛋白是加入适量人血白蛋白使人血白蛋白终浓度为1％，取出细胞悬液样品是取出约1.5mL细胞样品，留样冻于冰箱是留样冻于-80℃冰箱，过细胞筛后转入细胞转移袋是过细胞筛后，通过60mL注射器连接100mL细胞转移袋；所述细胞筛是100μm细胞筛。

具体：(1)全血检验与血样保存步：采血前，先根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量mL＝80/淋巴细胞绝对值，将采血管用75％酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀，开启采血管；用移液管将原血从采血管中转移至离心管中是用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中；取出血样用于微生物检测、取血样于冻存管中冷藏保存是取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱。

具体：(2)血浆处理步：盛有血液的离心管是盛有血液的250mL离心管；配平后离心是配平后，2500rpm升10降10离心10min；灭活是灭活30min；灭活后离心是灭活后，3000rpm离心10min；留上清FicoLL保存待用是留上清FicoLL，将处理好的血浆置于4℃保存待用。

具体：(3)分离单核细胞步：盛有FicoLL的离心管是分别加入15mLFicoLL的离心管，每个离心管加入稀释血样的量为30mL，离心是2000rpm升7降4离心20min；

4)单核细胞洗涤步：将上步收集好的单核细胞稀释液进行离心弃上清液是将上述收集好的细胞稀释液进行离心，1600rpm离心10min，弃上清液；混合均匀离心是混合均匀，1200rpm离心8min。

具体：(3)分离单核细胞步：用移液管小心将生理盐水血浆层尽量吸弃干净是用10mL移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，吸取转移到若干离心管中是吸取转移到若干50mL离心管中，添加生理盐水是等体积添加生理盐水；

具体：(4)单核细胞洗涤步：再重复加生理盐水混合均匀离心弃上清液多次，最后收集得到的沉淀即为单核细胞是用生理盐水定容到45mL，混合均匀，1200rpm离心8min；重复洗涤细胞1次，离心前吸取约0.5mL样本，赤藓红染色计数，最后收集得到的沉淀即为单核细胞。

本发明制备方法制取的单核细胞检测方法包括：

(1)细胞数量与活性检测：将Day14-4)步中制取的细胞样本混匀，取细胞悬液用赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求3-6×10⁹，细胞活性要求≥95％；

(2)细胞无菌检测：将Day14-4)步中制取的细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，两日后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性；

除此之外，还对全血、第一次细胞接种、Day7BC及Day710+600步、细胞收获前两天Day12MT、出厂时分别做一次血平板检测，用这两种方法监控细胞有无细菌污染；

(4)支原体检测：用支原体检测试剂盒进行检测；

(4)内毒素检测：用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，内毒素标准≤0.25EU；

(5)细胞表型检测：根据每种抗体1x 10⁶个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

具体：

(1)细胞数量与活性检测中：取细胞悬液用赤藓红染色是取20μL细胞悬液用20μL赤藓红染色；

(2)细胞无菌检测中：两日后观察结果是48-72h后观察结果；

(3)支原体检测：用支原体检测试剂盒进行检测是将Day12MT步中制取的细胞样本混匀，取适量用于支原体检测；

(4)内毒素检测步骤如下：

1)标准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；

2)鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14-4)步中制取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1mLBET水；

3)放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格；

(5)细胞表型检测：去除未标记的抗体是在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体。

更具体如下：

本发明高效CIK细胞制备及检测方法实施例一：

中卫华医(北京)生物科技有限公司高效CIK细胞制备及检测SOP

一、目的：1、规定了本公司高效CIK细胞制备的标准操作规程。2、规范高效CIK细胞质量检测的操作，避免人为错误。

二、范围：中卫华医细胞医学中心实验室。

三、权责：QA主管负责文件审核并将文交由质量部经理负责批准，QC负责对本操作规程进行实施。

四、主要仪器、试剂与耗材：

1主要仪器：

2主要试剂：人淋巴细胞分离液、注射用生理盐水、淋巴细胞无血清培养基(Corning88-581-CM)、注射用IFN-γ、IL-2、IL-1α、CD3McAb、CD28McAb、人血白蛋白、赤藓红染色剂、鲎试剂检测试剂盒、支原体检测试剂盒、硫乙醇酸盐流体培养基、大豆酪蛋白流体培养基、APC-CD56、PE-CD8、PerCP-CD3。

3耗材：5mL注射器、50mL注射器、T175细胞培养瓶、50mL离心管、250mL离心管、10mL移液管、25mL移液管、肝素抗凝管、细胞转移袋、细胞培养袋、100μm细胞筛网、灭菌进口1000μL枪头、封口膜、

五.操作内容：

1.生产前准备：洁净室通风循环系统正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌。水浴锅打开设置工作温度为56℃。将FicoLL1.077g/mL淋巴细胞分离液、无血清培养基KBM 581以及IFN-γ置于冰箱外部恢复室温。

2.人外周血单核细胞分离：

2.1分离前准备：在操作中，所需物品都需要用75％酒精消毒后才能放入生物安全柜。物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出。废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置。操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方。

2.2全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量mL＝80/淋巴细胞绝对值。将采血管用75％酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀。开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。

2.3血浆处理：将盛有血液的250mL离心管放入离心机中，配平后，2500rpm离心10min，升10降10。离完心将上层血浆转移到50mL离心管中，盖紧盖子，贴封口膜，置于56℃水浴锅中灭活30min，灭活后，3000rpm离心10min，弃沉淀，留上清。将处理好的血浆置于4℃保存待用。

2.4分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的50mL离心管的个数，离心管中分别加入15mLFicoLL；用25mL移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，每管加入30mL血液，旋紧盖子，2000rpm离心20min，升7降4。注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。

将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层。用10mL移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干50mL离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。

2.5单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，1600rpm离心10min，弃上清；用生理盐水定容到45mL，混合均匀，1200rpm离心8min；重复洗涤细胞1次，离心前吸取约0.5mL样本，赤藓红染色计数。最后收集得到的沉淀即为单核细胞。

3.单核细胞培养：

Day0+因子1：用50mL无血清培养基重悬细胞，一般情况下细胞接种浓度为1-3×10⁶/mL。向离心管中加入因子1，IFN-γ工作浓度为500-1000U/mL，将细胞悬液转移到T175的培养瓶中，旋紧瓶盖(透气盖)，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

Day1+因子2：培养24h后，加入因子2：由CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α等配制而成，CD3McAb工作浓度为50-100ng/mL、CD28McAb工作浓度为50-100ng/mL、IL-2工作浓度为500-1000U/mL，IL-1α工作浓度为500-1000U/mL。以后扩增细胞加入培养基时，要在新鲜的培养基中按1000-2000U/mL加入IL-2。

Day3+50：细胞培养三天后，在显微镜下观察细胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化：体积、形状等、数量或集落变化、培养基颜色变化等；一般情况下细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色，因为随着细胞数量的增多，其代谢产物也会增多，会导致培养体系PH的变化而引起培养基颜色改变，这种情况下，要给培养体系加入新鲜的已加入IL-2的无血清培养基以满足细胞生长的需要，体积定量为50mL。

Day5+100：随着细胞进入快速增殖期，生长迅速，需要每日对细胞进行观察，观察指标同Day3，并补加新鲜已加入IL-2的无血清培养基，体积定量为100mL

Day7BC即Bag CuLtivation：显微镜下观察细胞状态，观察指标同Day5；在生物安全柜中用10mL移液管反复吹打混匀细胞，取出约0.5mL细胞悬液于1.5mL离心管中，用赤藓红染色计算细胞密度，当细胞密度达到1.0×10⁶时，通过60mL注射器连接细胞培养袋，将T175细胞培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，用400mL新鲜的已加入IL-2的无血清培养基分2次洗涤T175培养瓶，将洗涤培养基合并至细胞培养袋中。

Day10+600：间隔四天后，一般情况下培养基颜色明显变黄，细胞数量明显增多，补加600mL新鲜培养基，操作同day7BC。

Day12MT即MicrobioLogicaL Tests：细胞收获前两天，要对培养体系做微生物检测。将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用5mL注射器抽取约1mL细胞样本，做微生物检测。

Day14H即Harvest：

1)从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干250mL离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

2)用25mL×3次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；依此操作，将四个离心管并为两个，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

3)用50mL×2次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，合并细胞悬液，共100mL，吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；

4)加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白使终浓度为1％；取出约1.5mL细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过100μm的细胞筛后，通过60mL注射器连接100mL细胞转移袋，将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂检测。

4.细胞检测：

4.1细胞数量与活性检测：将Day14-4)操作中取的细胞样本混匀，取20μL细胞悬液用20μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求3-6×10⁹，细胞活性要求≥95％。

4.2细胞无菌检测：将Day14-4)操作中取的细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。

除此之外，还需要对全血、第一次细胞接种、BC及+600操作、细胞收获前两天即Day12MT时和出厂时分别做一次血平板检测。用这两种方法可以监控细胞有无细菌污染。

4.3支原体检测：支原体个体小，较一般细菌更难检测，本公司用支原体检测试剂盒进行检测。方法是将Day12MT操作中取的细胞样本混匀，取适量用于支原体检测。

4.4内毒素检测：本公司用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测。内毒素标准≤0.25EU。操作如下：

准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用。

鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14-4)操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1mLBET水。

放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。

4.5细胞表型检测：

根据每种抗体1x 10⁶个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

实施例二，本发明高效CIK细胞制备及检测方法与上述实施例一的区别仅在于：4.1细胞数量与活性检测中：细胞数量要求3-4×10⁹；4.2细胞无菌检测中：48h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。4.5细胞表型检测中：生理盐水清洗1次。

实施例二，本发明高效CIK细胞制备及检测方法与上述实施例一的区别仅在于：4.1细胞数量与活性检测中：细胞数量要求5-6×10⁹；4.2细胞无菌检测中：72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。生理盐水清洗2次。

以上实例，还可进一步参见后附的CIK细胞制备流程表。

本发明是根据淋巴细胞绝对值计算采血量，无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞；在CIK细胞诱导过程中，先后加入因子1和因子2，经过2-3周的无血清培养收获细胞，制成CIK细胞制剂。具有制备工艺稳定，操作简单，明显提高CIK细胞增殖倍数和细胞活性的优点。附CIK细胞制备流程表如下：