本发明涉及一种蛋白提取方法，确切来讲本发明涉及一种牛支原体生物被膜总蛋白的提取方法。
背景技术：
当前，生命科学的研究已经进入后基因组时代，蛋白组学已成为后基因组时代研究生物体的前沿和研究热点。双向电泳是最经典的蛋白组学技术。通过双向电泳，将蛋白质样本（包括微生物菌体、细胞、组织等）根据等电点和分子量大小分离，然后对分离蛋白进行质谱鉴定，应用生物信息学技术对数据进行分析，得到样本所含多种蛋白质的定性和定量信息。在双向电泳技术中，蛋白质的的提取制备至关重要，蛋白质的提取制备质量的好坏，直接影响双向电泳效果和后续质谱鉴定。目前尚无一个总蛋白提取通用的方法。在支原体蛋白组学的研究中，由于样本种类和生长状态的不同，蛋白的提取方法各异，效果也差别很大。高质量的支原体蛋白提取方法，成为支原体双向电泳中的关键步骤。生物被膜（biofilm, BF）是微生物分泌出多种多糖蛋白复合物将微生物包裹其中而形成的微菌落（Sauer K. The genomics and proteomics of biofilm formation. Genome Biol. 2003, 4(6):219.）。生物被膜状态下的支原体具有和浮游状态下的支原体完全不同的结构、生长和代谢等特点。目前研究发现，多种支原体包括牛支原体都能形成生物被膜，不同菌株间形成生物被膜能力存在较大差异（McAuliffe L, Ellis RJ, Miles K, Ayling RD, Nicholas RA. Biofilm formation by mycoplasma species and its role in environmental persistence and survival. Microbiology. 2006, 152(Pt 4):913-922.）。处于生物被膜状态下的支原体菌体由于多糖蛋白复合物包裹，此外，菌液含有脂类等代谢产物，这些因素会影响双向电泳的效果，进而影响后续质谱鉴定。
目前，关于支原体生物被膜蛋白组学的研究极少报道。一方面是由于支原体形成的生物被膜含量较一般细菌而言要少很多，培养与提取更为困难；另一方面由于支原体无细胞壁结构，生物被膜菌体结构与浮游细胞菌体存在很大差别，包裹菌体的多糖蛋白复合物会影响总蛋白的提取效果，以致获得高质量的生物被膜总蛋白非常困难。在支原体生物被膜总蛋白的提取过程中，不仅需要将菌体DNA、分泌的脂质等影响双向电泳的干扰性物质去除，还需要将包裹在生物被膜菌体外的多糖蛋白等物质去除，此外还需要最大程度的提高样品的溶解度，获得最大量的总蛋白，减少总蛋白的损失。现有技术中还没有有效针对牛支原体生物被膜的提取方法。
因此，为了更好的了解牛支原体生物被膜与浮游细胞蛋白的差异表达，研究生物被膜的形成机制、耐药机制和免疫机制，需要一种简单、实用而高效的支原体生物被膜总蛋白提取方法。
技术实现要素：
本发明的提供一种可克服现有技术不足的、可以简单、实用而高效的提取牛支原体生物被膜总蛋白的方法。
本发明的牛支原体生物被膜总蛋白的提取方法是首先采用用机械方法收集牛支原体生物被膜菌体然后将将得到的牛支原体生物被膜菌体中加入裂解液进行裂解处理，再将在经裂解处理后的的牛支原体中冰浴超声处理后分离出上清液，最后的在上一步骤得到的上清液中加入TCA/丙酮溶液，经低温沉淀后弃上清得到总蛋白。
本发明优选的提取方法是：
a. 机械方法收集牛支原体生物被膜菌体是从牛支原体生物被膜菌体中移除上清，再用0.01M pH 7.2 PBS清洗，然后用细胞刮刀刮下粘附于培养皿的生物被膜，离心弃去上清后再用0.01M pH 7.2 PBS清洗菌体；
b. 裂解处理方法是所加入的裂解液由质量比为4%的 SDS, 100 mM 的Tris-HCL,100 mM DTT组成；
c. 裂解处理后的菌体用涡旋振荡重悬，然后进行沸水浴，经涡旋振荡机械破碎后用冰浴超声破碎处理，然后再次分离出上清液；
e. 按10倍体积的上一步骤得到上清液中入10%TCA/丙酮溶液，-20℃沉淀12 h，12, 000 g离心10 min弃上清。加入预冷丙酮清洗沉淀2次，12, 000 g离心10 min弃上清，室温风干沉淀。
本发明的牛支原体生物被膜总蛋白的提取方法是利用细胞刮刀刮取，PBS多次清洗和高速离心操作，可有效的去除培养基成分、菌液表层脂质等杂质对总蛋白的污染；利用裂解液裂解、低温超声破碎，同时结合机械破碎，克服了现有技术存在的多糖成分和菌体的分离不完全、多糖和DNA等残留、总蛋白易降解和损失等问题；增加了除去样品制备过程中脂类物质等杂质（通过TCA/丙酮溶液除去脂类物质）的步骤，使提取的总蛋白质样品在其后的等电聚焦电泳过程中减少了非蛋白质类物质的干扰，有利于总蛋白在等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中有效分离。通过后续双向电泳检测提取效果，结果显示，与现有技术相比，本发明方法可获得更多蛋白点，蛋白点多达1200个，而现有技术为1000~1100个蛋白点；本发明方法得到的图像更清晰，聚集更充分，拖尾和弥散更少。
本发明提供的方法为支原体生物被膜总蛋白的提取提供了良好的参考，可广泛应用于支原体生物被膜总蛋白的提取，便于支原体生物被膜蛋白组学的研究。
附图说明
图1 采用本发明的方法得到的牛支原体生物被膜总蛋白的双向电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例为详细解说本发明的牛支原体生物被膜总蛋白的提取方法，实施中所涉及和试验仪器为：
第一向等电聚焦仪Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System 、第二向垂直板电泳仪Hofer SE 600、电源EPS-601均为GE Amersham产品；纯水装置为Millpore公司产品；图像扫描仪Typhoon FLA9000为GE公司产品。IPG干胶条（13cm, pH3-10）、IPG Buffer（pH3-10）、CHAPS、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺均购自美国GE healthcare公司；SDS、Glycine、Tris、Acrymide、BIS、APS、Urea、TEMED均为BIO-RAD试剂；蛋白定量试剂盒为北京雷根生物技术有限公司产品；无水乙醇、丙酮、三氯乙酸均为国产分析纯；其他试剂均为GE公司产品；双向电泳中所用水均为超纯水。
具体操作步骤如下：
（1）牛支原体生物被膜的培养：将培养20 h的牛支原体浮游细胞，以1:10比例接种30 ml
MTB培养基（21 g/L PPLO broth, 1 g/L glucose , 2 g/L sodium pyruvate, 100 mL/L 25% yeast extract, 20% horse serum, 0.4% phenol red 5 mL/L, 100 units of penicillin, and 0.01% acetic acid thallium, pH 7.4），将其置于直径为150 mm的培养皿中，30 ml/皿，37℃恒温培养72 h。
（2）对牛支原体生物被膜的收集：移除培养皿中的培养液，用0.01M pH 7.2 PBS清洗，每次40 ml，清洗3遍后，用细胞刮刀刮下粘附于培养皿的生物被膜，用0.01M pH 7.2 PBS重悬大约5×108个细胞，4℃ 12, 000 g离心30 min，弃上清，用0.01M pH 7.2 PBS清洗菌体3遍。
（3）清洗的菌体中加入1 ml裂解液（4% SDS, 100 mM Tris-HCL,100 mM DTT），涡旋振荡重悬菌体，沸水浴5 min，机械破碎3次（MP样品制备仪，6 m/s，60 s /次），冰浴超声破碎10次（功率80W，超声10s，间歇15s），沸水浴5 min，4℃ 12, 000 g离心30 min后取上清至新离心管。
（4）在新离心管中以10倍蛋白上清液体积加入10%TCA/丙酮溶液，每100 μL上清加1 ml 10%TCA/丙酮溶液，-20℃沉淀12 h，4℃ 12, 000 g离心10 min后弃上清。每管用1 ml 预冷丙酮清洗蛋白2次，4℃ 12, 000 g离心10 min，室温风干5 min，收集干燥的的总蛋白，获得所述总蛋白。
（5）干燥的蛋白中加入800 μL溶解缓冲液（8M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 65 mM DTT, cocktail）30 min，每隔10 min振荡一次，4℃ 12, 000 g离心30 min，取上清。用蛋白定量试剂盒对上清中的总蛋白进行定量，大约获得800 μg支原体总蛋白。
将前述实施例中提取的生物被膜总蛋白进行双向电泳测试，步骤与结果如下：
将实施例提取的总蛋白200 μg和重泡涨液（8 M Urea, 2% CHAPS, 18 mM DTT, 0.5% IPG Buffer, Bromophenol blue trace）充分混合，重泡涨12小时，总体积为250 μL。加入持胶槽，取出胶条，采用13 cm，pH3-10 IPG干胶条，胶面朝下从一端放入持胶槽，使重泡涨液浸润整个胶条，用矿物油覆盖，每根胶条约3 ml。上样后进行第一向等电聚焦，电泳条件为：30V 12h，500V 1h，1000V 1h，8000V 8h，500V 4h。等电聚焦后进行胶条的平衡：将胶条取出后，先放入平衡缓冲液I中（50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 1% DTT），置于摇床上平衡15分钟后，然后转入平衡缓冲液II中（50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 4% iodoacetamide），置于摇床上平衡15分钟。两步平衡后，进行第二向SDS-PAGE，使用浓度为12.5%凝胶，用凝胶灌至离玻璃板顶端0.5 cm处后用水封住，聚合约需1小时。聚合后吸去水，用电泳缓冲液冲洗2遍，吸干。然后用0.5%的琼脂糖封住；最后进行SDS-PAGE电泳，先按15 mA/胶电泳30 min，之后按30 mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm处。电泳结束后，硝酸银染液染色，脱色后用扫描仪Typhoon TMFLA 9500对电泳后的胶图进行扫描，用Image-master软件对图像进行分析。
采用本发明提取的牛支原体生物被膜总蛋白在双向电泳胶图上图像清晰，背景干净，拖尾和弥散现象较少，得到的蛋白点多达1200个，蛋白点为圆形或椭圆形，蛋白点聚焦充分，可用于蛋白组学研究。而现有技术得到蛋白点仅为1000~1100个。本发明方法得到的图像与现有技术相比，图像更清晰，蛋白点聚集更充分，拖尾和弥散更少。