本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种重组大肠杆菌的发酵产酶方法，该大肠杆菌可以生产拆分消旋体γ-内酰胺活性的(-)γ-内酰胺酶。
背景技术：
：(1R,4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮是制备碳环核苷类药物的重要手性中间体，碳环核苷类化合物在核苷类药物中的重要性与日俱增，核苷类药物在已经公开的抗病毒药物中占绝大多数。在自然界中，也存在很多天然的碳环核苷类化合物，例如，来源于桔色链霉菌(Streptomycescitricolor)的芒霉素，但是一般其产率低，而且分离提取困难，因此利用(-)-内酰胺合成所需化合物中间体是更为经济有效的方法。(-)-内酰胺的最初酶法生产工艺是利用碱性蛋白酶在水—四氢呋喃混合溶剂中对(±)-内酰胺选择性水解，底物浓度可达50g/L，而目前使用的(-)γ-内酰胺酶具有拆分能力更好，底物耐受浓度更高的特点。(-)γ-内酰胺酶基因在大肠杆菌中克隆表达，可以大大提高(-)γ-内酰胺酶的表达效率，同时也减少了其酶生产的成本，具有很大的工业化应用潜力。但目前存在的发酵方式均存在发酵时间较长，表达效率较低、发酵不稳定等缺点。技术实现要素：本发明需要解决的技术瓶颈是提供一种重组大肠杆菌的发酵及高效产酶的方法，而改重组的大肠杆菌可以产拆分消旋体γ-内酰胺活性的(-)γ-内酰胺酶。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种产(-)γ-内酰胺酶重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：S1、菌种的活化，从保存好的冷冻甘油管或冻干管中取出菌种，通过平板活化至平板上有单个菌株出现；S2、菌株的活化，将培养出的菌株进行活化；S3、菌株接种培养，将活化后的菌株接种于灭菌好后的摇瓶种子培养基中，在30-37℃、100-150转/min下，恒温震荡培养8-12小时；S4、种子的发酵罐培养，按照发酵培养基的成分配置发酵罐，灭菌并降温(葡萄糖和硫酸镁单独灭菌)，待种子培养结束后通过火焰接种口接种进罐，初始进罐溶氧为100%，控制条件38-42℃，通气量为1.5-2vvm发酵罐培养，保持pH为6.8-7.2，控制搅拌联动转速，保证溶氧不低于10%，转速控制不超过400转；S5、发酵开始后，流加葡萄糖，流加的速度保持3小时补完6g/L的葡萄糖为准；发酵至葡萄糖消耗完，溶氧上升；此时开始流加乳糖，流加速度控制为5小时补完10g/L的乳糖为准，发酵10小时后，放罐；S6、最后通过离心的方式获得菌体，所述菌体的湿菌体达70g/L以上。优选地，所述S3中菌株的种子培养基组成为：骨蛋白胨2g/L，YEASTEXTRACT2g/L，氯化钠1g/L；pH调节为6.5-7.0。优选地，所述S4中菌株发酵培养基初始组成成分为：肉蛋白胨24g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖6g/L，硫酸镁2g/L，磷酸氢二钾8g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵1g/L。优选地，所述S5中的葡萄糖与乳糖的加入均采用恒速流加的方式。优选地，所述S5中发酵时间为10-12小时。所述S4中pH通过使用1-2mol/L的硫酸和氨水进行调节控制。优选地，所述S5中发酵时间为10小时，具体包括如下步骤，在发酵前3个小时流加葡萄糖，流加完毕后，再发酵1个小时，流加乳糖5个小时，乳糖流加完后，再进行1个小时的发酵。本发明在目前大肠杆菌发酵方法的基础上，针对于外源蛋白的特殊性，改变的发酵的部分工艺，前期通过碳源(葡萄糖)流加的方式，即保持了培养环境的渗透压，也为菌体生长提供了充足的营养，从而避免常规大肠杆菌快速发酵过程中容易出现的溶菌问题，在菌体迅速生长的同时，保证菌株的稳定性；在诱导期间，不降低诱导温度，但通过控制碳源和诱导剂(乳糖)的流加速度，控制包涵体的产生。通过此方法，避免了很多不必要的控制，短时间内使得菌体生长和目标蛋白积累的速度快，减少了原料成本和时间成本。本发明的有益效果体现在：1、培养基成分简单，所用原料均为普通生物发酵原料。2、由于发酵的温度较高，通气量大，菌株生长和产酶时间快，因此发酵过程的时间短，10小时内基本发酵完毕。3、发酵控制简单，拆分效果好。4、无需添加其他碳氮源，发酵过程稳定，易控制。附图说明图1为本实施例中的HPLC的图谱示意图。具体实施方式以下结合实施例具体说明本发明的制备方法，如无特别说明，均为常规方法：本发明提供的发酵方法，其菌株为重组大肠杆菌为公布申请号CN103966192A专利所提供的重组大肠杆菌菌株。(一)重组大肠杆菌的活化及发酵培养方法(1)配置好平板种子培养基和摇瓶种子培养基、发酵培养基，其具体组成为：菌株的种子培养基成分(g/L)：骨蛋白胨2，YEASTEXTRACT2，氯化钠1；pH调节为6.5，发酵pH使用1mol/L硫酸和氨水调节。固体平板培养基为在此培养基的基础上添加1.5%(w/L)的琼脂条或琼脂粉。灭菌条件：121℃，20分钟。发酵培养基初始成分(g/L)：肉蛋白胨24，酵母粉10，葡萄糖6，硫酸镁2，磷酸氢二钾8，磷酸二氢钾2，硫酸铵1。(2)种子活化和培养：从保存好的冻干管中取出菌种，在无菌条件下，加入少量的无菌水，用接种针挑取少许，在培养皿固体培养基表面划线，然后倒扣放置隔水式恒温培养箱中，30℃培养12小时以上，至平板上有单个、较大的菌株出现。将单个菌株划线接种于固定种子培养基平板上，于隔水式恒温培养箱中30℃培养12小时，活化种子菌株。用接种针挑取活化后的菌株一环接种于灭菌好后的500ml摇瓶种子培养基中，装液量为20%，在37℃、150转/min下，恒温震荡培养8小时。(3)发酵前准备：按照发酵培养基成分配置好发酵培养基，发酵罐大小为10L，装液量6L，灭菌前调节pH为7.2，121℃实罐灭菌20分钟后降温至40℃(葡萄糖和硫酸镁单独灭菌)，葡萄糖和硫酸镁两种物质若与培养基其他成分一起灭菌，会产生沉淀及美拉德反应，所以在灭菌时采用单独灭菌。(4)发酵控制：将摇瓶培养好的种子，按照接种量3%的接种量，通过火焰接种口接入罐中，同时，将单独灭菌的硫酸镁接入；培养温度40℃，通气量为2vvm发酵罐培养，采用自动pH控制，使用1mol/L的硫酸和氨水保持pH=6.8，控制搅拌联动转速，保证溶氧不低于10%(初始进罐溶氧为100%)，转速控制不超过400转；发酵开始后，将单独灭好菌的总添加量为36g、180ml的葡萄糖流加补进(即葡萄糖的量为6g/L)，补料方式为恒速流加，速度为60ml/小时；约发酵4小时后，葡萄糖消耗完，溶氧上升，此时开始流加乳糖，将灭好菌的总量为60g、300ml的乳糖流加补进，补料方式为恒速流加，速度为60ml/小时；大约一共发酵10小时后，放罐。离心，湿菌体73g/L。(二)拆分检测方法(1)拆分处理：将发酵液12000转/min离心一分钟，取0.2g菌体，加入2ml5g/L的γ-内酰胺溶液，35℃搅拌反应2小时。(2)检测方法：取反应混合物，加入2ml的乙酸乙酯萃取，萃取后的有机相为样品，手性HPLC测定光学纯度和转化率，采用的色谱柱为Daicel的ChiralparkOD-J，流速0.8ml/min，流动相：正己烷：乙醇=85：15，检测波长：220nm，进样量20μl。拆分ee%可达99.8%以上。本发明所述的酶活检测方法还可以通过离心后菌体破碎，通过酶液来检测发酵菌体的酶拆分能力。以上检测结果如表1所示。表1：HPLC图谱结果分析表峰号组分名保留时间（min）峰高（uV）峰面积（uV*S）面积（%）含量（%）峰型112.257475620.009190.00919BB214.953223151618547199.9908199.99081BB总计2231996186033100.00000100.00000显然，本发明的上述实施例仅仅为清楚的说明发明所举例，且尚有多种实施方式，并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，均可以采用等同替换或者等效变换而形成的很多的技术方案。这里无法对所有的实施方式予以穷举。本发明尚有多种具体的实施方式。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。当前第1页1 2 3