本发明涉及一种枯草杆菌纤溶酶及其胶囊的制备方法，具体是一种重组枯草杆菌纤溶酶及其肠溶胶囊的制备方法，属于生物制药技术领域。
背景技术：
心脑血管疾病已经成为人类健康的头号杀手，我国每年因患心脑血管疾病死亡的人数高达700万人，患病总人数已经超过3亿。仅在我国整个心脑血管疾病相关市场已经超过1万亿元。而心脑血管疾病背后主要致病原因是血栓的形成。
目前，血栓栓塞性疾病的治疗主要有三种方法：外科手术、保守疗法和溶栓疗法。这三种方法都存在一定的缺陷。其中，溶栓药物治疗是目前公认的治疗血栓栓塞性疾病最具发展前景治疗手段，但是，目前市场上溶栓药物因为存在半衰期过短、特异性低引起出血性副作用等瓶颈问题而难以得到普及，并且只能用于注射抢救用药。因此，市场上非常缺乏可以长期服用且安全有效的预防和治疗血栓栓塞性疾病的溶栓药物。而现有技术中存在的唯一用于心脑血管疾病治疗的口服溶栓药物为蚓激酶肠溶胶囊，每年可产生上百亿的销售，但是，该药物出血性副作用极大，只能用作处方药，必须按照医嘱严格用药。
枯草杆菌纤溶酶是由枯草芽孢杆菌分泌的一种纤维蛋白溶解酶。其首次发现于日本古老的发酵食品纳豆，并从中分离得到。枯草杆菌纤溶酶对人体纤维蛋白/纤维蛋白原具有靶向的溶解功效，与目前市场上在售的心脑血管疾病治疗药物相比，枯草杆菌纤溶酶可以靶向溶解血栓中起到主体支撑作用的胶联纤维蛋白，从而发挥瓦解血栓再通血管的功效，并且安全无毒副作用。因此，枯草杆菌纤溶酶在心脑血管疾病的预防和治疗领域具有无限的发展前景。
应用于枯草杆菌纤溶酶蛋白的分离纯化关键技术还没有得到有效解决。而分离纯化大量得到高度纯化的枯草杆菌纤溶酶，是实现枯草杆菌纤溶酶药物的开发并实现产业化的必要前提。枯草杆菌纤溶酶自上世纪80年代发现以来，一直依靠于传统大豆固体发酵，其很难实现枯草杆菌纤溶酶的大量分离纯化。由于固体发酵含量极低，并且发酵产物及其复杂，势必造成纯化成本极其高昂。因此枯草杆菌纤溶酶一直用于保健食品领域的开发，并没有发挥其自身的重要药用价值。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种重组枯草杆菌纤溶酶及其肠溶胶囊的制备方法，该纯化重组枯草杆菌纤溶酶的方法，能够大量获得高度纯化的纤溶酶，纯度可以达到95％以上，并且操作简单，易于产业化放大。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种重组枯草杆菌纤溶酶的纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：
1)选取蛋白纯化的填料；
2)将酵母发酵液通过疏水层析填料纯化，得到纯化液；
3)所述纯化液通过G25填料进一步脱盐层析处理，得到纯化后的重组枯草杆菌纤溶酶。
优选的，所述蛋白纯化的填料为Phenyl Sepharose 6FF(HS)。
优选的，所述疏水层析包括疏水层析柱，所述脱盐层析包括脱盐层析柱；并且所述疏水层析柱大小为5cm*20cm，所装Phenyl Sepharose 6FF(HS)填料体积为500ml，所述脱盐层析柱大小为10cm*40cm，所述G25填料体积为3L。
优选的，所述疏水层析纯化的方法为：
Ⅰ)流动相缓冲液：A液，pH为6.50的20mM磷酸缓冲液加1M氯化钠，B液，pH为6.50的20mM磷酸缓冲液；
Ⅱ)调节纯化设备紫外吸收波长为280nm，注射泵流速为20ml/min；
Ⅲ)流加A液平衡柱3个柱体积1500ml，发酵液上样500ml，继续流加A液，直至完全流穿峰，280nm紫外吸收达到基线；
Ⅳ)更换B液进行洗脱，直至目的重组枯草杆菌纤溶酶全部洗脱，得纯化液共650ml。
优选的，所述脱盐层析的方法为：
ⅰ)流动相缓冲液：pH为6.50的20mM磷酸缓冲液；
ⅱ)调节纯化设备紫外吸收波长为280nm，注射泵流速为30ml/min；
ⅲ)流加缓冲液平衡柱1个柱体积3L，将疏水层析所得纯化液全部上样进行脱盐处理；
ⅳ)收集流出的重组枯草杆菌纤溶酶蛋白峰，得到脱盐纯化液共1.2L。
一种基于枯草杆菌纤溶酶重组酵母菌发酵的方法，该方法包括如下步骤：
A)菌种活化：取菌种库保存的枯草杆菌纤溶酶重组酵母菌在YPD固体培养基中划线，28℃培养48-72小时，挑取单菌落接种到200ml液体YPD培养基，于摇床中28℃培养18-24小时，待OD600达到6-10进行发酵罐接种发酵；
B)接种：将活化好的200ml种子液以10％接种量接种到发酵罐中，初始发酵体积为2L，所述发酵培养基配方为KH2PO4 5g/L，CaSO4.2H2O 1g/L，MgSO4 10g/L，K2SO4 10g/L，NH4H2PO4 40g/L，KOH 1.5g/L，甘油40g/L；
C)批量生长阶段：设定发酵温度为28℃，28％的氢氧化铵自动调整pH维持在5.0，保证发酵过程中溶氧DO＞20％，直至甘油完全消耗，DO接近100％，重组酵母细胞的产量达到的量是90-150g/L的湿重；
D)甘油的流加阶段：设定初始补加速率为10-15ml/h/L，初始发酵液的速率流加甘油补充液，保证发酵过程中DO＞20％，甘油的补充至少有4小时，末期细胞的湿重要达到180到220g/L的湿重；
E)甲醇诱导阶段：停止甘油补充液后完全消耗甘油，DO升至100％保持40min左右，诱导温度降低到26℃，设定补给的速率3.6ml/h/L初始发酵液体积，当DO读数稳定，补给速率加倍到7.3ml/h/L，2个小时后，甲醇的补给速率增加到10.9ml/h/L直至发酵结束，保证发酵过程中DO＞20％。
F)收罐：发酵液于4℃下，8000rpm离心10min，收集上清液，蛋白含量可达到6.0-8.5g/L。
优选的，所述YPD固体培养基配方为：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂1.5％；所述YPD液培养基配方为：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
一种重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊的制备方法，将重组枯草杆菌纤溶酶冻干粉通过胶囊灌装板灌装肠溶胶囊，每个胶囊灌装冻干粉65mg，得到重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊，装量差异为5-10mg，并对重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊活性检测。
一种重组枯草杆菌纤溶酶真空冷冻干燥的方法，该方法包括如下步骤：
第一：铺料厚度1.0cm，真空度为10Pa，-30℃预冻3h，-40℃升华干燥17h，30℃解吸干燥4h，冻干周期为24h。
第二：重组酵母发酵所得约2L培养液，经过重组枯草杆菌纤溶酶的分离纯化，得到4L重组枯草杆菌纤溶酶纯化液，4L纯化液中添加2％海藻糖的量工40g，并充分溶解，放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥；
第三：最终得到冻干粉120g，所测含水量为2.3％，小于5％。
优选的，所述真空干燥的流程为：铺料厚度1.0cm，真空度为10Pa，-30℃预冻3h，-40℃升华干燥17h，300℃解吸干燥4h。
一种重组枯草杆菌纤溶酶真空冷冻干燥保护剂的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：
(1)将重组枯草杆菌纤溶酶纯化液稀释，用于冷冻干燥保护剂的筛选；
(2)重组枯草杆菌纤溶酶纯化液分别加入上述保护剂，含量为1％、2％、5％、10％，取100ml用于冷冻干燥，检查冷冻干燥前后重组枯草杆菌纤溶酶的体外纤维活性变化；
(3)所述真空冷冻干燥条件为：分别取上述含有保护剂的酶纯化液，于-80℃条件下预冻3小时，然后放置于真空冷冻干燥机中在真空度为20Pa，温度为-50℃条件下冷冻干燥24小时；
(4)真空冷冻干燥后固体粉末重新溶解于磷酸缓冲液中，分别检测体外纤溶酶活性，比较添加保护剂与不填加任何保护剂真空冷冻干燥之后的活性。
本发明的有益效果是：利用枯草杆菌纤溶酶重组酵母发酵进行重组枯草杆菌纤溶酶的高密度发酵，并在发酵培养液中建立了中试水平的枯草杆菌纤溶酶分离纯化方法，通过该方法可以大量获得高度纯化的纤溶酶，纯度可以达到95％以上，并且操作简单，易于产业化放大。大量获得高纯度的枯草杆菌纤溶酶为药物开发提供了必要前提，具有巨大的发展潜力和市场应用价值。
在前期大量获得高纯度重组枯草杆菌纤溶酶的基础上，研究筛选了最优的枯草杆菌纤溶酶冷冻干燥保护剂，并开发了重枯组草杆菌纤溶酶肠溶胶囊的制剂方法，为枯草杆菌纤溶酶的药物开发和市场应用提供了更加精准的前提条件。枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊制备成功并实现上市销售，必定会填补目前心脑血管疾病预防和治疗市场缺乏安全有效口服药物的空白，产生巨大的市场效益。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
一种重组枯草杆菌纤溶酶的纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：
1)选取蛋白纯化的填料；根据重组枯草杆菌纤溶酶蛋白特点，依据纯化效率和最终蛋白纯化纯度进行填料的选择(表一)。Phenyl Sepharose 6FF(HS)和Benzamidine 4FF(HS)两种填料的纯度都超过95％，考虑到成本因素，最后综合比较选择确定纯化填料为Phenyl Sepharose 6FF(HS)(苯基琼脂糖)。
2)将酵母发酵液通过疏水层析填料纯化，得到纯化液；
3)所述纯化液通过G25(葡聚糖G-25)填料进一步脱盐层析处理，得到纯化后的重组枯草杆菌纤溶酶。
所述疏水层析包括疏水层析柱，所述脱盐层析包括脱盐层析柱；并且所述疏水层析柱大小为5cm*20cm，所装Phenyl Sepharose 6FF(HS)填料体积为500ml，所述脱盐层析柱大小为10cm*40cm，所述G25填料体积为3L。
所述疏水层析纯化的方法为：
Ⅰ)流动相缓冲液：A液，pH为6.50的20mM磷酸缓冲液加1M氯化钠，B液，pH为6.50的20mM磷酸缓冲液；
Ⅱ)调节纯化设备(江苏汉邦NP7000制备泵，NU3000检测器)紫外吸收波长为280nm，注射泵流速为20ml/min；
Ⅲ)流加A液平衡柱3个柱体积1500ml，发酵液上样500ml，继续流加A液，直至完全流穿峰，280nm紫外吸收达到基线；
Ⅳ)更换B液进行洗脱，直至目的重组枯草杆菌纤溶酶全部洗脱，得纯化液共650ml。
所述脱盐层析的方法为：
ⅰ)流动相缓冲液：pH为6.50的20mM磷酸缓冲液；
ⅱ)调节纯化设备紫外吸收波长为280nm，注射泵流速为30ml/min；
ⅲ)流加缓冲液平衡柱，1个柱体积3L，将疏水层析所得纯化液全部上样进行脱盐处理；
ⅳ)收集流出的重组枯草杆菌纤溶酶蛋白液，得到脱盐纯化液共1.2L。
检测得蛋白含量达到3.6mg/ml，蛋白含量检测方法参考中国药典2015版。
一种基于枯草杆菌纤溶酶重组酵母菌发酵的方法，该方法包括如下步骤：
A)菌种活化：取菌种库保存的枯草杆菌纤溶酶重组酵母菌在YPD固体培养基中划线，28℃培养48-72小时，挑取单菌落接种到200ml液体YPD培养基，于摇床中28℃培养18-24小时，待OD600达到6-10进行发酵罐接种发酵；所述YPD(酵母粉蛋白胨葡萄糖)固体培养基配方为：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂1.5％；所述YPD液培养基配方为：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
B)接种：将活化好的200ml种子液以10％接种量接种到7L发酵罐中，初始发酵体积为2L，所述发酵培养基配方为KH2PO4 5g/L，CaSO4.2H2O 1g/L，MgSO4 10g/L，K2SO4 10g/L，NH4H2PO4 40g/L，KOH 1.5g/L，甘油40g/L；
C)批量生长阶段：设定发酵温度为28℃，28％的氢氧化铵自动调整pH维持在5.0，保证发酵过程中溶氧DO＞20％，直至甘油完全消耗，DO接近100％，重组酵母细胞的产量达到的量是90-150g/L的湿重；
D)甘油的流加阶段：设定初始补加速率为10-15ml/h/L，初始发酵液的速率流，加甘油补充液，保证发酵过程中DO＞20％，甘油的补充至少有4小时，末期细胞的湿重要达到180到220g/L的湿重；
E)甲醇诱导阶段：停止甘油补充液后，完全消耗甘油，DO升至100％保持40min左右，诱导温度降低到26℃，设定补给的速率3.6ml/h/L初始发酵液体积，当DO读数稳定(2-4小时)，补给速率加倍到7.3ml/h/L，2个小时后，甲醇的补给速率增加到10.9ml/h/L直至发酵结束，保证发酵过程中DO＞20％，整个甲醇的补给阶段持续大约70小时，总共有大约每升初始发酵体积需要500-750ml甲醇补给；
F)收罐：发酵液于4℃下，8000rpm离心10min，收集上清液，蛋白含量可达到6.0-8.5g/L。
其中，所述YPD固体培养基配方为：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂1.5％；所述YPD液培养基配方为：酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
一种重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊的制备方法，将重组枯草杆菌纤溶酶冻干粉通过胶囊灌装板灌装肠溶胶囊，每个胶囊灌装冻干粉65mg，得到重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊，装量差异为5-10mg，并对重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊活性检测。
重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊活性检测：所用纤维蛋白平板酶活检测方法参考中国药典2015版链激酶检测方法。检测重组枯草杆菌纤溶酶肠溶胶囊毎粒活性为23454IU/粒。每天口服1粒，完全满足人日常活摄入量8000-16000，达到预防和治疗心脑血管疾病的效果。
一种重组枯草杆菌纤溶酶真空冷冻干燥的方法，应用中试规模真空冷冻干燥机研究建立重组枯草杆菌纤溶酶真空冷冻干燥方法和工艺。经过对铺料厚度(0.5-1.5cm)、预冻时间(2-4h)和温度(-20～-30℃)、升华干燥时间(15-20h)和温度(-35～-40℃)、解吸干燥时间(3-6h)和温度(20～40℃)进行试验和优化，最终确定冻干工艺为：
第一：铺料厚度1.0cm，真空度为10Pa，-30℃预冻3h，-40℃升华干燥17h，30℃解吸干燥4h，冻干周期为24h。
第二：重组酵母发酵所得约2L培养液，经过重组枯草杆菌纤溶酶的分离纯化，得到4L重组枯草杆菌纤溶酶纯化液，4L纯化液中添加2％海藻糖的量工40g，并充分溶解，放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥；所述真空干燥的流程为：铺料厚度1.0cm，真空度为10Pa，-30℃预冻3h，-40℃升华干燥17h，300℃解吸干燥4h。
第三：最终得到冻干粉120g，所测含水量为2.3％，小于5％。符合中国药典蛋白冻干药品含水量标准。所用含水量检测方法为，取冻干粉5g至于-60℃恒温干燥箱中烘干至衡重，再进行称重，两次质量差即为含水量。
一种重组枯草杆菌纤溶酶真空冷冻干燥保护剂的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：
(1)将重组枯草杆菌纤溶酶纯化液稀释到3.0mg/ml，用于冷冻干燥保护剂的筛选；用于筛选的保护剂包括甘露醇、甘露糖、葡萄糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糊精、脱脂乳粉。
(2)重组枯草杆菌纤溶酶纯化液分别加入上述保护剂，含量为1％、2％、5％、10％，取100ml用于冷冻干燥，检查冷冻干燥前后重组枯草杆菌纤溶酶的体外纤维活性变化；
(3)所述真空冷冻干燥条件为：分别取上述含有保护剂的酶纯化液，于-80℃条件下预冻3小时，然后放置于真空冷冻干燥机中在真空度为20Pa，温度为-50℃条件下冷冻干燥24小时；
(4)真空冷冻干燥后固体粉末重新溶解于磷酸缓冲液中，分别检测体外纤溶酶活性，比较添加保护剂与不填加任何保护剂真空冷冻干燥之后的活性(表一)。
表一：不同保护荆浓度条件下，重组枯草杆菌纤溶酶活性变化
由表一所得实验结果可知：添加1％、2％、5％、10％海藻糖，可使得活性分别提高32％、43％、49％、30％。添加低浓度海藻糖即可使活性显著提高。添加5％、10％麦芽糊精，可使得活性分别提高30％。添加1％、2％脱脂乳粉，可使得活性分别提高52％和49％。但是脱脂乳粉成本很高，麦芽糊精添加量需要达到5％-10％才能发挥较好的保护效果，且麦芽糊精与脱脂乳粉容易吸潮。因此，综合考虑各方面因素，最终确定海藻糖为最佳保护剂，添加量2％-5％效果最佳。
以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。