一种用于治疗肿瘤的基因重组造血干细胞及其制备方法与流程

本发明涉及肿瘤、慢性感染或自身免疫疾病等的治疗技术领域，具体地，涉及一种基因重组造血干细胞及其制备方法。

背景技术：

Car-T是一种新的治疗方法，简单地说即人工构建针对靶细胞的特异性抗原的CAR分子，并将编码该分子的DNA序列插入重组T细胞，将重组T细胞回输患者体内，杀死靶细胞。构建的重组T细胞表面表达的CAR分子，其胞外域为scFv (single-chain variable fragment)，胞内域包含CD3胞内域部分，前者能够不依赖MHC I抗原提呈，直接与靶细胞表面标志物相结合（例如对于ALL和CLL，急性和慢性淋巴细胞白血病，表面标志物CD19），并活化后者即CD3的胞内域，从而启动T细胞针对靶细胞的杀伤作用。除此之外，第二代和第三代CAR-T所采用的CAR也包含CD28，4-1BB等共刺激信号的胞内域，可促进Car-T细胞增殖。研究表明，在血液系统肿瘤ALL和CLL中，针对CD19的Car-T效果显著。

然而，Car-T疗法仍存在下列诸多问题：1. Car-T对非实体肿瘤的杀伤作用卓越，当患者体内载瘤量较大时，会造成大量肿瘤细胞坏死，引起严重的炎症反应和细胞因子风暴，甚至患者死亡，目前尚无确定的方法避免或消除该不良反应。2. Car-T为终末分化的成熟T细胞，增殖能力和寿命均有限，必须在体外一次构建扩增后全部输注回体内，其在体内无法长期增殖，有效时间较短，因而短期效果显著而长期仍有疾病复发可能。研究表明，Car-T回输治疗CD19+ALL，1个月后缓解率达到90%，而8.5个月后有25.9%复发，其复发均发生在外周血Car-T细胞消失后，且仍为CD19+肿瘤细胞（Maude, S. L. and N. Frey, et al. (2014). "Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia." N Engl J Med 371(16): 1507-17.）。因此，延长Car-T外周血的持久力有利于减少复发。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种基因重组造血干细胞，使其自主分化为Car-T，在外周血平稳持久的维持Car-T的存在，避免早期过高的Car-T浓度引起大量肿瘤坏死和细胞因子风暴，同时理论上“永久”的维持外周血Car-T的存在，使人体获得针对靶细胞的永久免疫监视，降低复发风险。本发明的发明点在于设计一种基于HSCs而非终末分化的T细胞的Car系统，命名为Car-HSCs，以使其持续增殖分化为Car-T，并缓慢释放到外周血，在较长的时间内逐步杀死靶细胞，并发挥长期的免疫监视作用，降低长期复发率。

本发明的另一个目的是提供一种用于基因重组造血干细胞的制备方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种基因重组造血干细胞，在患者造血干细胞的基因组中插入一段序列，该序列包括一段基因X，这段基因X能编码一段肽链Y，该肽链Y包括能特异性识别靶细胞表面抗原表位的胞外域、穿膜域和能激活胞内信号传导通路的胞内域；该序列还包括能特异性调节上述肽链Y表达的启动子和增强子。

需要说明的是，字母X和Y只是为了表达清楚而对基因片段和肽链的命名，对于基因和肽链的结构没有限定意义。

上述基因X编码的肽链Y，可以特异性的与靶细胞表面抗原结合，启动胞内域的生物活性，激活胞内信号通路传递，其效应包括但不限于启动细胞毒性反应和促进T细胞增殖的功能。

作为优选实施方式，一种重组造血干细胞，在患者造血干细胞的基因组中插入Car基因和CD3+CD8+CD4-T细胞特异的启动子和增强子。本发明实际上是将Car基因和控制Car基因特异性表达的CD3+CD8+CD4-T细胞特异的启动子和增强子同时敲入患者的造血干细胞的基因组内，CD3+CD8+CD4-T细胞特异的启动子和增强子能控制Car基因特异性的表达于CD3+CD8+CD4- T细胞的分化阶段。

本发明选择的启动子仅在特定的分化方向的特定分化阶段被激活（例如在CD3+CD8+CD4- T细胞中被激活），在其余包括HSCs及其他分化方向和阶段中均处于关闭状态。

优选地，所述启动子既可以来自天然的基因组克隆产物（例如克隆CD8+分子的启动子），也可以来自人工合成、甚至人工设计的DNA序列。

更优选地，所述启动子为CD8b1上游启动子部分（CD8b1转录起始点上游200bp），增强子为SV40或TCR-alpha增强子；或采用CD8a启动子和TG-g增强子（见Ellmeier, W. and S. Sawada, et al. (1999). "The regulation of CD4 and CD8 coreceptor gene expression during T cell development." Annu Rev Immunol 17: 523-54.）。

更优选地，将CD8 b1上游启动子部分（CD8b1转录起始点上游200bp）插入Car转化载体的Car编码基因邻近上游，将SV40或TCR-alpha增强子插入Car编码基因下游约1.0kb处。

为了使改造后的造血干细胞高效率的定向分化为CD3+CD8+CD4- T细胞，减少髓系分化、B细胞分化和CD4+CD8-T细胞分化，增加CAR-T在外周血的浓度，提高其效率；优选地，所述基因重组造血干细胞可添加其他基因组修饰，如敲除/过表达部分基因，使HSCs更倾向于淋巴系分化方向，更优选地，所述敲除/过表达部分基因例如可以是同时敲除GATA1和PU.1，阻断髓系分化。

优选地，所述基因重组造血干细胞可添加其他基因组修饰，如敲除/过表达部分基因，使HSCs更倾向于T细胞分化方向。例如敲除Pax5可阻断B细胞分化。

优选地，所述基因重组造血干细胞可添加其他基因组修饰，如敲除/过表达部分基因，使HSCs更倾向于CD8+CD4- T细胞分化方向。例如，敲除Th-POK以阻断CD4+CD8-T细胞分化方向。

优选地，所述基因重组造血干细胞可添加其他基因组修饰，如加入可调控的自杀系统，例如加入iCasp-9或其他等效系统（Wu, C. and S. G. Hong, et al. (2014). "Development of an inducible caspase-9 safety switch for pluripotent stem cell-based therapies." Mol Ther Methods Clin Dev 1: 14053.）。注入AP20187或AP1903等诱导物后，诱导物与重组干细胞中表达的iCasp-9结合，激活Caspase-9活性，促进重组干细胞凋亡。当重组干细胞移植后出现不良反应，即可用上述方法终止其存在。

优选地，所述基因重组造血干细胞可添加其他基因组修饰，例如GFP等标记物，以便追踪。

优选地，所述基因重组造血干细胞可添加其他基因组修饰，例如G418等抗性，以便筛选。

更优选地，所述敲除/过表达部分基因的方法可为慢病毒、逆转录病毒、电穿孔、转座子、Crispr-Cas9及其衍生技术，或其他可满足敲入（knock-in）要求的方法。

一种基因重组造血干细胞的制备方法，包括如下步骤：

（1）确立CD8+T细胞阶段特异的转录因子，该转录因子只存在于CD8+终末分化的T细胞中；确立与该转录因子对应的特异性的启动子和增强子，该转录因子可以激活该启动子和增强子，而造血干细胞分化的其他方向其他阶段，该启动子和增强子均不可被激活；

（2）以常规基因工程技术克隆、扩增、顺序拼接针对靶细胞表面抗原的scFv编码基因、跨膜域编码基因和CD3胞内域编码基因（可加入CD28胞内域编码基因和4-1BB编码基因等辅助的共刺激信号），构建融合基因Car。将上述启动子和增强子置于Car上游或下游，形成对Car的转录调控关系，构建Car转化载体，例如慢病毒。该Car将只在CD8+终末分化的T细胞中表达，在其他阶段和分化方向均处于沉默。如采用TCR设计代替Car，同样TCR也将只在CD8+终末分化的T细胞中表达，在其他阶段和分化方向均处于沉默。

（3）可采用转导的方法（如果载体采用慢病毒形式）将含有特定启动子和增强子的Car（或TCR，以下不再赘述）插入HSCs的基因组中，使重组HSCs具备表达Car的能力，该Car所含的胞外scFv能与靶细胞表面标志物结合，激活胞内域所含的CD3和CD28/CD134，4-1BB等共刺激信号；

（4）为了进一步提高重组HSCs向CD8+T细胞分化的效率，可进一步敲除或过表达部分基因，包括3个关键节点：决定髓系/淋巴系分化，T细胞/B细胞/树突状细胞分化，和CD4+/CD8+ T细胞分化。使重组HSCs选择性的走向淋巴系-T细胞-CD8+分化方向。

本发明所述的基因重组造血干细胞治疗肿瘤、慢性感染或自身免疫疾病的方法为：扩增上述重组HSCs，移植入患者体内，或不扩增上述重组HSCs，直接回输移植进入患者体内。重组HSCs将长期存在于患者体内，缓慢而长期的产生Car-T。而其他分化方向和其他阶段的血细胞，如粒细胞、单核细啊、NK细胞、红细胞、B细胞，其表现型与野生型并无差异。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明将含有Car的一段DNA序列敲入患者造血干细胞内，并通过基因重组技术控制CAR特异性的表达于CD8+CD4-T细胞的分化阶段，同时，也包括了通过基因重组技术，使造血干细胞高效率的定向分化为CD8+CD4-T细胞，减少髓系分化、B细胞分化和CD4+CD8-T细胞分化，增加CAR-T在外周血的浓度，提高其效率。

附图说明

图1为以靶向CD19的scFv为例构建的Car结构示意图。

图2为以靶向HER2的scFv为例构建的Car结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

hCD19阳性急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病病人皮下注射G-SCF 10ug/kg，5天，以动员造血干细胞。或不动员造血细胞。

以外周血单个核细胞采集专用设备，循环吸附，获得单个核细胞。

以标记有抗hCD34磁珠筛选单个核细胞。洗脱后得到hCD34+单个核细胞，即为HSCs。

选择特定scFv，例如抗人CD19单克隆抗体，截取其Fab端编码基因作为scFv。选取CD8跨膜域编码基因。选取CD137胞内域（4-1BB）编码基因。选取CD3胞内域编码基因。常规基因工程技术顺序连接上述编码基因，构成抗hCD19的 Car融合基因（结构见图1）。

选取CD8b1上游启动子部分（转录起始点上游200bp），选取SV40增强子；按照以下顺序与Car融合基因拼接：CD8b1启动子-Car融合基因-1.0kb-SV40增强子；其中，启动子序列如SEQ ID NO:1所示，SV40增强子序列如SEQ ID NO:2所示，1.0kb是无意义的任意序列做spacer，Car融合基因可以为anti-hCD19分子，也可为其他靶点，本实施例以anti-hCD19举例，Car融合基因的序列如SEQ ID NO:3所示。将该拼接产物插入质粒，常规包装慢病毒。

将上述慢病毒转导hCD34+单个核细胞。测序查找插入位点，培养检测增殖率以排除恶变。

将上述重组的hCD34+单个核细胞重新静脉注射回该病人。重组的造血干细胞将自动分化为CD3+CD8+ Car-T细胞，特异性杀死CD19阳性淋巴细胞白血病细胞，而重组造血干细胞的其他分化（粒细胞，单核细胞，B细胞等）不表达Car分子。

实施例2

HER2阳性乳腺癌病人，常规骨髓穿刺，抽取骨髓液，以淋巴细胞分离液方法离心，取中间层单个核细胞。

以标记有抗hCD34磁珠筛选单个核细胞。洗脱后得到hCD34+单个核细胞，即为HSCs。

选择特定scFv，例如抗人HER2单克隆抗体，截取其Fab端编码基因作为scFv。选取CD8跨膜域编码基因。选取CD137胞内域（4-1BB）编码基因。选取CD3胞内域编码基因。常规基因工程技术顺序连接上述编码基因，构成抗hHER2的 Car融合基因（结构见图2）。

选取CD8b1上游启动子部分（转录起始点上游200bp），选取SV40增强子，按照以下顺序与Car融合基因拼接：CD8b1启动子-Car融合基因-1.0kb-SV40增强子，启动子序列如SEQ ID NO:1所示，SV40增强子序列如SEQ ID NO:2所示，1.0kb是无意义的任意序列做spacer，Car融合基因是按照图2结构设计的得到的核苷酸序列。

将该拼接产物以Crispr-Cas9同类技术插入上述hCD34+单个核细胞的基因组指定位点。测序查找插入位点，培养检测增殖率以排除恶变。

将上述重组的hCD34+单个核细胞体外培养扩增，重新静脉注射回该病人。重组的造血干细胞将自动分化为CD3+CD8+Car-T细胞，特异性杀死hHER2乳腺癌细胞，而重组造血干细胞的其他分化（粒细胞，单核细胞，B细胞等）不表达Car分子。

实施例3

HER2阳性乳腺癌病人，常规骨髓穿刺，抽取骨髓液，以淋巴细胞分离液方法离心，取中间层单个核细胞。

以标记有抗hCD34磁珠筛选单个核细胞。洗脱后得到hCD34+单个核细胞，即为HSCs。

选择特定scFv，例如抗人HER2单克隆抗体，截取其Fab端编码基因作为scFv。选取CD8跨膜域编码基因。选取CD137胞内域（4-1BB）编码基因。选取CD3胞内域编码基因。常规基因工程技术顺序连接上述编码基因，构成抗hHER2的 Car融合基因（结构见图2）。

选取CD8a启动子和CD8-TG-g增强子，按照下列顺序与Car融合基因拼接：CD8a启动子-Car融合基因-1.0kb -TG-g增强子。其中，CD8a启动子的序列如SEQ ID NO:4所示，TG-g增强子的序列如SEQ ID NO：5所示；1.0kb是无意义的任意序列做spacer；Car融合基因是按照图2结构设计的得到的核苷酸序列。

将该拼接产物以Crispr-Cas9同类技术插入上述hCD34+单个核细胞的基因组指定位点。测序查找插入位点，培养检测增殖率以排除恶变。

选取human Caspase-9，以human FK506-binding protein (FKBP12)代替其recruitment domain (CARD)，拼接成融合基因iCapsp9。将该融合基因以Crispr-Cas9同类技术插入上述Car-HSCs的基因组指定位点。测序查找插入位点，培养检测增殖率以排除恶变。

将上述重组的hCD34+单个核细胞体外培养扩增，重新静脉注射回该病人。重组的造血干细胞将自动分化为CD3+CD8+ Car-T细胞，特异性杀死hHER2乳腺癌细胞，而重组造血干细胞的其他分化（粒细胞，单核细胞，B细胞等）不表达Car分子。

当患者出现任何该重组造血干细胞引起的不良反应时，均可考虑给予AP20187 或 AP1903，诱导物进入重组干细胞后与iCapsp9的FKBP12域结合，激活Caspase-9活性，诱导重组造血干细胞凋亡。

SEQUENCE LISTING

<110> 侯昌禾、任沁沁

<120> 一种用于治疗肿瘤的基因重组造血干细胞及其制备方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> CD8b1启动子

<400> 1

gaaaagtcaa ggctttgatg ctgtatagga tgaagatgaa ggcactccat acacacacac 60

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacatcacg attccgcccc 120

tgccctggtg gccccgccct cttagctcac ttacgttcct ggtgccccac ccgcccaagc 180

tggctcctaa cctacctttc 200

<210> 2

<211> 229

<212> DNA

<213> SV40增强子

<400> 2

gaaccatgga gcggagaatg ggcggaactg ggcggagtta ggggcgggat gggcggagtt 60

aggggcggga ctatggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 120

ggggagcctg gggactttcc acacctggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata 180

cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacccta actgacaca 229

<210> 3

<211> 1458

<212> DNA

<213> CAR融合基因序列

<400> 3

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgc 1458

<210> 4

<211> 391

<212> DNA

<213> CD8a启动子

<400> 4

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cccccttgca agtccccttg atgggaggtg caagtccctt ctggttagtg tctggtctgc 120

tctgctggaa tctctgtaca ttttctttcc actcaacctc cagacaagaa gcaaaaacac 180

aaaaagacac tactgccagc aaaagaagtg gaagggcagg agggtctaga attcaaggcc 240

aacctttgcc atgaagtgag tctgaagcaa gcttggggaa cccaagaacc tatctacaag 300

aaaaagaaaa gggagagtgg gcactcctct cccttcatgt cctgtcactc tcatattttt 360

tttattaaga tttaatcttt atccttcttc t 391

<210> 5

<211> 5105

<212> DNA

<213> TG-g增强子

<400> 5

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acaagccttt gtctctgtgc ctgagtttgt tgtgacagtc atcaattcaa atggggaaga 120

ttaaaatgac caaaaagttc attgtgccct agactcccaa aggagttcaa aaatgtctta 180

agaagtggtt gggagggacc tttgaggaga gagtagctcc ctccccagag ttgaggggag 240

tcaggcagag cctctggccc ccaaccccaa gctcccagct gcacacctgc actctttatt 300

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ggggcagagg gagctagcac ggaaaggcag acaagcccat cacctattca gttcccaggc 420

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caacaaacat gacattaaac aaggactatg tgtaaaataa aggcagatag aggtttgatc 600

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gagagctctc tttttctttt cttttctcct tttcttttct tctttttctc ttcttttttt 780

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aactacagaa aactttaaaa attgatcttt acaaatataa tatgattcta cttataggag 900

gaacccagag gtcaaattga tggaaacaaa caaacgaacg aacaaacaaa aaatagagca 960

gatatcaaaa ccactagcca gtgtttgatg agtttgaatt tgtagtttaa ggagttggaa 1020

attatgagag accgtgtctc aaaaaaacaa aaaggaaaag gaaaagaaaa agaaaggaag 1080

gaagaagaac gaaagaaaga gaggggaagg gagggaagga ggaaggggaa aaggtggtcc 1140

atattcccga ggaaccacac cccaggtgat tctttggctt ctgagcacgc acacatacaa 1200

acccacacac aaaaatgtgc agaatacaca cacacataca accaaaaatt ctccaacttc 1260

tgtaaatgaa gaatggtcaa attcatggga acagaaaaca gaatagtggt ttccgggctt 1320

tgaggagggg accaagtgtt taaagtccgg agtttctgct taaggcaatg aagagaatct 1380

catctgtgat ggacggggat gacgctgcac acggagggag gcgagtttaa tgctatcgtg 1440

ctacttgctt aacacagtgg aggggacact tagtccatgt gtgtgttcaa atacaaacac 1500

aagtaccaaa taactctcca attaagtgac tacctatgaa gaaagggaaa aacaaagcca 1560

ggcagtggat tgccgctcca gtgaccagat gtggaggttc cgtgagtgga ggccacacgg 1620

ctctgtgggt ggagcccacg tggctctggc accaggagag ctctggaaag gcaagccgct 1680

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ggccagccag ggttacctga gatcctgtct caaaagaaag aaaatgtata ttattaatca 1920

taataatata cattttatgt cattgtagaa gcttagaaat aggaacaaaa gagcaaggga 1980

catcttgata tttttatttc ttatatttaa aaaattccac atcatcatgg ccatattgag 2040

tgtatgtatc cataaaatat accgtagcca tttcccagct ccgtacatgt ttttcataat 2100

tctaatattt cacagtaatg tttaaaggtg tgctggctgt tccttttgga gaacagttca 2160

gtctcaccca tgttcacgtc tctgtgcctc cctcccctgc ctcccttctg agctgacctt 2220

aagattacac ccatgacagc agatttccac cttggaatga ctgagcatat gggtgcaaac 2280

attttaatag atcggcctct ttttataatt ttttttttta cttttcattg gtataatcat 2340

aatttatggg atacagggtg tttcccccct tctccaaaag ttgcgtgtat cctagactgg 2400

tctctaactc atcatgtagc caaggatgac gttaaaccct tgaagctcct gcttccacct 2460

gccccgtgct gggaatgcag gtttggcacc accacgcctg gcctggtttt cccttggctt 2520

atttgctggt cggttgtgtt cttactgctt tggatattca tccctccctg gattctctgt 2580

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tgaaatagtt catttgtcaa ttttgggttt tgttccctgt gttctgggga tgatattcaa 2700

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cccattttat aaatgatcaa atgcgcattg tgcaaagtga cagatttcca cgtggcattt 3120

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gttctgggat taaaggcatg cgtcaccact gcccggatgt aagatggagt ctgaatacag 3540

ctttgataga ttggcaaaat cttcttaaaa ggcatgcatt tcctaagtga acacctttac 3600

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gacttttgaa caagcccagc cacccaagga ttcaccattc agagagacct gtctatgtgg 3960

gggctacctc tgtctcccac agctgtgctg gggtcttgtt aaaagtgaaa ctgactttca 4020

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