本发明涉及生物
技术领域：
中OsCIPK23及其编码基因在调控植物铵含量和调控植物生长中的应用。
背景技术：
：氮是重要的营养元素，占植物干重的2％，并且与作物生产联系密切。硝酸和铵根离子是高等植物主要的氮营养源。水稻是一种重要的作物主要吸收铵态氮，调节铵的吸收能力直接影响着水稻的生长状况，在农业生产实践中十分关键,因此对铵吸收的研究既具有理论价值,也具有实践意义。CalcineurinB-like(CBL)-interactingproteinkinase(CIPK)是Ca2+信号下游关键因子。CBL特异性结合钙离子后激活其结合激酶蛋白CIPK传到下游信号。CBL-CIPK复合体已报道参与各种植物抗逆途径，如盐、干旱、低温和渗透压带来的对植物的胁迫。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何调控植物铵含量和/或调控植物根的生长。为解决上述技术问题，本发明首先提供了调控CIPK蛋白质活性的物质或调控植物CIPK蛋白质含量的物质在D1)-D16)任一种中的应用：D1)调控植物铵含量；D2)调控植物氮的吸收；D3)调控植物铵的吸收；D4)调控植物生长；D5)培育铵含量增加植物；D6)培育氮吸收能力增加植物；D7)培育铵吸收能力增加植物；D8)培育生长增加植物；D9)制备调控植物铵含量产品；D10)制备调控植物氮吸收的产品；D11)制备调控植物铵吸收的产品；D12)制备调控植物生长产品；D13)制备培育铵含量增加植物产品；D14)制备培育氮吸收能力增加植物产品；D15)制备培育铵吸收能力增加植物产品；D16)制备培育生长增加植物产品。所述调控CIPK蛋白质活性可通过选自改变CIPK蛋白质表达量、改变CIPK蛋白质编码基因的表达量、改变CIPK蛋白质编码基因拷贝数、启动子置换、启动子突变和基因突变的一种或多种方法实现。上述应用中，CIPK蛋白质可来源于E1)、E2)或E3)：E1)植物；E2)单子叶植物；E3)水稻。在本发明的实施例中，CIPK蛋白质为来源于水稻的名称为OsCIPK23的蛋白质。上述应用中，所述调控植物CIPK蛋白质含量的物质可为调控CIPK蛋白质编码基因表达的物质或敲除CIPK蛋白质编码基因的物质。上述应用中，CIPK蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A2)中的CIPK蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述A2)中的CIPK蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的CIPK蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述应用中，所述调控植物CIPK蛋白质含量的物质可为CIPK蛋白质或其相关生物材料；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：B1)编码CIPK蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；B8)抑制CIPK蛋白质编码基因表达的核酸分子；B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。上述应用中，所述编码CIPK蛋白质的核酸分子可为如下1)或2)或3)：1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码CIPK蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码CIPK蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的CIPK蛋白质。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码CIPK蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的CIPK蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CIPK蛋白质且具有CIPK蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述应用中，B2)所述的含有编码CIPK蛋白质的核酸分子的表达盒(CIPK基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CIPK蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动CIPK基因转录的启动子，还可包括终止CIPK基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。可用现有的表达载体构建含有所述CIPK基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pTCK303载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌LBA4404。上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。上述应用中，所述调控植物生长可为抑制植物生长。所述调控植物铵含量可为降低植物植物铵含量。所述抑制CIPK蛋白质编码基因表达的核酸分子可为与序列表中序列2所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子或其编码的RNA。所述抑制CIPK蛋白质编码基因表达的核酸分子具体可为序列表中序列2第981位-1327位核苷酸所示的DNA分子或其编码的RNA。在本发明的实施例中，B9)所述重组载体为将序列表中序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸插入pTCK303载体的SpeI和SacI酶切位点间，且将序列表中序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸的反向互补片段插入pTCK303载体的SalI和KpnI酶切位点间得到的载体。上述应用中，所述调控植物生长可为调控植物根的生长；所述植物铵含量可为植物根中的铵含量。上述应用中，所述植物可为M1)或M2)：M1)单子叶植物或双子叶植物；M2)水稻。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1或M2的方法：M1、培育铵含量降低和/或根长降低的转基因植物的方法，包括降低目的植物中CIPK蛋白质的活性、降低目的植物中CIPK蛋白质的含量、抑制CIPK蛋白质的编码基因的表达或敲除CIPK蛋白质的编码基因，得到得到转基因植物；所述转基因植物具有如下M1a)和/或M1b)的特征：M1a)所述转基因植物铵含量低于所述目的植物；M1b)所述转基因植物根长低于所述目的植物；M2、培育铵含量增加和/或根长增加的转基因植物的方法，包括增加目的植物中CIPK蛋白质的活性、增加目的植物中CIPK蛋白质的含量、促进CIPK蛋白质的编码基因的表达，得到得到转基因植物；所述转基因植物具有如下M2a)和/或M2b)的特征：M2a)所述转基因植物铵含量低于所述目的植物；M2b)所述转基因植物根长低于所述目的植物。其中，所述CIPK蛋白质的编码基因可为所述编码CIPK蛋白质的核酸分子。上述方法中，所述转基因植物是通过将与所述抑制CIPK蛋白质编码基因表达的核酸分子导入所述目的植物制备得到的。上述方法中，所述植物铵含量可为植物根中的铵含量。上述方法中，所述植物可为M1)或M2)：M1)单子叶植物或双子叶植物；M2)水稻。为解决上述技术问题，本发明还提供了所述生物材料。本发明中所述根的生长中所述根可为主根。所述根中的铵含量中所述根可为所述植物的地下部分。所述铵含量具体可为铵离子的浓度。本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaZnF2基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。实验证明，本发明的CIPK蛋白质及其编码基因可以调控植物的铵的含量和根的生长：将序列表中序列2所示的CIPK蛋白质编码基因的自5′末端第981位-1327位核苷酸的反向互补片段导入植物后得到的转基因植物中CIPK蛋白质编码基因的表达显著下降，转基因植物的主根长度显著小于野生型植物，且转基因植物根中铵离子浓度显著小于野生型植物。表明，抑制CIPK蛋白质编码基因的表达可以抑制植物根的生长和降低植物中铵离子含量，可以用调控CIPK蛋白质活性的物质或调控植物CIPK蛋白质含量的物质来调控植物铵含量和植物生长。附图说明图1为用于敲除OsCIPK23基因的重组载体部分结构示意图。图2为野生型和转基因植株(OsCIPK23RNAi)根中OsCIPK23基因表达差异。图3为野生型和转基因植株(OsCIPK23RNAi)主根长统计结果。图4为野生型和转基因植株(OsCIPK23RNAi)中铵含量差异。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中用到的限制性内切酶均为Takara产品。实施例1、用于敲除OsCIPK23基因的重组载体的构建OsCIPK23(LOC_Os07g05620)基因的核苷酸序列为序列2第1-1353位核苷酸，编码的蛋白质为OsCIPK23，该蛋白质的氨基酸序列为序列1。提取水稻日本晴的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以5′-GTCGACACTAGTCACACTCTTTGAAAAGCAATC-3′和5′-GGTACCGAGCTCCATCGCCTGCGATTATGCTAC-3′为引物扩增，得到347bp的PCR产物，该PCR产物具有序列表中序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸；该PCR产物为正向片段。用SpeI和SacI酶切该PCR产物，将得到的含有序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸的酶切产物命名为酶切产物1；用SpeI和SacI酶切pTCK303载体(WangZhen,ChenChangbin,XuYunyuan,JiangRongxi,HanYe,XuZhihongandChongKang.2004.APracticalVectorforEfficientKnockdownofGeneExpressioninRice(OryzasativaL.)PlantMolecularBiologyReporter22:409-417)，得到pTCK303载体骨架；将酶切产物1与pTCK303载体骨架连接，使序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸正向插入pTCK303载体的SpeI、SacI位点间，得到中间载体；再用SalI和KpnI酶切该PCR产物，将得到的含有序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸的酶切产物命名为酶切产物2；用SalI和KpnI酶切中间载体，得到中间载体骨架；将酶切产物2与中间载体骨架连接，使序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸反向插入中间载体的SalI和KpnI位点间，得到重组载体，为RNA干扰载体。经过测序，该重组载体为将序列表中序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸(B)插入pTCK303载体的SpeI和SacI酶切位点间，且将序列表中序列2自5′末端第981位-1327位核苷酸的反向互补片段(A)插入pTCK303载体的SalI和KpnI酶切位点间得到的载体，命名为pTCK-OsCIPK23RNAi(结构示意图如图1所示)，为RNA干扰载体。该具有反向重复的重组表达载体用Ubiquitin基因的启动子(pUbiquitin)。实施例2、干扰OsCIPK23基因获得转基因水稻1、RNA干扰转基因株系的获得1)RNA干扰转基因株系的获得将实施例1获得的pTCK-OsCIPK23RNAi转入农杆菌LBA4404(TakaraBiocompany，Cat.9115)，得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，将含有实施例1获得的pTCK-OsCIPK23RNAi的重组菌命名为LBA4404/pTCK-OsCIPK23RNAi。将LBA4404/pTCK-OsCIPK23RNAi转化到水稻日本晴(以下也称为野生型水稻)中，潮霉素筛选，获得了25个T0代转OsCIPK23RNAi水稻，即为RNA干扰转基因株系。2)分子鉴定对上述获得的25个T0代转OsCIPK23RNAi水稻(OsCIPK23RNAi)和野生型水稻(WT)进行分子鉴定，提取各种水稻根的总RNA经反转录后，用如下引物进行RT-PCR方法鉴定：OsCIPK23-F:TGGGCTTTAATGTACAGAAGOsCIPK23-R:TCACATCTTTCAGGCCATTG内参基因为Actin，内参引物为Actin-F:TCCATCTTGGCATCTCTCAGActin-R:GTACCCGCATCAGGCATCTG结果如图2所示，T0代转OsCIPK23RNAi水稻(OsCIPK23RNAi)中OsCIPK23的平均相对表达量低于野生型水稻(EV)中OsCIPK23的平均相对表达量，证明OsCIPK23RNAi水稻中OsCIPK23基因被敲除或OsCIPK23基因的表达受到抑制。图2中，#3和#5为OsCIPK23RNAi的两个株系。采用同样的方法将空载体pTCK303转入野生型水稻中，得到T0代转pTCK水稻。将上述T0代转OsCIPK23RNAi水稻和T0代转pTCK水稻均播种传代，分别得到T1代转OsCIPK23RNAi水稻和T1代转pTCK水稻。2、RNA干扰转基因表型观察将T1代转OsCIPK23RNAi水稻(OsCIPK23RNAi)和野生型水稻WT的播种在MS培养基中。以T1代转pTCK水稻为对照。每个株系10株，实验重复3次，结果取平均值。在播种第4天，统计各株系主根长度，结果如图3所示，T1代转OsCIPK23RNAi水稻主根长度均显著小于野生型水稻(EV)，T1代转pTCK水稻与野生型水稻的主根长度无显著差异。两个T1代转OsCIPK23RNAi水稻主根长度分别为3.2±0.32cm、2.67±0.25cm，野生型水稻主根长度为4.3±0.45cm。表明，OsCIPK23基因被敲除或抑制OsCIPK23基因的表达可以降低水稻的主根长度。图3中，#3和#5为OsCIPK23RNAi的两个株系。在播种第4天，测定各株系根中的铵离子浓度。结果如图4所示，T1代转OsCIPK23RNAi水稻根中铵离子浓度均显著小于野生型水稻(EV)，T1代转pTCK水稻与野生型水稻的根中铵离子无显著差异。两个T1代转OsCIPK23RNAi水稻根中铵离子分别为1.73±0.1mg/gFW、1.54±0.14mg/gFW，野生型水稻主根长度为1.96±0.13mg/gFW。表明，OsCIPK23基因被敲除或抑制OsCIPK23基因的表达可以降低水稻根中铵离子浓度。图4中，#3和#5为OsCIPK23RNAi的两个株系。当前第1页1 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