本发明涉及酶提取领域，尤其涉及微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法。
背景技术：
溢油对海洋生态环境和海洋资源都有长期的危害，海洋溢油污染已经成为人们必须面对的重大环境问题。微生物修复技术可以处理物理方法和化学方法无法清除的残余溢油，是恢复生态环境的最佳途径，得到了研究者的重视。微藻作为海洋环境中主要的初级生产者，数量巨大，对溢油发生后生态修复发挥了十分重要的作用。在石油烃生物氧化过程中，石油烃羟化酶为石油烃好氧降解的起始酶，是其代谢途径的关键酶之一。
因此，亟需开发出一种从微藻中提取而得的、高活性、能够高效降解石油烃的酶。如果将其应用于海洋溢油治理，可望获得较好的治理效果。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法。本发明方法提取率高，且制备的细胞色素P450酶纯度高，活性好，对石油烃具有高效的降解效果。
本发明的具体技术方案为：一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法，包括以下步骤：
1）冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤，将滤膜装入离心管中并在-10℃至-16℃的温度下冷冻3-5h，接着取出在30-40℃水浴中融解8-12min，重复上述方法冷冻-融解数次。
本发明在提取前对微藻进行冻融处理，对微藻进行往复多次的冻融处理，在低温环境下，细胞中的大部分水遇冷形成冰晶, 冰晶的形成产生了膨胀压, 导致细胞发生破损，而未形成冰晶的细胞残存液, 由于在冻结过程中冰晶的析出致使溶质浓度变高，电解质升高、渗透压改变、pH 改变、蛋白变性等。在后续的融解过程中，细胞又发生溶胀,最终使细胞壁、细胞膜破碎。如此，细胞液中大量活性物质流出，为后续的提取提供了有利条件。
2）研磨处理：分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中，向研钵中添加石英砂并研磨10-20min。
对冻融处理后的微藻再进行研磨，进一步加速细胞液的流出。
3）微波辐射处理：分两次向研钵中加入水转移至离心管，以3000-4000r/min的转速离心处理后，取上清液，将上清液转移至微波萃取仪中萃取2-4min，得到萃取液。
在微波辐射过程中，细胞内分子发生剧烈振动，加速细胞破裂，只需数分钟就能使细胞液大量流出。本发明中冻融、研磨与微波辐射的配合，能够极大限度地提高提取效率。
4）浓缩透析：萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩，并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析12-24h，得到细胞色素P450酶粗品。
5）纯化：用10mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后，将细胞色素P450酶粗品上样，用20mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液洗脱；经聚乙二醇PEG20000浓缩后，用5mmol/L的磷酸缓冲液透析12-24h，用超滤膜再次浓缩；用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样，用20 mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液洗脱，用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液透析12-24h，用超滤膜浓缩，干燥后制得成品。
对细胞色素P450酶粗品进行两次纯化，能够有效提高产品纯度。
作为优选，步骤1）中所述微藻液的制备方法为：将微藻接种于微藻培养液中，在温度为10-20℃、盐度为10-30‰、pH值为7-9的环境下异养培养14-16天，得到微藻液。
经过本发明人的长期研究，发现不同的微藻的培养方式，细胞中细胞色素P450酶对于降解石油烃具有不同的活性。因此需要通过对微操的培养方式进行严格限定，以提高其细胞色素P450酶的活性。
本发明通过大量创造性劳动，发现微藻在异养条件下，其细胞色素P450酶的活性最高，同时在异养条件下配上上述培养环境，其细胞色素P450酶的活性进一步提高。
作为优选，所述微藻培养液的配方如下：原油1-5g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L，溶剂为海水。
在上述培养液中进行培养的微藻，其细胞色素P450酶活性能够进一步得到提升。
作为优选，所述微藻在微藻培养液中的接种量为5-10wt%。
作为优选，步骤1）中重复冷冻-融解2-4次。
作为优选，步骤3）中微波萃取仪的功率为400-500W，温度45-55℃。
作为优选，步骤5）中洗脱时，磷酸缓冲液的流速为3.5-4.5mL/min。
作为优选，步骤5）中所述超滤膜的分子截留量为10000。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法提取率高，且制备的细胞色素P450酶纯度高，活性好，对石油烃具有高效的降解效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法，包括以下步骤：
微藻的培养：将微藻以10wt%的接种量接种于微藻培养液中，在温度为20℃、盐度为30‰、pH值为9的环境下异养培养16天，得到微藻液。所述微藻培养液的配方如下：原油5g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L，溶剂为海水。
1）冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤，将滤膜装入离心管中并在-16℃的温度下冷冻3h，接着取出在40℃水浴中融解8min，重复上述方法冷冻-融解4次。
2）研磨处理：分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中，向研钵中添加石英砂并研磨20min。
3）微波辐射处理：分两次向研钵中加入水转移至离心管，以4000r/min的转速离心处理后，取上清液，将上清液转移至微波萃取仪中在功率为500W，温度55℃的条件下萃取2min，得到萃取液。
4）浓缩透析：萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩，并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析24h，得到细胞色素P450酶粗品。
5）纯化：用10mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后，将细胞色素P450酶粗品上样，用20mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以4.5mL/min的流速洗脱；经聚乙二醇PEG20000浓缩后，用5mmol/L的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩；用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样，用20 mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以4.5mL/min的流速洗脱；用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜浓缩，干燥后制得成品。
实施例2
一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法，包括以下步骤：
微藻的培养：将微藻以7.5wt%的接种量接种于微藻培养液中，在温度为15℃、盐度为20‰、pH值为8的环境下异养培养15天，得到微藻液。所述微藻培养液的配方如下：原油3g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L，溶剂为海水。
1）冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤，将滤膜装入离心管中并在-13℃的温度下冷冻4h，接着取出在35℃水浴中融解10min，重复上述方法冷冻-融解3次。
2）研磨处理：分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中，向研钵中添加石英砂并研磨15min。
3）微波辐射处理：分两次向研钵中加入水转移至离心管，以3500r/min的转速离心处理后，取上清液，将上清液转移至微波萃取仪中在功率为450W，温度50℃的条件下萃取3min，得到萃取液。
4）浓缩透析：萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩，并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析18h，得到细胞色素P450酶粗品。
5）纯化：用10mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后，将细胞色素P450酶粗品上样，用20mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以4mL/min的流速洗脱；经聚乙二醇PEG20000浓缩后，用5mmol/L的磷酸缓冲液透析18h，用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩；用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样，用20 mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以4mL/min的流速洗脱；用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液透析18h，用分子截留量为10000的超滤膜浓缩，干燥后制得成品。
实施例3
一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法，包括以下步骤：
微藻的培养：将微藻以5wt%的接种量接种于微藻培养液中，在温度为10℃、盐度为10‰、pH值为7的环境下异养培养14天，得到微藻液。所述微藻培养液的配方如下：原油1g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L，溶剂为海水。
1）冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤，将滤膜装入离心管中并在-10℃的温度下冷冻5h，接着取出在30℃水浴中融解12min，重复上述方法冷冻-融解2次。
2）研磨处理：分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中，向研钵中添加石英砂并研磨10min。
3）微波辐射处理：分两次向研钵中加入水转移至离心管，以3000r/min的转速离心处理后，取上清液，将上清液转移至微波萃取仪中在功率为400W，温度45℃的条件下萃取4min，得到萃取液。
4）浓缩透析：萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩，并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析12h，得到细胞色素P450酶粗品。
5）纯化：用10mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后，将细胞色素P450酶粗品上样，用20mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以3.5mL/min的流速洗脱；经聚乙二醇PEG20000浓缩后，用5mmol/L的磷酸缓冲液透析12h，用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩；用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样，用20 mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以3.5mL/min的流速洗脱；用5 mmol/L，pH7．2的磷酸缓冲液透析12h，用分子截留量为10000的超滤膜浓缩，干燥后制得成品。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。