本发明涉及一种低分子量肝素钠生产工艺，尤其涉及一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺。
背景技术：
低分子量肝素的用途主要为1、治疗急性深部静脉血栓，2、血液透析时预防血凝块形成，3、治疗不稳定型心绞痛和非Q波心肌梗塞，4、预防与手术有关的血栓形成。
低分子量肝素包括低分子量肝素钠和低分子量肝素钙，不论是低分子量肝素钙，还是低分子量肝素钠，都是低分子量肝素，都应符合英国药典对低分子量肝素总则的要求，应该说这是低分子量肝素的最低标准，我国的低分子量肝素的标准也不例外，其要求为：重均分子量在8000Da以下，小于8000Da的级分不少于60％；抗Xa因子与抗IIa因子活性比不小于1.5。
低分子量肝素钠是由未分级肝素钠经过化学降解、结构修饰(即还原)、分子量分级和除去杂质等步骤而得到的，我国生产厂家采用的工艺一般是用亚硝酸钠降解、硼氢化钠还原、乙醇多次分级和乙醇多次沉淀逐步稀释杂质的工艺，尤其以达肝素钠(是低分子量肝素钠的一种)的生产工艺为代表。
低分子量肝素钙是由低分子量肝素钠经过进一步的化学反应而成，其前期的步骤和低分子量肝素钠的生产工艺相同，只是在得到低分子量肝素钠后再经过化学反应得到低分子量肝素钙。
不论是低分子量肝素钠，还是低分子量肝素钙，其分子量分级工艺和杂质稀释工艺大多使用乙醇作为溶剂，而整个工艺中的某一步均有使用乙醇，这不仅给生产环境带来危险(车间需要防爆设计)，而且生产防护也要加强(如乙醇气体的有组织排放)，也带来了较高的生产成本(乙醇消耗、乙醇回收等均成为成本)。
专利号为200710061476.6的专利公开了“一种低分子量肝素钙生产工艺”，该工艺采用超滤膜技术应用于不同分子量段的分离，在实际生产中，超滤膜的分子量段的分离受压力、温度、浓度、起始原料的分子量分布等因素影响较大，往往很难实现数据重现性，比如，压力增高，除了小分子量段的部分可以过滤掉以外，大分子量段的部分由于是线性分子的缘故也会被过滤掉。另外，还有一个问题也制约着用超滤膜分级技术的实施：即较难选择合适的超滤膜，因为超滤膜名义分子量与生产厂家有关，即不同厂家所标注的分子量截留范围相同，但使用效果相差很大，往往是超滤膜的实际截留的分子量范围也有一定的分散性，即超滤膜不能够做到分子量的断崖式截留。还有一点就是随着超滤膜使用时间的延长，其过滤孔径有的被堵塞，其性能下降，随之而来的工艺参数也要随之变化，给实际使用带来困难。
国外原研工艺和国内诸多仿家生产低分子量肝素钠(钙)的工艺均为使用乙醇进行分子量分级沉淀，这不仅从环保和保障人体健康角度增加了回收和环境保护的成本，更重要的是，在达肝素钠成品中增加了乙醇杂质，并且成品中的乙醇残留限度不容易达到要求，或者说存在达不到限度的风险。因此开发一种不使用有机溶剂的洁净的生产低分子量肝素的工艺对环保、健康、安全无疑具有十分重要意义。
如前所述，低分子量肝素钠(钙)的生产工艺大部分使用乙醇作为分子量分级和稀释杂质的溶媒，具有缺点：1、生产车间必须按照防爆车间设计，要有乙醇气体排放的控制；2、生产成本较高，主要是乙醇回收费用较高；3、最终产品有有机溶剂残留。还有的生产工艺采用超滤膜技术应用于不同分子量段的分离，如专利号为200710061476.6的“一种低分子量肝素钙生产工艺”，其缺点如下：1、工艺不稳定，工艺条件难控制；2、不容易找到分子量适宜法超滤膜；3、随着超滤膜的老化，其性能下降，随之而来的工艺条件要变化，给实际使用带来困难。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种环保、健康、安全、生产成本低的无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，采用本发明所述工艺在低分子量肝素钠制备过程中，不使用有机溶剂，是一种新的绿色环保的制备低分子量肝素钠的工艺技术。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，其特征是，包括如下步骤：
(1)肝素钠用水溶解，使成5—15％W/V，调节ph值至2—3.5，呈酸性，加入用水溶解好的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠总量为肝素钠质量的2—3％，搅拌1—1.5小时，然后调节ph值至7—10，呈弱碱性，按照肝素钠质量的0.5—3％加入硼氢化钠，再搅拌1—20小时，得到低分子量肝素钠溶液A；
(2)取第(1)步所得低分子量肝素钠溶液A，调节ph值至中性，为5—8，用孔径为0.22—0.45微米的微孔滤膜过滤；
(3)用Q Bestarose XL或者HiTrapQHP离子交换树脂填装离子交换柱，然后用2—4倍柱体积的0.6molNaCl溶液洗涤平衡，然后再用0.15molNaCl溶液洗涤3—5倍柱体积量平衡；
(4)将过滤后的低分子量肝素钠溶液A上样，上样量为2—4倍柱体积，注意上样时避免气泡产生；
(5)加入2—4倍柱体积的0.6molNaCl溶液清洗；
(6)加入3—7倍柱体积的0.15molNaCl溶液，收集清洗液；
(7)加入2—4倍柱体积的1.2molNaCl溶液；
(8)收集第(7)步所得洗涤液和溶液，然后进行纳滤，纳滤膜选择分子量1000Da以下的规格，加入4—6倍体积的纯化水对药液进行洗涤，去除过低分子量的低分子量肝素片段和氯化钠等小分子无机盐，然后将药液浓缩至预估药液浓度为5％w/v以上，停止浓缩，将药液进行除菌过滤后转移至冻干机冻干即可。
本发明改变了落后的溶媒(乙醇)分级沉淀法，采用纳滤技术纯化低分子量肝素钠，是一种全水相无有机溶剂残留的纯化低分子量肝素钠生产方法。
本发明的生产工艺采用离子交换树脂分离分子量，通过洗脱条件的变化控制分子量分级，再通过纳滤膜浓缩，实现小分子杂质的去除，从而得到较为纯净的低分子量肝素钠，全程不使用有机溶媒(乙醇)，是一个易于控制的生产工艺。
该工艺是在肝素钠经过化学降解、还原后采用离子交换分离分子量，然后再使用纳滤膜浓缩并去除小分子的杂质，再经过冷冻干燥形成最终产品。整个生产过程没有溶媒(乙醇)参与，更容易实现产业化，生产出更加洁净的产品，也有利于环保、健康和安全，有利于车间实现非防爆设计，节约建设成本和生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实施例一
一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，包括如下步骤：
(1)肝素钠用水溶解，使成5％W/V，调节ph值至2，呈酸性，加入用水溶解好的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠总量为肝素钠质量的2％，搅拌1小时，然后调节ph值至7，呈弱碱性，按照肝素钠质量的0.5％加入硼氢化钠，再搅拌1小时，得到低分子量肝素钠溶液A；
(2)取第(1)步所得低分子量肝素钠溶液A，调节ph值为5，用孔径为0.22微米的微孔滤膜过滤；
(3)用Q Bestarose XL离子交换树脂填装离子交换柱，然后用2倍柱体积的0.6molNaCl溶液洗涤平衡，然后再用0.15molNaCl溶液洗涤3倍柱体积量平衡；
(4)将过滤后的低分子量肝素钠溶液A上样，上样量为2倍柱体积，注意上样时避免气泡产生；
(5)加入2倍柱体积的0.6molNaCl溶液清洗；
(6)加入3倍柱体积的0.15molNaCl溶液，收集清洗液以备他用；
(7)加入2倍柱体积的1.2molNaCl溶液；
(8)收集第(7)步所得洗涤液和溶液，然后进行纳滤，纳滤膜选择分子量1000Da以下的规格，加入4倍体积的纯化水对药液进行洗涤，去除过低分子量的低分子量肝素片段和氯化钠等小分子无机盐，然后将药液浓缩至预估药液浓度为5％w/v以上，停止浓缩，将药液进行除菌过滤后转移至冻干机冻干即可。
实施例二
一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，包括如下步骤：
(1)肝素钠用水溶解，使成15％W/V，调节ph值至3.5，呈酸性，加入用水溶解好的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠总量为肝素钠质量的3％，搅拌1.5小时，然后调节ph值至10，呈弱碱性，按照肝素钠质量的3％加入硼氢化钠，再搅拌20小时，得到低分子量肝素钠溶液A；
(2)取第(1)步所得低分子量肝素钠溶液A，调节ph值为8，用孔径为0.45微米的微孔滤膜过滤；
(3)用Q Bestarose XL离子交换树脂填装离子交换柱，然后用4倍柱体积的0.6molNaCl溶液洗涤平衡，然后再用0.15molNaCl溶液洗涤5倍柱体积量平衡；
(4)将过滤后的低分子量肝素钠溶液A上样，上样量为4倍柱体积，注意上样时避免气泡产生；
(5)加入4倍柱体积的0.6molNaCl溶液清洗；
(6)加入7倍柱体积的0.15molNaCl溶液，收集清洗液以备他用；
(7)加入4倍柱体积的1.2molNaCl溶液；
(8)收集第(7)步所得洗涤液和溶液，然后进行纳滤，纳滤膜选择分子量1000Da以下的规格，加入6倍体积的纯化水对药液进行洗涤，去除过低分子量的低分子量肝素片段和氯化钠等小分子无机盐，然后将药液浓缩至预估药液浓度为5％w/v以上，停止浓缩，将药液进行除菌过滤后转移至冻干机冻干即可。
实施例三
一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，包括如下步骤：
(1)肝素钠用水溶解，使成5％W/V，调节ph值至2.5，呈酸性，加入用水溶解好的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠总量为肝素钠质量的2.5％，搅拌1.5小时，然后调节ph值至7，呈弱碱性，按照肝素钠质量的3％加入硼氢化钠，再搅拌1小时，得到低分子量肝素钠溶液A；
(2)取第(1)步所得低分子量肝素钠溶液A，调节ph值为8，用孔径为0.22微米的微孔滤膜过滤；
(3)用Q Bestarose XL离子交换树脂填装离子交换柱，然后用4倍柱体积的0.6molNaCl溶液洗涤平衡，然后再用0.15molNaCl溶液洗涤3倍柱体积量平衡；
(4)将过滤后的低分子量肝素钠溶液A上样，上样量为4倍柱体积，注意上样时避免气泡产生；
(5)加入2倍柱体积的0.6molNaCl溶液清洗；
(6)加入7倍柱体积的0.15molNaCl溶液，收集清洗液以备他用；
(7)加入2倍柱体积的1.2molNaCl溶液；
(8)收集第(7)步所得洗涤液和溶液，然后进行纳滤，纳滤膜选择分子量1000Da以下的规格，加入6倍体积的纯化水对药液进行洗涤，去除过低分子量的低分子量肝素片段和氯化钠等小分子无机盐，然后将药液浓缩至预估药液浓度为5％w/v以上，停止浓缩，将药液进行除菌过滤后转移至冻干机冻干即可。
实施例四
一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，包括如下步骤：
(1)肝素钠用水溶解，使成15％W/V，调节ph值至2，呈酸性，加入用水溶解好的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠总量为肝素钠质量的3％，搅拌1小时，然后调节ph值至10，呈弱碱性，按照肝素钠质量的0.5％加入硼氢化钠，再搅拌20小时，得到低分子量肝素钠溶液A；
(2)取第(1)步所得低分子量肝素钠溶液A，调节ph值为5，用孔径为0.45微米的微孔滤膜过滤；
(3)用Q Bestarose XL离子交换树脂填装离子交换柱，然后用2倍柱体积的0.6molNaCl溶液洗涤平衡，然后再用0.15molNaCl溶液洗涤5倍柱体积量平衡；
(4)将过滤后的低分子量肝素钠溶液A上样，上样量为2倍柱体积，注意上样时避免气泡产生；
(5)加入4倍柱体积的0.6molNaCl溶液清洗；
(6)加入3倍柱体积的0.15molNaCl溶液，收集清洗液以备他用；
(7)加入4倍柱体积的1.2molNaCl溶液；
(8)收集第(7)步所得洗涤液和溶液，然后进行纳滤，纳滤膜选择分子量1000Da以下的规格，加入4倍体积的纯化水对药液进行洗涤，去除过低分子量的低分子量肝素片段和氯化钠等小分子无机盐，然后将药液浓缩至预估药液浓度为5％w/v以上，停止浓缩，将药液进行除菌过滤后转移至冻干机冻干即可。
实施例五
一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，包括如下步骤：
(1)肝素钠用水溶解，使成10％W/V，调节ph值至3，呈酸性，加入用水溶解好的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠总量为肝素钠质量的2.5％，搅拌1.2小时，然后调节ph值至8，呈弱碱性，按照肝素钠质量的2％加入硼氢化钠，再搅拌5小时，得到低分子量肝素钠溶液A；
(2)取第(1)步所得低分子量肝素钠溶液A，调节ph值为7，用孔径为0.3微米的微孔滤膜过滤；
(3)用Q Bestarose XL离子交换树脂填装离子交换柱，然后用3倍柱体积的0.6molNaCl溶液洗涤平衡，然后再用0.15molNaCl溶液洗涤4倍柱体积量平衡；
(4)将过滤后的低分子量肝素钠溶液A上样，上样量为3倍柱体积，注意上样时避免气泡产生；
(5)加入3倍柱体积的0.6molNaCl溶液清洗；
(6)加入5倍柱体积的0.15molNaCl溶液，收集清洗液以备他用；
(7)加入4倍柱体积的1.2molNaCl溶液；
(8)收集第(7)步所得洗涤液和溶液，然后进行纳滤，纳滤膜选择分子量1000Da以下的规格，加入5倍体积的纯化水对药液进行洗涤，去除过低分子量的低分子量肝素片段和氯化钠等小分子无机盐，然后将药液浓缩至预估药液浓度为5％w/v以上，停止浓缩，将药液进行除菌过滤后转移至冻干机冻干即可。
实施例六
一种无有机溶剂残留的低分子量肝素钠生产工艺，包括如下步骤：
(1)肝素钠用水溶解，使成8％W/V，调节ph值至2.5，呈酸性，加入用水溶解好的亚硝酸钠溶液，亚硝酸钠总量为肝素钠质量的2.8％，搅拌1.3小时，然后调节ph值至9，呈弱碱性，按照肝素钠质量的1％加入硼氢化钠，再搅拌6小时，得到低分子量肝素钠溶液A；
(2)取第(1)步所得低分子量肝素钠溶液A，调节ph值为8，用孔径为0.35微米的微孔滤膜过滤；
(3)用Q Bestarose XL离子交换树脂填装离子交换柱，然后用2.5倍柱体积的0.6molNaCl溶液洗涤平衡，然后再用0.15molNaCl溶液洗涤3.5倍柱体积量平衡；
(4)将过滤后的低分子量肝素钠溶液A上样，上样量为2.4倍柱体积，注意上样时避免气泡产生；
(5)加入3.5倍柱体积的0.6molNaCl溶液清洗；
(6)加入6倍柱体积的0.15molNaCl溶液，收集清洗液以备他用；
(7)加入2.8倍柱体积的1.2molNaCl溶液；
(8)收集第(7)步所得洗涤液和溶液，然后进行纳滤，纳滤膜选择分子量1000Da以下的规格，加入4.5倍体积的纯化水对药液进行洗涤，去除过低分子量的低分子量肝素片段和氯化钠等小分子无机盐，然后将药液浓缩至预估药液浓度为5％w/v以上，停止浓缩，将药液进行除菌过滤后转移至冻干机冻干即可。
以上实施例中的Q Bestarose XL离子交换树脂可以用HiTrapQHP离子交换树脂代替。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
本发明所述工艺的第(1)步可以使得在加入硼氢化钠搅拌后，去掉再调ph值至3—5的过程(调低Ph值是为了使过量的硼氢化钠分解)，本发明所述工艺含有洗涤和纳滤部分，可以实现去除过量的硼氢化钠目的，而且去除更加彻底。
经过此工艺生产出的低分子量肝素钠具有稳定的操作性，极强的重现性，下表为生产一组低分子量肝素钠的检测结果。
从上表可知，低分子量肝素钠的重均分子量为5600～6400，分子量小于3000≤13.0％，分子量大于8000的为15.0～25.0％。
经过冻干产品的最终检测，按照欧洲药典8.0版关于达肝素钠标准项下乙醇残留项检验，无检出。
本发明的有益效果和关键技术点如下：
1.离子交换树脂吸附低分子量肝素溶液A。
2.先用低浓度的氯化钠溶液洗涤，可以洗掉小片段的超低分子量肝素钠、亚硝酸钠和其他杂质游(离硫酸基(反应产物))等。
3.再用稍高浓度的氯化钠溶液洗脱掉分子量小于3000Da的小分子肝素钠片段。
4.然后用高浓度的氯化钠溶液全部洗脱掉低分子量肝素钠。
5.再用纳滤膜浓缩以上溶液，在此过程中，在此过程中，实现了溶液脱盐、进一步去除小分子杂质和浓缩低分子量肝素钠。
6.更重要的是，整个生产过程没有使用有机溶剂，避免了有机溶剂残留对低分子量肝素钠的污染。
本技术的实施能有效防止有机溶剂残留对低分子量肝素钠的污染，是一种全新的绿色生产工艺。
该工艺使用阴离子交换树脂吸附低分子量肝素钠，并在离子交换柱上通过不同浓度的氯化钠溶液分别洗去超小分子量的低分子量肝素钠和氧化剂(亚硝酸钠)、游离硫酸基(反应产物)等杂质、低于3000Da的低分子量肝素钠部分，最后再用高浓度氯化钠溶液洗脱掉低分子量肝素钠。
从离子交换柱洗脱下来的低分子量肝素钠溶液含有氯化钠，并且低分子量肝素钠的浓度较低，不适合直接干燥，所以要用纳滤膜脱盐、浓缩，使其基本无盐的残留，并且低分子量肝素钠浓度在5％以上，然后再冻干。
使用本发明所述工艺生产的低分子量肝素钠无有机溶剂残留，生产过程非常易于控制，每个工艺步骤均意义明确，收率高，质量好。