三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用的制作方法

技术特征：

1.一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，其特征在于，在pcDNA^TM6.2-GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用。

2.权利要求1所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体在制备用于治疗癌症药物中的应用。

3.权利要求1所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)通过引物miRNA-1F、1R扩增miRNA-1表达框，采用凝胶回收PCR产物，目标载体采用pSilence4.1-CMV/neo载体和miRNA-1表达框PCR回收产物分别采用EcoRI和NheI酶切，连接PCR产物至酶切好的pSilence4.1-CMV/neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo中间载体；

2)通过引物miRNA-2F、2R扩增miRNA-2表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo和miRNA-2表达框PCR回收产物分别采用KpnI和HindIII酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo中间载体；

3)通过引物miRNA-3F、3R扩增miRNA-3表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo和miRNA-3表达框PCR回收产物分别采用KpnI和NheI酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-Tri-miRNA/GFP-Neo载体。

4.根据权利要求3所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，其特征在于，miRNA-1F：CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-1R：CCGATGCATGCTACGACTCACTATAGGGGATGCT；miRNA-2F：CCGTGTAAAACGACGGCCAGTGTTGACATTGATTATTGAC；miRNA-2R：CCGCAGGAAACAGCTATGACCTACGACTCACTATAGGGG；miRNA-3F:CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-3R:CCGTACGACTCACTATAGGGGATGCT。