本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种肠道病毒属病毒筛查和分型的引物及检测方法。
背景技术：
近年来，由肠道病毒感染爆发人传染病流行常有报道，已经成为重要的公共卫生问题；肠道病毒(Enterovirus)属于微小RNA病毒科(Picornaviridae)K属，已知有64种血清型会感染人体，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和一些新型肠道病毒和甲型肝炎病毒等。比如1998年台湾地区爆发了由肠道病毒71型(EV71)感染的手足口病和疱疹性咽呷炎流行，感染人数超过10万，几百人因并发脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿和出血、急性弛缓性麻痹和心肌炎而死亡。目前在无菌性脑膜炎的致病因子中HEV约占80％～92％。近年还有一些研究表明糖尿病也与肠道病毒有关。病人和感染动物所携带的肠道病毒会通过粪便污染水环境、食物和土壤进行传报播，因此加强排泄物和外环境样品监测，是开展肠道病毒风险评估和采取有效控制手段的重要依据。
现有的肠道病毒的检测技术，主要有两类：一个是传统的生物学方法，如细胞培养法，该方法成本高、费时、操作繁琐、易污染，作为病原体的快速筛查手段不是很理想；另一个是以PCR技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，但是现有的PCR及其衍生技术，通常为采用特定病毒种类的引物，对于未知型别的病毒易漏检。近来也有一些摸索通用引物对于肠道病毒检测的报道，所采用的引物设计区域为5`端非编码区域，该区域高度保守无法用于病毒分型。另外，普通PCR技术对于低病毒含量的样品灵敏度不够容易造成假阴性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肠道病毒属病毒筛查和分型的引物及检测方法，旨在解决现有的肠道病毒的检测技术存在成本高、费时、操作繁琐、易污染，对于未知型别的病毒易漏检，无法用于病毒分型，样品灵敏度不够容易造成假阴性的问题。
本发明是这样实现的，一种肠道病毒属病毒筛查和分型的引物，所述肠道病毒属病毒筛查和分型的引物的序列包括：CODEHOP外引物序列和CODEHOP内引物序列以及20种病毒的引物序列；
CODEHOP外引物序列SEQ ID NO：1；
CODEHOP内引物序列SEQ ID NO：2；
Enterovirus 71引物序列SEQ ID NO：3；
Enterovirus B84引物序列SEQ ID NO：4；
Enterovirus D68引物序列SEQ ID NO：5；
Echovirus E6引物序列SEQ ID NO：6；
Coxsackievirus A16引物序列SEQ ID NO：7；
Coxsackievirus A8引物序列SEQ ID NO：8；
Coxsackievirus B2引物序列SEQ ID NO：9；
Coxsackievirus B3引物序列SEQ ID NO：10；
Coxsackievirus A12引物序列SEQ ID NO：11；
Coxsackievirus_B4引物序列SEQ ID NO：12；
Coxsackievirus A6引物序列SEQ ID NO：13；
Coxsackievirus A4引物序列SEQ ID NO：14；
Coxsackievirus A24引物序列SEQ ID NO：15；
Coxsackievirus A10引物序列SEQ ID NO：16；
Human poliovirus 1引物序列SEQ ID NO：17；
Rhinovirus C引物序列SEQ ID NO：18；
Human echovirus 19引物序列SEQ ID NO：19；
Human enterovirus 70引物序列SEQ ID NO：20；
Porcine enterovirus 9引物序列SEQ ID NO：21；
Possum enterovirus W1引物序列SEQ ID NO：22。
本发明的另一目的在于提供一种所述肠道病毒属病毒筛查和分型的引物的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
步骤一，RNA的提取：使用RNA提取试剂盒提取RNA；
步骤二，第一步RT-PCR反应：采用一步法RT-PCR试剂盒进行反应，反应体系为50μL,RNase Free Water 19μL，5×RT-PCR Buffer 10μL，10mM dNTP Mixture 2μL，Enzyme Mix 2μL，Ribonuclease Inhibitor 1μL，20μM上游CODEHOP外引物2μL，下游CODEHOP外引物4μL，RNA模板10μL。反应程序为60℃1min，42℃10min，50℃30min，95℃15min反转录结束后，94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环，72℃7min，PCR产物4℃保存，作为巢式PCR模板。
步骤三，巢式PCR：20μL的反应体系，10×PCR扩增缓冲液2μl，25mmol/L的MgCl21.2μl，10mmol/L dNTPs 0.4μl，20μmol/L CODEHOP上下游内引物或分型引物各0.4μl，5U/μl Taq聚合酶0.4μl，一步RT-PCR反应产物模板1μl，无菌双蒸水补足体积至20μl。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；
步骤四，用1.5％浓度琼脂糖凝胶电泳，判定肠道病毒阳性和分型结果。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述肠道病毒属病毒筛查和分型的引物的排泄物中肠道病毒群各种型别病毒筛查及主要基因型别检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述肠道病毒属病毒筛查和分型的引物的水中肠道病毒群各种型别病毒筛查及主要基因型别检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述肠道病毒属病毒筛查和分型的引物的土壤中肠道病毒群各种型别病毒筛查及主要基因型别检测方法。
本发明提供的肠道病毒属病毒筛查和分型的引物及检测方法，公开了一种 快速检测外环境样品包括排泄物、水、土壤中肠道病毒群各种型别病毒筛查及主要基因型别检测的方法；通过依据肠道病毒属各种病毒共有的蛋白质氨基酸序列设计肠道病毒属一致-简并引物，并在该引物扩增片段内部，设计了一对短片段的一致-简并引物和20种不同肠道病毒的分型引物，结合巢式RT-PCR技术技术，建立了可用于肠道病毒属的不同基因型病毒筛查和分型的简并引物巢式RT-PCR方法，具有灵敏度高、特异性强，适用于低病毒含量样品的肠道病毒监测和种类鉴定的特点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的肠道病毒属病毒筛查和分型的引物的检测方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的肠道病毒属病毒筛查和分型的引物的序列包括：CODEHOP外引物序列和CODEHOP内引物序列以及20种病毒的引物序列。
CODEHOP外引物序列SEQ ID NO：1：
E4559：CAGATCCAGATCATTTTGATGGATAYRANCARCA
FE5803：CATTGTCCTGCTCTTGTTGGAWARTTRTAYWT
CODEHOP内引物序列SEQ ID NO：2:
E4559：CAGATCCAGATCATTTTGATGGATAYRANCARCA
FE4937：TGTTCTTCTATCCATAAATTGAATTGCYTTNCCRCANA
病毒基因型别
Enterovirus 71引物序列SEQ ID NO：3：
ACAGGTGGTTACAGTGATG
TTAGTGGATGCGATGACAA
Enterovirus B84引物序列SEQ ID NO：4：
TCAATCAACGCACCAACT
GCAGCATTCTTCATCACAA
Enterovirus D68引物序列SEQ ID NO：5：
GACTGATACAAACTTAGAGATAA
ACTGGGATATACATATTTGG
Echovirus E6引物序列SEQ ID NO：6：
AAGCCGTCGTGATTATGG
AGGAGAGGTGAACAGGATT
Coxsackievirus A16引物序列SEQ ID NO：7：TAGGAGGAACATCAGACAAG
CCAACTCAACAGCATCTAAG
Coxsackievirus A8引物序列SEQ ID NO：8：
GGCTATCCAACTAAGAGACA
CTACAATACTGACGCACTTC
Coxsackievirus B2引物序列SEQ ID NO：9：
GGTCCATCAATGCTCCAA
CTCGTCGTCACAAGTCTT
Coxsackievirus B3引物序列SEQ ID NO：10：
CTTGTGACGATGAGTGTTG
GAGTATCTGACCTGTGTTCT
Coxsackievirus A12引物序列SEQ ID NO：11：
ACCAACGCCAGTAACATC
GTCCACACTATACCTAACCTT
Coxsackievirus_B4引物序列SEQ ID NO：12：
GTCCTAGCATCAACCAAC
TGGACAACACTCTTCATC
Coxsackievirus A6引物序列SEQ ID NO：13：
TGTGCTGATCATGCAATC
GTGCGGAGAATAGGTTTC
Coxsackievirus A4引物序列SEQ ID NO：14：
CTGAGGAGGAACATTAGG
GAGTGATCAAAGTCAACTC
Coxsackievirus A24引物序列SEQ ID NO：15：
CGATGGCAAGGAAGTTGA
CACCGACAGGAACATACAT
Coxsackievirus A10引物序列SEQ ID NO：16：
AAGGCGTATCATTCACATCT
CTTGTAAGAGTCAGTCACTTC
Human poliovirus 1引物序列SEQ ID NO：17：
GAGACATTAGACCACATATAC
CCCACCGAGATTTAGATA
Rhinovirus C引物序列SEQ ID NO：18：
CCACAATAACTATTCCAGAGG
GCCTTGCTTCTTCTATCTTG
Human echovirus 19引物序列SEQ ID NO：19：
CCACATTCGTGTCAGTAG
TCACCATACTCGGTCTTC
Human enterovirus 70引物序列SEQ ID NO：20：
CGACCTATTGAGATCCATA
CGCTATAAAGGCTCTACTA
Porcine enterovirus 9引物序列SEQ ID NO：21：
CTCCATTGATACCATGATC
GAGTCTTACATAACAGAGC
Possum enterovirus W1引物序列SEQ ID NO：22：
CCACTTTGATACTGTAATTG
CAGTGATCATTGTGTCAA
如图1所示，本发明实施例的肠道病毒属病毒筛查和分型的检测方法包括以下步骤：
S101：RNA的提取：使用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取RNA，方法参照试剂盒说明书；
S102：一步RT-PCR：反应体系(50μl)：RNase free water 20.2μl，5×RT-PCR Buffer 10μl，10mmol/L dNTP mixture 2μl，Enzyme Mix 2μl，Ribonuclease inhibitor 1μl，20μmol/L上下游CODEHOPE引物各为2.4μl，RNA模板10μl。反应程序：60℃1min，42℃10min，50℃30min，95℃15min。反转录结束后94℃30s，52℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃7min，PCR产物4℃保存；
S103：巢式PCR：20μL的反应体系，Mg2+终浓度为1.5mM，内引物和分型终浓度为1.0μM，dNTP终浓度为0.2mM，Taq酶终浓度0.1U/μL，2.5μL buffer10×，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；
S104：用1.5％浓度琼脂糖凝胶电泳，判定肠道病毒阳性和分型结果。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1：阳性病人粪便样品中肠道病毒群的筛查和分型
(1)：粪便样品RNA提取：
从宁波市疾控中心获得30份肠道病毒感染阳性病人粪便样品，取约50mg，匀浆后用RNA提取试剂盒肺组织进行RT-PCR检测。
(2)第一步RT-PCR反应：采用一步法RT-PCR试剂盒进行反应，反应体系为50μL,RNase Free Water 19μL，5×RT-PCR Buffer 10μL，10mM dNTP Mixture 2μL，Enzyme Mix 2μL，Ribonuclease Inhibitor 1μL，20μM上游CODEHOP外引物2μL，下游CODEHOP外引物4μL，RNA模板10μL。反应程序为60℃1min，42℃10min，50℃30min，95℃15min反转录结束后，94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环，72℃7min，PCR产物4℃保存，作为巢式PCR模板。
(3)巢式PCR反应：20μL的反应体系，10×PCR扩增缓冲液2μl，25mmol/L的MgCl21.2μl，10mmol/L dNTPs 0.4μl，20μmol/L CODEHOP上下游内引物或分型引物各0.4μl，5U/μl Taq聚合酶0.4μl，一步RT-PCR反应产物模板1μl，无菌双蒸水补足体积至20μl。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。
(4)用1.5％浓度琼脂糖凝胶电泳，判定肠道病毒阳性和分型结果。结果显示30份样品经CODEHOP内引物扩增后均在416bp附近获得特异性条带，其中13份样品经Enterovirus71分型引物扩增在162bp附近获得特异性条带；10份样品经Coxsackievirus A16分型引物扩增在155bp附近获得特异性条带；3份样品经Coxsackievirus A10分型引物扩增在140bp附近获得特异性条带；2份样品经Coxsackievirus A8分型引物扩增在237bp附近获得特异性条带；1份样品经Coxsackievirus B1分型引物扩增在190bp附近获得特异性条带；1份样品经Coxsackievirus B4分型引物扩增在174bp附近获得特异性条带。将扩增产物送上海英俊测序，序列结果如下表所示，序列比对后确定病毒种类与分型引物结果一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。