本发明涉及化合物萃取及分离纯化领域，具体而言，涉及一种三唑类农药分子印迹聚合物微球，固相萃取柱及其应用。
背景技术：
三唑类农药自20世纪70年代出现以来在防治病虫害方面已经显示出巨大的潜力。三唑类农药以杀菌剂为主，普遍具有高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强等特点。此外三唑类作为植物生长调节剂在国内外有广泛的应用，特别是多效唑的应用。
三唑类农药在土壤中的残留时间一般较长，其代谢主要依靠光解和微生物降解。虽然三唑类农药低毒、低残留，对人畜较为安全，但如果在农产品中滥用和过量施用，不仅会使病虫害抗药性日趋严重，同时会产生其在农产品和环境中的高残留问题，威胁食品安全和人类生命健康。
目前三唑类农药残留的主要检测方法是液相色谱及其联用技术。但由于其残留浓度低，前处理繁琐和基体干扰大，严重限制了常规快速检测方法和仪器分析方法对样品中该类农药残留的有效检测。另外，传统的QuEChERS等前处理方法的选择能力较差，在富集分析物的同时，大量基体和干扰物质也被富集，导致洗脱液中仍含有基体和杂质，干扰最后的色谱分析。因此，探索一种集样品前处理技术和高灵敏度的快速检测为一体的新方法，对于提高农产品中农药残留检测灵敏度和准确性十分必要。
分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是一种人工理性设计制备的特定分子识别材料，它的高效识别性对复杂样品基质中的目标分子有很好的选择富集作用。除了预定性、识别性和实用性三大特点外，还具有制备简单、成本低、模板分子可回收重复利用等特点，因此非常适合作为选择吸附剂。同时与生物抗体相比，表现出高度的稳定性，具有抗恶劣环境的能力。因此其在手性分离、固相萃取、化学与生物传感器、模拟酶催化、膜分离等领域得到了广泛的应用。分子印迹聚合物的制备常采用沉淀聚合法，和本体聚合相比，减少研磨步骤操作简便，同时聚合物形状更加规则，呈现均匀球状。
关于三唑类化合物的分子印迹聚合物及其MISPE方法的文献报道尚不多见，如彭畅(2009)等采用邻硝基苯酚为替代模板，4-乙烯基吡啶为功能单体，合成了对7种三唑类化合物具有特异性吸附的印迹聚合物，并应用于土壤样品的分析中；胡艳云(2014)等以三唑酮为模板分子，三氟甲基丙烯酸为功能单体，合成了对20种三唑类农药具有高选择性的MIP材料，建立了对莲藕、梨、胡萝卜样品中20种三唑类农药分子印迹固相萃取技术。
这些方法均采用传统的本体聚合方法，需要研磨过筛，其聚合物存在着吸附均一性差，类特异性识别能力弱等缺点，同时由于功能单体的差异，上述合成的聚合物因亲水性能差不能萃取水含量多的蔬果基质，也不适用于三唑类农药中使用最广的多效唑和烯效唑等药物的富集与萃取。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种三唑类农药分子印迹聚合物微球，所述的分子印迹聚合物微球可以实现对三唑类农药进行的专一性识别、分离、富集和纯化；利用该三唑类农药分子印迹聚合物微球作为填料可制成固相萃取柱，本发明还提供了所述的固相萃取柱在检测三唑类农药中的应用。
本发明还提供了一种所述三唑类农药分子印迹聚合物微球的制备方法，此方法制备的MIP对印迹分子有良好的选择性和识别特性，操作条件简单，便于普及。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种三唑类农药分子印迹聚合物微球，所述分子印迹聚合物微球以三唑酮为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂在惰性溶剂中反应后脱除模板分子而得到。
可选的，所述惰性溶剂为乙腈。
本发明通过选择三唑酮为模板分子，合成了具有高度“类”特异性、选择性的分子印迹聚合物微球(MIP)，同时可由此实现对三唑类农药的检测。
功能单体的选择对于分子印迹聚合物的吸附性能有很大影响，需要根据模板分子的结构和基本性质进行选择。本发明选用了甲基丙烯酸(MAA)作为功能单体，可非常好的提高合物对模板分子的识别作用。
为了使生成的印迹聚合物具有一定的空间网络结构和稳定的结合位点，分子印迹聚合物要求的交联度很高。本发明所优选的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)具有较高的交联度(70～90％)，且在预聚合溶液中具有良好的溶解性。
在分子印迹聚合反应中多为自由基引发反应，因此在反应时需加入引发剂引发聚合反应，本发明优选偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂。偶氮二异丁腈是油溶性的偶氮引发剂，偶氮类引发剂反应稳定，是一级反应，没有副反应，比较好控制。
致孔剂实际也起着溶剂的作用。溶剂的选择在分子印迹制备中发挥着重要作用，对分子间的作用力和MD的形态影响很大，且起着致孔剂的作用。通常选择的溶剂要具备以下3个条件：1)、能溶解模板分子和功能单体；2)、能形成大的流通孔；3)、对模板分子与功能单体之间的相互作用干扰小。一般根据印迹分子与功能单体间可能的作用力类型选择适宜极性的溶剂，溶剂的极性越大，对分子识别的干扰也就越大，吸附率就越低。本发明所采用的乙腈极性小，介电常数低，同时对几种反应物的溶解性也非常好。
可选的，如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球，所述三唑酮与所述甲基丙烯酸的摩尔比为1:(5～7)。
可选的，如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球，所述微球的粒径≤2μm。
如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球的制备方法，包括：
将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中，随后通惰性气体除氧，热引发聚合反应，再经洗脱以及干燥后即得。
本发明的聚合方法为沉淀聚合法，特点是得到的产物粒径比较均一，比表面积大，具有更多的识别位点，因而具有更优秀的吸附性能。
可选的，如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球的制备方法，将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中时，先将所述模板分子以及功能单体溶解在惰性溶剂中并预聚合25～35min后，再加入所述交联剂和引发剂。
可选的，如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球的制备方法，所述热引发聚合反应的反应条件为55～65℃聚合反应22～26h。
一种固相萃取柱，所述固相萃取柱以如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球为填料。
如上的固相萃取柱在检测三唑类农药中的应用。
可选的，如上所述的应用，所述三唑类农药的种类包括杀菌剂和植物生长调节剂；
可选的，所述杀菌剂包括多效唑和/或烯效唑；
可选的，所述植物生长调节剂包括叶菌唑、三唑酮、联苯三唑醇、烯唑醇、三唑醇、己唑醇、环丙唑醇、戊唑醇、糠菌唑、苯醚甲环唑、氟环唑、腈苯唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、四氟醚唑、氟菌唑及苄氯三唑醇中的一种或多种。
为表述方便，以下将固相萃取柱简称为SPE，将填充有三唑类农药分子印迹聚合物微球的固相萃取柱简称为MISPE柱。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、首次将甲基丙烯酸(MAA)做为功能单体，采用沉淀聚合法制备三唑类农药分子印迹聚合物，以此聚合物为填料制成的MISPE柱，解决了传统固相萃取柱的吸附普遍性、洗脱复杂性、无法重复使用的缺点，实现了分子印迹聚合物和固相萃取柱的技术集成。
2)、吸附类特异性，由于SPE常用的吸附剂主要选择性较差，在富集分析物的同时，大量基体和干扰物质也被富集，导致洗脱液中仍含有基体和杂质，干扰最后的色谱分析。同时，市场上的MISPE柱只能特异性吸附一种物质，而当前研制的固相萃取小柱，具有能高度的选择性和吸附性以及类特异性，实现了以分子印迹聚合物同时吸附和富集多种同类药物的固相萃取技术的应用。
3)、方便快捷，采用MISPE柱进行样品前处理，步骤简单，且分离、富集、净化效果好。
4)、环保，MISPE柱前处理技术有机溶剂使用量少，符合当前环保的要求。
5)、回收利用，在MIP的制备中使用的模板分子可以回收利用，减少成本。
6)、本发明通过对溶剂、功能单体、交联剂、引发剂的种类和用量进行选择，优化聚合条件，制得具有更好的粒径分布、物理稳定性、优良的吸附性能的分子印迹聚合物，能够选择性识别与模板分子结构类似的20种三唑类农药，具有良好的“类”特异性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种三唑类农药分子印迹聚合物微球，所述分子印迹聚合物微球以三唑酮为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂在惰性溶剂中反应后脱除模板分子而得到。
基于MIPs以上特点和三唑类农药检测的实际需要，采用沉淀聚合法，合成了具有高度“类”特异性、选择性的分子印迹聚合物微球，并以此为填料开发出适用于特异性吸附三唑类农药的MISPE通用小柱，实现了对20种三唑类农药的多残留高效富集和检测。
截至目前，尚未见以三唑酮为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙腈为溶剂，AIBN为引发剂，TRIM为交联剂制备三唑类农药MISPE柱的报道。
因此，本发明三唑酮为模板，MAA为功能单体，乙腈为溶剂，AIBN为引发剂以及TRIM为交联剂，采用沉淀聚合法合成对多种三唑类农药有较高吸附性能的MIP，以此MIP作为填料制成的MISPE柱对可用于样品中痕量三唑类农药的检测，其方法简便快捷，回收率高。此方法是将固相萃取柱的方便和分子印迹聚合物的特异性结合起来达到样品前处理快速、简便的目的。
优选的，所述惰性溶剂包括甲苯、二氯甲烷、乙腈、氯仿中的一种或多种；更优选的，所述惰性溶剂为乙腈。
优选的，如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球，所述三唑酮与所述甲基丙烯酸的摩尔比为1:(5～7)；更优选的，所述三唑酮与所述甲基丙烯酸的摩尔比为1:6；
进一步优选的，所述模板分子中三唑酮在所述惰性溶剂中的浓度为0.05mmol～0.15mmol，更优选为0.1mmol；所述甲基丙烯酸在所述惰性溶剂中的浓度为0.3mmol～0.9mmol，更优选为0.6mmol。
优选的，所述三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯在所述惰性溶剂中的浓度为0.6mmol～1.4mmol，更优选为1.0mmol。
优选的，所述微球的粒径≤2μm；更优选的粒径≤1μm；更优选的粒径≤0.5μm。
本领域技术人员可根据本发明提供的分子印迹聚合物、模板分子、功能单体、交联剂种类选用本体聚合法、沉淀聚合法、悬浮聚合法、电聚合法；最优选的，采用沉淀聚合法，该方法包括：
将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中，随后通惰性气体除氧，热引发聚合反应，再经洗脱以及干燥后即得；
优选的，所述惰性气体为氮气。
优选的，如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球的制备方法，将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中时，先将所述模板分子以及功能单体溶解在惰性溶剂中并预聚合25～35min后，再加入所述交联剂和引发剂；进一步优选的，所述预聚合时，反应的条件为室温下，在震荡器中震荡25～35min，所述震荡器的振荡频率为200转/分。
优选的，所述热引发聚合反应的反应条件为55～65℃聚合反应22～26h。
一种固相萃取柱，所述固相萃取柱以如上所述的三唑类农药分子印迹聚合物微球为填料。
优选的，所述三唑类农药分子印迹聚合物微球填充在固相萃取柱内时填充量为5mg～50mg，更优选的为20mg～40mg。
如上所述的固相萃取柱在检测三唑类农药中的应用。
优选的，如上所述的应用，所述三唑类农药的种类包括杀菌剂和植物生长调节剂；
更优选的，所述杀菌剂包括多效唑和/或烯效唑；
更优选的，所述植物生长调节剂包括叶菌唑、三唑酮、联苯三唑醇、烯唑醇、三唑醇、己唑醇、环丙唑醇、戊唑醇、糠菌唑、苯醚甲环唑、氟环唑、腈苯唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、四氟醚唑、氟菌唑及苄氯三唑醇中的一种或多种。
优选的，如上所述的应用，其检测三唑类农药时的具体操作包括：
使用乙腈和水活化MISPE柱后，将待测物预处理后过固相萃取柱，随后用体积百分数为15％～25％的乙腈的水溶液淋洗，再用乙腈洗脱，收集洗脱液，氮气吹干供检测；优选的，所述检测的方法为LC-MS/MS。
实施例1
A)、将0.0145g三唑酮模板分子(0.05mmol)和0.07mL甲基丙烯酸(0.35mmol)溶于20mL乙腈中，在震荡器中震荡预作用25min；
B)、模板分子和甲基丙烯酸预聚合后，向A)中的混合液中加入0.1824mL TRIM(终浓度0.6mmol)和30.0mg AIBN充分混匀。充氮气除氧之后密封；
C)、55℃恒温水浴加热26h，冷却、离心、过筛，弃去上清液，得到沉淀物，再将沉淀物自然干燥；
D)、用乙酸和甲醇体积比为1:9的混合溶液洗脱除去残余的单体和交联剂等物质，再用甲醇洗涤5h去除乙酸，直至用高效液相色谱检测不到三唑酮；
将洗脱去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到三唑类农药分子印迹聚合物微球，其为白色，粒径≤2μm；
E)、称取30mg聚合物均匀装填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
实施例2
A)、将0.0435g三唑酮模板分子(0.15mmol)和0.15mL甲基丙烯酸(0.75mmol)溶于20mL乙腈中，在震荡器中震荡预作用35min；
B)、模板分子和甲基丙烯酸预聚合后，向A)中的混合液中加入0.4256mL TRIM(终浓度1.4mmol)和30.0mg AIBN充分混匀。充氮气除氧之后密封；
C)、65℃恒温水浴加热22h，冷却、离心、过筛，弃去上清液，得到沉淀物，再将沉淀物自然干燥；
D)、用乙酸和甲醇体积比为1:9的混合溶液洗脱除去残余的单体和交联剂等物质，再用甲醇洗涤5h去除乙酸，直至用高效液相色谱检测不到三唑酮；
将洗脱去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到三唑类农药分子印迹聚合物微球，其为白色，粒径≤2μm；
E)、称取30mg聚合物均匀装填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
实施例3
A)、将0.029g三唑酮模板分子(0.1mmol)和0.12mL甲基丙烯酸(0.6mmol)溶于20mL乙腈中，在震荡器中震荡预作用30min；
B)、模板分子和甲基丙烯酸预聚合后，向A)中的混合液中加入0.304mL TRIM(终浓度1.0mmol)和30.0mg AIBN充分混匀。充氮气除氧之后密封；
C)、60℃恒温水浴加热24h，冷却、离心、过筛，弃去上清液，得到沉淀物，再将沉淀物自然干燥；
D)、用乙酸和甲醇体积比为1:9的混合溶液洗脱除去残余的单体和交联剂等物质，再用甲醇洗涤5h去除乙酸，直至用高效液相色谱检测不到三唑酮；
将洗脱去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到三唑类农药分子印迹聚合物微球，其为白色，粒径≤2μm；
E)、称取30mg聚合物均匀装填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
实验例
取实施例3制备得到的MISPE柱事先用3mL乙腈、1mL水活化，随后每个MISPE柱量取添加浓度为1μg/kg、2μg/kg和10μg/kg的20种三唑类农药葡萄提取样；
每个MISPE柱用1mL体积百分数为20％的乙腈的水溶液淋洗去除杂质，再用3mL乙腈洗脱，收集洗脱液，氮气吹干至1mL，采用LC-MS/MS检测。
其中，20种三唑类农药分子印迹固相萃取柱的吸附性如表1所示：
表1 20种三唑类农药分子印迹固相萃取柱的回收率和精密度值
为更好地说明本申请的效果，申请人根据胡艳云等(分子印迹固相萃取·液相色谱-质谱法测定果蔬中20种三唑类农药残留，2014年2月，分析化学研究报告第42卷第2期，227～232)文章中记载的方法合成了相应的MIP并制备成MISPE小柱作为对比例，每个小柱中同样称取30mg聚合物，实验条件与操作均与对比例文章中记载的相同。实验结果如表2所示：
表2 对比例20种三唑类农药分子印迹固相萃取柱的回收率和精密度值
本发明采用沉淀聚合技术，以三唑酮为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂构成的新型聚合体系中获得了对多效唑等20种常用三唑类农药具有类特异性吸附能力的分子印迹聚合物微球，实现了适用于葡萄等多种蔬果样品中20种三唑类农药的高效富集、萃取与分离，解决了分子印迹聚合物技术不能特异性识别多效唑等三唑类农药的技术难题。
从以上结果可知，对比例方法制备的大部分MIP在进行葡萄中的三唑类农药残留检测时，在回收率与RSD上与本申请效果无明显区别，但在多效唑、烯效唑及苄氯三唑醇的检测上存在显著的差异。而多效唑、烯效唑为现在非常常用的三唑类农药分子。这种差异的产生一方面可能是由于不同聚合物的制备方法制备的MIP的亲水性能差异较大，因而导致在水分含量较多是水果中(在这个例子中，即葡萄)使用效果发生了较大差异；另一方面，由于本申请采用MAA为功能单体，使得制备的MIP在偏酸性的环境下仍然具有优秀的吸附性能。
综上所述，本发明所提供的MIP及MISPE小柱，除可对含水量较低的果蔬进行检测外，还可针对高含水量的果蔬(如葡萄、西红柿、黄瓜、桃等)进行检测，且更对检测环境(如pH值)有较高的宽容度，因而具有更为广泛的应用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；为叙述方便，本发明仅在实验例中给出了最佳实施例3的效果，但实际上在本申请权利要求的记载范围内该效果均可实现，其中实施例1～2的实验数据(回收率和RSD)与实施例3的实验数据相比浮动不超过8％。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。