一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法与流程

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法。

背景技术：

体外抗菌试验是在体外测定微生物对某种物质的敏感程度的试验，常用于评价抑杀病原菌的活性，已广泛地应用与科研、生产和临床，如抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的测定、指导临床用药的药敏试验等。琼脂平板扩散法是目前最常用的方法之一。

传统的琼脂平板扩散法是将指示菌涂布于琼脂表面或均匀混入琼脂中，然后采用纸片法、牛津杯法、打孔法等方法加入待测物，让待测物在琼脂中扩散。由于琼脂无色透明、细菌无色半透明，导致细菌不生长的琼脂区域呈无色透明。若待测物有抗菌活性，其中的细菌等微生物生长受到抑制或杀灭，从而在药物有效浓度的范围内形成微生物不生长的透明圈a1(图1)，在光线较好的环境下辨别测量该透明圈a1的直径用于评价待测物有无抗菌活性及初步评价其活性大小。该透明圈称为抑菌圈，抑菌圈直径大小与抗菌物质浓度和指示菌浓度直接相关。

大量的临床应用研究表明，中药具有不可忽视的抗菌作用。随着临床抗生素应用中出现的耐药细菌问题日趋严重，抗菌中药的研究具有广阔的应用前景。目前中药的体外抗菌活性研究尚无标准化方法，琼脂平板扩散法作为国际通用的抗生素抗菌活性评价方法之一，也被广泛引用到包括中药在内的其他材料的抗菌活性测定中。然而，中药提取液性状特殊，其在琼脂平板中扩散现象不同于抗生素，中药体外抗菌试验不能完全照搬抗生素体外抗菌试验。中药提取液主要特点有：(1)色深混浊：药物扩散后导致琼脂中出现颜色较深及混浊的药物扩散圈，该圈与细菌不生长的透明圈重合，影响抑菌圈直径的测量，难以直观评价抗菌活性大小。如图2所示：琼脂平板上(01)(02)两孔中为色深混浊的黄芩水提液扩散抗菌现象，其中b1为深棕色中药扩散圈(内圈)，b2为浅棕色中药扩散圈(外圈)；(03)(04)两孔为无色澄清的抗生素头孢曲松钠扩散抗菌现象，其中b3为透明抑菌圈，可见：采用传统平板琼脂扩散法进行抗菌试验时，抗生素无色澄清，其药物扩散圈不掩盖透明抑菌圈易于测量，而中药色深混浊掩盖了透明抑菌圈，需仔细甚至无法观察细菌不生长区域导致难以辨别测量抑菌圈；(2)成分复杂：抗生素一般成分单一，其离扩散中心远近不同药物仅浓度不同而成分相同。但中药提取物等往往成分复杂，各成分扩散速度不同，离扩散中心远近位置不同的药物的浓度和成分均有不同，因此细菌不生长圈的大小不仅与药物浓度有关还与药物复杂的成分相关。

综上所述，传统的琼脂平板扩散试验在中药及与其性状相似的色深混浊及成分复杂的待测物的体外抗菌活性评价中尚存在弊端，寻找一种更加直观有效地指示其抗菌活性的体外抗菌方法对于抗菌物质的开发具有重要的应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，可分层显示色深混浊和成分复杂的中药提取物及性状相似的抗菌物质的体外抗菌活性，简便、直观、有效。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，是将含菌亚甲基蓝琼脂平板用于琼脂平板扩散法的体外抗菌活性试验。

优选地，所述体外抗菌活性试验的具体步骤如下：将待测物溶液加入到新鲜制备的含菌亚甲基蓝琼脂平板上，使其在琼脂中扩散，恒温培养，待指示菌和待测物作用后，观察并测量待测物周围蓝色圈或待测物自身颜色与蓝色的混合有色圈直径作为抑菌圈的直径，并观察抑菌圈颜色深浅，评价待测物体外抗菌活性。

优选地，所述含菌亚甲基蓝琼脂平板的制备方法如下：将斜面培养基活化生长6-8h的菌种制备成指示菌菌悬液，然后将指示菌菌悬液与灭菌后冷却至45℃融化的含有亚甲基蓝的药敏琼脂迅速混匀，冷却凝固，即得。

优选地，所述含菌亚甲蓝琼脂平板中亚甲基蓝的含量为：每100mL含菌亚甲基蓝琼脂中含有2mL的1％亚甲基蓝水溶液。

优选地，所述药敏琼脂为M-H琼脂培养基或其它适宜细菌生长的药敏琼脂。

优选地，所述待测物溶液加入含菌亚甲蓝琼脂平板中的方法采用打孔法、纸片法、牛津杯法中的任一种。

优选地，所述指示菌和待测物作用时间为18h。

评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法应用于无色澄清及成分单一的抗菌物质。

评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法应用于中药及性状相似的色深混浊及成分复杂的抗菌物质。

本发明的主要原理是：待测物在琼脂中扩散并作用于琼脂中的细菌，细菌生存状态影响含菌亚甲基蓝琼脂平板的颜色。亚甲基蓝的氧化态和还原态分别呈蓝色和无色。细菌培养前琼脂中的亚甲基蓝通常处于显蓝色的氧化态，因此亚甲基蓝含菌平板呈蓝色。待测物加入亚甲基蓝含菌平板恒温培养后，随着细菌的培养，亚甲基蓝进入细菌细胞内，生长中的细菌的还原酶使亚甲基蓝脱色由蓝色变还原态的无色，而被杀灭或者抑制处于静息状态的细菌的还原酶失活不产生脱色作用，因此亚甲基蓝仍为蓝色。可见，含菌亚甲基蓝琼脂平板中无色的区域为细菌生长区域，蓝色的区域为细菌死亡或被抑制的区域(且蓝色的深浅与细菌活性大小相关)。综合考虑扩散至琼脂中待测物颜色，蓝色以及蓝色与待测物颜色混合色的有色圈区域为抗菌区域，即抑菌圈；无色区域和仅为待测物颜色的区域为无抗菌区域。

本发明与传统琼脂平板扩散法相比，具有以下有益效果：

1、改善色深混浊对透明抑菌圈观察的影响：本发明通过蓝色直观显示待测物对细菌的抑杀作用，结合待测物溶液自身的颜色观察有色区域，综合评价抗菌作用大小，有效克服了传统琼脂平板扩散法中由于待测物溶液的颜色和混浊对透明抑菌圈观察的影响，可直观快速地评价抗菌作用；

2、改善成分复杂对待测物琼脂扩散的影响：中药及其他成分复杂的物质，其在琼脂中扩散时，不同成分扩散速度不同，本发明通过蓝色直观显示待测物所有成分的抗菌作用，对于具有多个抑菌成分的待测物，分层显示多个蓝色抑菌圈或蓝色和自身颜色的混合色抑菌圈，克服了传统琼脂平板扩散法中由于中药等待测物成分复杂，不同物质扩散位置不一的影响，可分层客观地综合评价成分复杂待测物总体的抗菌活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1传统琼脂平板扩散法抗生素的透明抑菌圈：a1-透明抑菌圈；

图2传统琼脂平板扩散法中药和抗生素抑菌现象：b1-深棕色中药扩散圈(内圈)，b2-浅棕色中药扩散圈(外圈)，b3-透明抑菌圈；

图3抗生素传统琼脂平板扩散法和亚甲基蓝琼脂平板扩散法结果比较：图3-a，传统琼脂平板扩散法，d1-透明抑菌圈；图3-b，亚甲基蓝琼脂平板扩散法，d2-蓝色抑菌圈；

图4中药水提液传统平板琼脂扩散法和亚甲基蓝琼脂平板扩散法方法结果对比：图4-a，艾叶水提液传统琼脂平板扩散法，e1-深棕色中药扩散圈(内圈)，e2-浅棕色中药扩散圈(外圈)；图4-b，艾叶水提液亚甲基蓝琼脂平板扩散法，e3-深绿色中药抑菌圈(内圈)，e4-浅绿色中药抑菌圈(外圈)；图4-c，赤芍水提液传统琼脂平板扩散法，e5-浅棕色中药扩散圈；4-d，赤芍水提液亚甲基蓝琼脂平板扩散法，e6-蓝绿色中药抑菌圈；

图5五味子和乌梅水提液亚甲基蓝琼脂扩散法抗菌试验结果：图5-a，五味子水提液抗肠炎沙门菌试验结果，f1-深蓝色中药抑菌圈(内圈)，f2-乳白色中药扩散圈(外圈)；图5-b，乌梅水提液抗肠炎沙门菌试验结果，f3-深蓝色中药抑菌圈(内圈)，f4-灰白色中药扩散圈(外圈)；图5-c，五味子水提液抗鼠伤寒沙门菌试验结果，f5-深蓝色中药抑菌圈(内圈)，f6-乳白色中药扩散圈(中圈)，f7-浅蓝色中药抑菌圈(外圈)；图5-d，乌梅水提液抗鼠伤寒沙门菌试验结果，f8-深蓝色中药抑菌圈(内圈)，f9-灰白色中药扩散圈(中圈)，f10-深蓝色中药抑菌圈(外圈)；

图6不同浓度的黄芩水提液亚甲基蓝琼脂平板扩散法抗菌试验：图6-a，0.5g/ml，g1-棕黄色中药扩散圈(内圈)，g2-绿色中药抑菌圈(中圈)，g3-深蓝色中药抑菌圈(外圈)；图6-b 0.25g/ml，g4-棕黄色中药扩散圈(内圈)，g5-绿色中药抑菌圈(中圈)，g6-浅蓝色中药抑菌圈(外圈)；图6-c 0.125g/ml，g7-棕黄色中药扩散圈(内圈)，g8-绿色中药抑菌圈(中圈)，g9-浅蓝色中药抑菌圈(外圈)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1、亚甲基蓝琼脂平板的制备

1.1制备指示菌菌悬液：将沙门菌接种普通斜面培养基活化生长6-8h。用接种环轻轻刮取斜面上的菌苔置于无菌生理盐水中，涡旋振荡器充分振荡并调整菌悬液浓度为0.5麦氏浊度。

1.2制备含菌亚甲基蓝琼脂平板：称取亚甲基蓝加蒸馏水制备成1％亚甲基蓝水溶液，灭菌后待用。M-H琼脂置三角烧瓶中灭菌后水浴锅恒温45℃，按每100ml含菌亚甲基蓝琼脂中加入2ml亚甲基蓝水溶液的比例加入灭菌的1％的亚甲基蓝水溶液后混匀置45℃恒温水浴待用。将0.5麦氏浊度细菌悬液按照每100ml琼脂加入6ml菌液的与45℃亚甲基蓝M-H琼脂充分混匀，缓慢倾注于灭菌平皿中(避免有气泡)，冷却凝固后制备成含菌亚甲基蓝琼脂平板待用(现配现用)。

2、对照试验：分别采用传统含菌琼脂平板和亚甲基蓝含菌琼脂平板进行体外抗菌试验

2.1抗生素体外抗菌对照试验

试验步骤：用直径6mm的打孔器分别在传统含菌琼脂平板和亚甲基蓝含菌琼脂平板上打孔，将抗生素水溶液加入孔中进行扩散，抗生素水溶液为5mg/ml头孢曲松钠水溶液。

体外抗菌效果评价：将含菌平板放入37℃恒温培养18h，测量传统含菌琼脂平板上的抑菌圈直径，以及亚甲基蓝含菌琼脂平板上蓝色圈或药物自身颜色与蓝色混合色圈的直径，确定抑菌圈直径，综合评价抗菌活性。

试验结果如图3所示，抗生素一般无色透明，扩散至琼脂中无色，离扩散中心越远浓度降低，但成分不变。图3-a所示传统琼脂平板扩散法抗菌试验中细菌不生长的区域为透明色，测量透明圈d1的大小评价抗菌效果。为了区别透明区域与其周围细菌生长的半透明区域，观察透明圈直径时需选择光线较好的环境，且透明圈边界不甚清晰，测量时需仔细观察界定；图3-b所示亚甲基蓝琼脂平板扩散法抗菌试验中细菌不生长的区域为蓝色，测量蓝色圈d2的大小评价抗菌效果，如图所示亚甲基蓝显色的抑菌圈着色均匀且边界清晰易于观察，测量时简便直观。

比较图3-a和3-b，可见两种方法对5mg/ml头孢曲松钠抗生素抗菌试验显示的抑菌圈直径大小相同，可见亚甲基蓝琼脂平板扩散法不影响抑菌结果且结果显示更加直观清晰易于测量。

2.2中药提取液体外抗菌试验对照

试验步骤：用直径6mm的打孔器分别在传统含菌琼脂平板和亚甲基蓝含菌琼脂平板上打孔，将中药水提液加入孔中进行扩散，中药水提液分别取用艾叶水提液、赤芍水提液，浓度均为1g/mL。

体外抗菌效果评价：将平板放入37℃恒温培养18h后，测量传统含菌琼脂平板上的抑菌圈直径，以及亚甲基蓝含菌琼脂平板上蓝色圈或药物自身颜色与蓝色混合色圈的直径，确定抑菌圈直径，综合评价抗菌活性。

试验结果：中药提取液与抗生素相比，大多具有色深混浊的特性，在琼脂中的扩散圈色深混浊。传统含菌琼脂平板中，棕黄色混浊的中药扩散后形成深浅不一的棕色中药扩散圈遮盖了透明抑菌圈，难以测量抑菌圈大小，无法准确评价其抗菌活性大小，如图4-a、4-c所示：传统法中艾叶水提液形成的深棕色中药扩散圈(内圈)e1和浅棕色中药扩散圈(外圈)e2及赤芍水提液形成的浅棕色中药扩散圈e5；中药水提液在亚甲基蓝含菌琼脂平板中扩散作用于细菌，被抑制的细菌将琼脂中的亚甲基蓝显示为蓝色，与深浅不一的棕黄色的中药扩散圈混合形成深浅不一的绿色或蓝绿色抑菌圈，观察并测量绿色或蓝绿色抑菌圈评价其抗菌活性大小。如图4-b、4-d所示，亚甲基蓝含菌琼脂平板中艾叶水提液产生深绿色中药抑菌圈(内圈)e3和浅绿色中药抑菌圈(外圈)e4，赤芍水提液产生蓝绿色中药抑菌圈e6。

以上试验结果表明，亚甲基蓝琼脂平板扩散法采用有色抑菌圈清晰显示抑菌区域，有效克服了传统平板琼脂扩散法中中药等色深混浊的待测物的扩散圈遮挡透明抑菌圈的弊端。

实施例2：

亚甲基蓝含菌琼脂平板扩散法应用于中药提取液体外抗菌试验

试验步骤：1、亚甲基蓝含菌琼脂平板制备方法同实施例1，菌种分别为肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌2种；

2、用直径6mm的打孔器在亚甲基蓝含菌琼脂平板上打孔，将中药水提液加入孔中进行扩散，中药水提液分别取用五味子水提液和乌梅提取液，浓度均为1g/mL。

体外抗菌效果评价：将平板放入37℃恒温培养18h后，测量亚甲基蓝含菌琼脂平板上蓝色圈或药物自身颜色与蓝色混合色圈的直径，确定抑菌圈直径，综合评价抗菌活性。

试验结果：如图5-a、5-b所示，抗肠炎沙门菌试验中五味子水提液和乌梅水提液都出现中心颜色较深的蓝色抑菌圈，五味子水提液抗肠炎沙门菌出现深蓝色中药抑菌圈(内圈)f1，乳白色中药扩散圈(外圈)f2；乌梅水提液抗肠炎沙门菌出现深蓝色中药抑菌圈(内圈)f3和灰白色中药扩散圈(外圈)f4；但图5-c抗鼠伤寒沙门菌试验中，五味子水提液除了在中心出现颜色较深的深蓝色抑菌圈f5，还在乳白色中药扩散圈(中圈)f6外出现第二层颜色较淡的浅蓝色中药抑菌圈(外圈)f7；图5-d中，抗鼠伤寒沙门菌试验中乌梅水提液亦中心出现颜色较深的深蓝色中药抑菌圈(内圈)f8，直径小于五味子内圈抑菌圈f5，但在灰白色中药扩散圈(中圈)f9外出现第二层颜色与中心深浅相似的深蓝色中药抑菌圈(外圈)f10，颜色比五味子的第二层抑菌圈f6较深。可见两种中药对两种细菌的抗菌物质的成分及活性大小不同。这与中药成分复杂，不同成分在琼脂中的扩散程度不一致相关。可根据需要进一步分层对其抗菌物质成分进行分离鉴定。

以上试验结果表明，传统平板琼脂扩散法主要适合单一成分的药物，其在琼脂中扩散后离中心越远浓度越低，直至不能抑制细菌生长而呈现直径不一的透明圈(抑菌圈)，通过测量透明圈大小评价药物抗菌活性大小。但中药成分复杂，离中心远近不同不仅药物浓度不同可能成分亦有不同，不能仅以唯一的抑菌圈直径大小来判定。亚甲基蓝琼脂扩散法将抑菌圈显示为蓝色或待测物自身颜色与蓝色的混合色，颜色均匀边界清晰，抑菌圈的测量较传统平板琼脂扩散法更加直接简便，且可分层显示扩散至琼脂不同位置的不同成分的抑菌作用。因此亚甲基蓝琼脂平板扩散法改善了传统琼脂平板扩散法不能满足中药等成分复杂的抗菌物质的抗菌试验要求的弊端。

实施例3：

不同浓度黄芩水提液的亚甲基蓝含菌琼脂平板扩散法抗菌试验

试验步骤：1、亚甲基蓝含菌琼脂平板制备方法同实施例1；

2、用直径6mm的打孔器在亚甲基蓝含菌琼脂平板上打孔，将黄芩水提液加入孔中进行扩散，黄芩水提液分别取用0.5g/mL、0.25g/mL和0.125g/mL。

体外抗菌效果评价：将平板放入37℃恒温培养18h后，测量亚甲基蓝琼脂平板上蓝色圈或药物自身颜色与蓝色混合色圈的直径，确定抑菌圈直径，综合评价抗菌活性。

试验结果：如图6所示，图6-a、6-b、6-c分别为0.5g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL的黄芩水提液在含沙门菌的亚甲基蓝琼脂平板上扩散后与平板内细菌作用的结果。结果显示图6-a中0.5g/mL黄芩水提液在琼脂中扩散后与琼脂中细菌作用后影响细菌生长，出现了棕黄色中药抑菌圈(内圈)g1，绿色中药抑菌圈(中圈)g2和深蓝色中药抑菌圈(外圈)g3。绿色抑菌圈是药物本身的棕黄色与亚甲基蓝的蓝色的混合色，蓝色抑菌圈是黄芩扩散至外圈无色的抑菌成分显示的抑菌作用。不同浓度的黄芩水提液显示出大小不同抑菌圈。随着药液浓度的降低的棕黄色的中药扩散圈直径减小，即：g7＜g4＜g1；绿色抑菌圈直径减小，即：g8＜g5＜g2；蓝色抑菌圈逐渐变浅直至消失，即：g9＜g6＜g3。以上均提示着抑菌成分的种类和含量的变化。

可见，亚甲基蓝琼脂平板扩散法可分层直观有效指示不同浓度中药提取物抗菌成分的种类和含量的变化。

综上所述，本发明实施例评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法直观简便，通过观察有色抑菌圈，克服了传统琼脂平板扩散法用于中药或其它性状相似待测物的体外抗菌实验时由于色深混浊和成分复杂导致难以准确测量抑菌圈直径的弊端。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。