一种从酶转化液中提取丙氨酰谷氨酰胺的方法与流程

本发明涉及丙氨酰谷氨酰胺的制备技术领域。

背景技术：

N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酸胺（又称丙氨酰谷氨酰胺）属于氨基酸的衍生物，简称丙谷二肽，主要用作氨基酸类肠外营养剂，具有重要的医疗价值和经济价值。

丙谷二肽的制备技术主要有化学合成法和微生物酶转化法，其中微生物酶转化法具有生产时间短、工艺控制简单、生产过程无污染、低成本的优点，但是由于制得的转化液中除产物丙谷二肽外还包含一定量的反应底物、酶等，使得酶转化液分离提取丙谷二肽困难，分离所得丙谷二肽杂质含量高、种类多，质量差。

公布号为CN104480075A的专利中转化液直接使用纳滤处理后进行减压蒸馏得到固体粗结晶产品，其杂质不易控制，过滤效率低，纳滤膜损耗大。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种从酶转化液中提取丙氨酰谷氨酰胺的方法，操作简单、易控制，流程短、能耗低、成本低，分离所得丙氨酰谷氨酰胺杂质含量少，纯度高，产品质量稳定，适用于丙氨酰谷氨酰胺的规模化生产。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种从酶转化液中提取丙氨酰谷氨酰胺的方法，包括如下步骤：

（1）将微生物酶转化法生产丙氨酰谷氨酰胺所得灭活后的转化液通过膜孔径为100～50nm的微滤陶瓷膜，控制压力0.02～0.1Mpa去除大分子物质得到陶滤清液；

其灭活方法为：将酶转化液在温度为65～90℃，pH=5～9条件下，常压保温30～45 min；

（2）将陶滤清液通过超滤陶瓷膜，去除分子量在1500以上的物质得到超滤清液，控制压力0.3～0.7Mpa；

（3）将超滤清液通过纳滤陶瓷膜浓缩，控制压力0.5～1.2Mpa，去除电解质和大量水，得到丙氨酰谷氨酰胺浓缩液，结晶，得到丙氨酰谷氨酰胺粗品。

进一步地，步骤（1）中向灭活后的温度为65～90℃、pH=5～9的转化液中加入氯化钠，加入氯化钠质量为转化液质量的3%～5%，氯化钠溶解完全后进行降温，待转化液温度低于60℃以后将其通过微滤陶瓷膜。

超滤陶瓷膜去除转化液中酶等大分子蛋白以及生物酶液中带入的其他大分子杂质。

纳滤陶瓷膜能截留分子量大于200的有机物以及多价离子，允许小分子有机物和单价离子透过，对二价或多价离子及分子量介于200～500之间的有机物有较高脱除率。利用纳滤膜的这一特点，将超滤清液通过纳滤膜，使得电解质离子（氯化钠）、反应底物及大量水通过纳滤膜，而截留分子量为217的丙氨酰谷氨酰胺，实现对超滤清液的分离和浓缩，得到丙氨酰谷氨酰胺浓缩液。

进一步地，步骤（2）中氯化钠加入量为转化液质量的3%。

进一步地，步骤（2）中将转化液降温至20～25℃，再通过微滤陶瓷膜。

进一步地，步骤（3）中纳滤陶瓷膜孔径为0.5～2纳米。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

1）本发明将转化液先经过陶滤和超滤进行处理后再采用纳滤进行浓缩结晶，效果更好，产品纯度和操作工艺上更方便。

2）本发明分离方法操作简单、易控制，易实现自动化，流程短。

3）本发明分离方法能耗低，不使用酸碱、有机试剂，分离过程安全无毒，对环境无污染。

4）本发明分离方法分离所得丙氨酰谷氨酰胺杂质含量少、种类少，产品纯度高、质量稳定，适用于丙氨酰谷氨酰胺的规模化生产。

附图说明

图1-3分别为本发明若干实施例所得丙氨酰谷氨酰胺粗品的液相色谱图。

根据中国药典2015版丙氨酰谷氨酰标准进行高效液相色谱法检测，图1-图3的谱图中，丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰分别为19.943min、19.825min、19.844min，各粗品中丙氨酰谷氨酰胺的含量均大于99%。

具体实施方式

为了解决微生物酶转化法制得丙谷二肽的转化液中分离提取丙谷二肽困难，分离所得丙谷二肽杂质含量高、种类多、质量差的技术问题，本发明提供了一种利用膜过滤技术从酶转化液中提取丙氨酰谷氨酰胺的方法，将微生物酶转化法生产丙氨酰谷氨酰胺所得灭活后的转化液依次通过微滤陶瓷膜、超滤陶瓷膜去除杂质，再通过纳滤陶瓷膜浓缩得到丙氨酰谷氨酰胺浓缩液，经结晶得到氨酰谷氨酰胺浓粗品。本发明方法所得丙氨酰谷氨酰胺杂质含量少、种类少，产品质量稳定，适用于丙氨酰谷氨酰胺的规模化生产。

本发明方法包括如下步骤：

（1）将酶转化液在温度为65～90℃，pH=5～9条件下，常压保温30～45 min，目的在于使酶转化液灭活；

（2）向灭活后的转化液中加入氯化钠，加入氯化钠质量为转化液质量的3%～5%，氯化钠溶解完全后进行降温，待转化液温度低于60℃以后将其通过膜孔径为50～100nm的微滤陶瓷膜，去除大分子物质得到陶滤清液；

（3）将陶滤清液通过超滤陶瓷膜，去除分子量在1500以上的物质得到超滤清液；

（4）将超滤清液通过纳滤陶瓷膜浓缩，去除电解质和大量水，得到丙氨酰谷氨酰胺浓缩液，再结晶，得到丙氨酰谷氨酰胺粗品。

作为优选，步骤（2）中氯化钠加入量为转化液质量的3%。

步骤（2）中将转化液降温至20～25℃，再通过微滤陶瓷膜。

步骤（3）中纳滤陶瓷膜孔径为0.5～2纳米。

下面采用上述方法对从酶转化液中提取丙氨酰谷氨酰胺进行举例说明。

实施例1

将采用活性固定化酶（酶活4405U)转化完成的转化液，迅速升温至70℃，调节pH至9.0，之后保温45min，进行灭活。

取灭活的丙谷二肽转化液70L,约7.6kg，经检测其中产物丙氨酰谷氨酰胺的含量为109.5g/L,转化液中加入氯化钠420g溶解完全，将转化液温度降于55℃，将其通过膜孔径为50～100nm的微滤陶瓷膜，去除大分子物质得到陶滤清液共计63L, 丙氨酰谷氨酰胺的含量为104.2 g/L,得到陶滤浊相9.5L，丙氨酰谷氨酰胺的含量为85.4g/L，洗涤液共计50L,含量25g/L；将所得陶滤清液通过超滤陶瓷膜，去除分子量在1500以上的物质得到超滤清液59L, 丙氨酰谷氨酰胺的含量为102.5g/L；将所得超滤清液通过纳滤陶瓷膜浓缩，去除电解质得丙氨酰谷氨酰胺浓缩液55L,其产物含量为98.2g/L，收率为71.5%。将所得浓缩料液进行结晶得到丙氨酰谷氨酰胺粗品。

实施例2

采用生物转化酶（酶活3980U)处理完成的转化液共45ml，将转化液迅速升温至75℃，当温度升至预设温度后调节pH至5.0，之后保温30min。取灭活的酶液70L,含量为104.5g/L,进行预处理，通过微滤陶瓷膜去除大分子物质等到陶滤清液共计62L,含量102.1g/L,陶滤浊相9.7L，含量83.8g/L；洗涤液共计50L,含量22.3g/L;将陶滤清液进行超滤陶瓷膜去除分子量在1500以上的物质等到超滤清液共得超滤清液58L,含量100.5g/L；将超滤清液进行纳滤陶瓷膜，去除转化液中的电解质得浓相55L,含量97.9g/L，收率为77.6%。之后将所得浓缩料液进行结晶得到丙氨酰谷氨酰胺粗品。

实施例3

取处理后的酶液（酶活5100U)共计35ml，处理完成的转化液，将转化液迅速升温至75℃，当温度升至预设温度后调节pH至6.0，之后保温45min。取灭活的酶液70L,含量为112.3g/L,过微滤陶瓷膜去除大分子物质等到陶滤清液共计62.5L,含量112.2g/L,陶滤浊相11L，含量55.4g/L；将陶滤清液进行超滤陶瓷膜去除小分子物质等到超滤清液共得超滤清液60L,含量118.0g/L；将超滤清液进行纳滤陶瓷膜，去除转化液中的电解质得浓相55.5L,含量115.9g/L，收率为80.3%。之后将所得浓缩料液进行结晶得到丙氨酰谷氨酰胺粗品。

实施例4

采用活性固定化酶（酶活6405U)处理完成的转化液28ml，将转化液迅速升温至70℃，当温度升至预设温度后调节pH至5.5，之后保温45min。取灭活的酶液70L,含量为130.7g/L,进行预处理，通过微滤陶瓷膜去除大分子物质等到陶滤清液共计62L,含量126.4g/L,将陶滤清液进行超滤陶瓷膜去除小分子物质等到超滤清液共得超滤清液55L,含量122.8g/L；将超滤清液进行纳滤陶瓷膜，得浓相51L,含量117.3g/L，收率为65.4%。之后将所得浓缩料液进行结晶得到丙氨酰谷氨酰胺粗品。