本发明涉及干细胞培养
技术领域：
，尤其涉及一种细胞培养液及其应用和诱导牙周膜干细胞向心肌样细胞分化的方法。
背景技术：
：心肌梗死是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损坏，是临床上一种严重的缺血性心脏病。坏死后的心肌细胞逐渐被瘫痕组织所取代，由于瘫痕组织缺乏弹性，难以满足心脏收舒功能的要求，为代偿损失心肌细胞的功能，心脏逐渐发生退行性左心室重塑，心功能下降，最终导致充血性心力衰竭，甚至猝死。临床药物和介入治疗虽可以改善症状，但却不能挽回受损的心肌细胞。心脏移植虽可以从根本上解决心室重构问题，但因为其供体受限，医疗费用太高而难以广泛应用。近年来的研究表明，心肌细胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌细胞也可以发生分裂和增值，但是，由于其增值能力较弱，不能满足弥补丧失心肌细胞数量的要求而逆转心室重构过程。近年来随着干细胞技术和组织工程学研究的不断深入，干细胞移植治疗心肌梗死成为临床研究的热点。干细胞的多向分化潜能及可塑性使心肌梗死心肌细胞再生成为可能，在人体的微环境作用下，干细胞定向归巢至损伤处，可以多项分化成各种组织细胞及血管。目前用于心肌梗死治疗研究的干细胞主要有骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞等。目前研究表明，在体外常用5-氮杂胞普，骨形态发生蛋白-2等作为诱导剂诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化，取得了良好分化效率。牙周膜是牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织,是重要的牙周支持组织,主要由成纤维细胞、成牙骨质细胞和一些未分化的间充质细胞组成。正常情况下,牙周组织具有自身的更新和修复能力,其修复活动是通过牙周膜细胞自我更新实现的。在疾病或在受到外界刺激时,通过牙周膜中细胞的不断增殖和分化使组织再生。2004年Seo等从拔除的第三磨牙牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞(PeriodontalLigamentSemCells,PDLSCs)。此外，在拔牙后牙槽窝的内表面也有PDLSCs存在。近来，有人从成人牙周组织中得到了高度纯化的PDLSCs克隆。研究表明，PDLSCs表达间充质干细胞的标记物STRO-1和CD146/MUC18,这意味着PDLSCs很有可能是来源于血管周围的细胞群。而这一点恰恰与同样表达STRO-1和CD146/MUC18的骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMMSCs)非常相似。PDLSCs也具有与BMSCs相似的多向分化能力，可体外分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等。但是，由于生物体是一个复杂的存在多诱导因素的有机体，因此在心肌组织再生的复杂微环境中，多种诱导因子在心肌组织再生的过程中可能会起到相互协同或拮抗的作用。目前尚未见对于PDLSCs向心肌样细胞分化诱导的研究报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养液及其应用和诱导牙周膜干细胞向心肌样细胞分化的方法。本发明提供的细胞培养液能够促进牙周膜干细胞向心肌样细胞分化，其分化周期短，分化效率高。本发明提供的细胞培养液，包括基础培养液、FBS、5-aza和Ang-II。胎牛血清(fetalcalfserum，FBS)是血清中的一种，能够提供维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-aza)是一种可改变基因的去甲基化药物，作为一种诱导剂常用于体外实验研究。5-aza是胞苷类似物，为DNA甲基转移酶抑制剂，当其作用于MSC时能整合进入DNA中，通过抑制DNA甲基转移酶使低DNA甲基化,而DNA的甲基化程度和基因调节密切相关。5-aza诱导MSC心肌化，可能是它和控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合，使其去甲基化而发生构型改变,从而启动细胞向心肌分化,使转变成心肌细胞。血管紧张素II(AngiontensinII，Ang-II)是人体内正常存在的一种多肽类激素类物质，在心血管疾病的发生发展以及血管重塑中起到一定的作用。有研究显示人类脂肪来源间充质干细胞经Ang-II诱导之后表达平滑肌特异性基因增加，其向平滑肌样细胞分化，而且还可以诱导间充质干细胞血管内皮生长因子合成增加，也可诱导多能干细胞向中胚层前体细胞分化和增殖。本发明利用FBS、5-aza和Ang-II诱导牙周膜干细胞分化为心肌样细胞。其中，Ang-II单独可以促使间充质干细胞向心肌样细胞分化，同时使用5-aza可以进一步提高增殖和分化的效率。诱导获得的细胞不仅具有了心肌细胞的典型形态，并表达心肌细胞的标志物：肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponinI)和心肌肌钙蛋白T(troponinT)，表明牙周膜干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为心肌样细胞。本发明提供的培养基提高了牙周膜干细胞向心肌样细胞分化的分化率并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养基诱导后1～2周，细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3～4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构，且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，部分细胞胞质内可见细丝样结构。对各组细胞的分化率进行计算，结果显示实验组细胞的分化率显著高于对照组，(p<0.05，或p<0.01)。在本发明的实施例中，FBS的体积分数为10％。在本发明的实施例中，5-aza的浓度为5μmol/L～15μmol/L；TAng-II的浓度为1μmol/mL～10μmol/mL。在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为5μmol/L的5-aza、浓度为1μg/mL的Ang-II。在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为10μmol/L的5-aza、浓度为5μg/mL的Ang-II。在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为5μmol/L的5-aza、浓度为10μg/mL的Ang-II。在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为15μmol/L的5-aza、浓度为10μg/mL的Ang-II。在一些具体实施例中，基础培养基为DMEM/F12。本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的人干细胞无血清培养基为DMEM/F12无血清培养液。本发明提供的培养液中不含有抗生素，而是通过更加适宜的培养条件，促进牙周膜干细胞向心肌样细胞的分化，增强目标细胞的生长势，降低感染风险。本发明提供的细胞培养液在诱导牙周膜干细胞向心肌样细胞分化中的应用。本发明还提供了诱导牙周膜干细胞向心肌样细胞分化的方法，牙周膜干细胞以基础培养基培养至70％～80％融合后以本发明提供的细胞培养液诱导。在本发明的实施例中，诱导的时间为28d。在本发明的实施例中，牙周膜干细胞为3～5代的牙周膜干细胞。一些实施例中，牙周膜干细胞为第3代的牙周膜干细胞。所述诱导牙周膜干细胞向心肌样细胞分化的容器为无菌六孔板，优选的，所述六孔板经多聚赖氨酸处理。所述诱导过程，接种24h后更换培养液，以后每隔2～3天更换新的培养液。所述诱导的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养。本发明中，牙周膜干细胞的分离采用磁珠分选法，具体方法包括：步骤1：牙周膜组织以胶原酶和Dispase酶消化后，以含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液培养至汇合80％～90％；步骤2：收集细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠4℃孵育30min，后，筛选出STRO-1+的PDLSCs，传代。所述胶原酶和Dispase酶的质量比为3:4。具体的，胶原酶浓度为3g/L，Dispase酶浓度为4g/L，以体积比1:1混合。消化条件为37℃恒温摇床中消化30min～35min。消化结束后，1000r/min离心5min收集细胞，然后再以PBS清洗一次。步骤1中所述培养的条件为5％CO2培养箱37℃培养。所述传代具体为：待细胞长满80％～90％，用吸管吸弃旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶，消化1分钟～3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入含10％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按5×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2～3天换液一次。本发明提供的培养液中包括基础培养液、FBS、5-aza和Ang-II。本发明提供的培养液能够诱导牙周膜干细胞分化为心肌样细胞，且能够提高牙周膜干细胞向心肌样细胞分化的分化率并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养基诱导后1～2周，细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3～4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构，且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，部分细胞胞质内可见细丝样结构。对各组细胞的分化率进行计算，结果显示实验组细胞的分化率显著高于对照组，(p<0.05，或p<0.01)。附图说明图1示PDLSCsP2代形态；其中，图1-a的放大倍数为40×；图1-b的放大倍数为100×；图1-c的放大倍数为200×；图2示PDLSCsP2代流式细胞检测结果，其中，图2-a～图2-c示阳性marker(CD145、CD105、CD73)的表达情况；图2-d～图2-f示阴性marker(HLA-DR、CD45、CD34)的表达情况。具体实施方式本发明提供了一种细胞培养液及其应用和诱导牙周膜干细胞向心肌样细胞分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1PDLSCs原代分离培养、传代及鉴定取材：取牙根中下1/3段的牙周膜组织，移入离心管，并用眼科剪将组织块剪成约为1mm3大小。消化：加入适量胶原酶-Dispase酶1:1混合消化液(胶原酶3g/L，Dispase酶4g/L)，置37℃恒温摇床中消化30-35min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清。接种：加入培养液(含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液)重悬细胞，接种于六孔板，5％CO2培养箱37℃培养。纯化：待细胞长满80％～90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+PDLSCs，接种于新的六孔板中，5％CO2培养箱37℃培养。传代：待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含10％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按5×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。培养过程中观察细胞形态，结果如图1所示。细胞接种约4h后开始贴壁，2-3d进入对数生长期，细胞增殖速度较快，4-6d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈类梭形，形态不规则。鉴定：取第3代对数生长期细胞，流式细胞术检测表面抗原CD146、CD105、CD73、CD34、CD45、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析6000～8000个细胞。流式细胞术检测结果显示，细胞表面抗原CD146、CD105、CD73表达阳性，而CD45、CD34、HLA-DR表达阴性，说明本发明中得到的PDLSCs属来源于中胚层的间充质干细胞(表1，图2)。表1PDLSCs表面抗原阳性表达率细胞表型CD146CD105CD73HLA-DRCD34CD45阳性表达率(％)99.899.899.80.20.20.3实施例2PDLSCs的分化各受试组培养液的配方如表2：表2各组分化诱导液配方组别基础培养基FBS5-azaAng-II实验组1DMEM/F1210％5umol/L1umol/L实验组2DMEM/F1210％10umol/L5umol/L实验组3DMEM/F1210％5umol/L10umol/L实验组4DMEM/F1210％15umol/L10umol/L对照组1DMEM/F1210％————对照组2DMEM/F1210％10umol/L——对照组3DMEM/F1210％——5umol/L选取实施例1制备的第3代PDLSCs，按1×104cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培养基。24h后更换各组对应的培养液，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养，每隔2～3天更换新的培养液。观察培养过程中细胞形态：对照组1为阴性对照组，细胞形态无变化，实验组4细胞状态较差，细胞增殖缓慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量逐渐减少，3～4周偶见部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；对照组2、对照组3、实验组1、实验组2和实验组3细胞形态出现明显变化，诱导后1～2周，细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3～4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较对照组1明显减少，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构，且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，部分细胞胞质内可见细丝样结构。培养4周后取出细胞爬片,按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponinI)和心肌肌钙蛋白T(troponinT)的免疫组化染色,DAB显色。将各组放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加适量一抗(desmin、troponinI、troponinT)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。对各组所得细胞经免疫组化检测后，对desmin、troponinI、troponinT染色的细胞按公式：诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％进行计数，计算出各组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。统计结果如表3。表3各组细胞分化率其中，*示与对照组1相比存在显著性差异，p<0.05**示与对照组1～3相比皆存在极显著差异，p<0.01表3结果显示，对照组1为阴性对照组，细胞无着色；其余各组中，三种蛋白均有细胞着色，表明desmin、troponinI、troponinT均表达阳性。其中对照组2、对照组3之间分化率无显著性差异，说明5-aza与Ang-II分别单独诱导PDLSCs向心肌样细胞分化效果作用无差异。而实验组1、实验组4的诱导效果与对照组1～3相似，未体现两者联合诱导分化的效果；实验组2～3的分化率则显著高于其他各组(p<0.01)，其中实验组2的效果与实验组3的分化率相比，也存在显著性差异(p<0.01)。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3