ERβ启动子荧光素酶报告基因的重组与药物筛选应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及ERβ启动子荧光素酶报告基因重组、构建雌激素受体β启动子细胞模型及筛选出有效减缓牙周组织疾病，维持牙槽骨高度的雌激素替代药物的应用,在此发明中，我们利用基因工程技术，从人基因组中扩增出了1253bp的ERβ启动子序列，将其克隆到PGL2-luc载体上，构建出ERβ启动子-Luc表达载体,ERβ表达受启动子区域的调控，构建牙周膜细胞ERβ启动子模型是筛选出治疗骨缺损的有效中药成分的关键步骤,通过构建此药物筛选细胞模型，证明了一定浓度的西洋参成分可促进ERβ启动子的转录，且浓度越高活性越强，可指导临床应用该药物进行牙周疾病及牙槽骨吸收的治疗。
【专利说明】ER^启动子荧光素酶报告基因的重组与药物筛选应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及雌激素受体β (ERi3)启动子荧光素酶报告基因重组、构建雌激素受体β启动子细胞模型及筛选出能够有效减缓牙周组织疾病的继续发展，维持牙槽骨高度的雌激素替代药物。
【背景技术】
[0002]近年来，国内外的许多研究都已证实雌激素与骨组织代谢之间存在着密切的关系。在口腔医学领域，应用雌激素来改善牙槽骨的吸收，维护牙周组织健康的相关研究越来越受到学者们的关注。
[0003]目前人们已经认识到，雌激素在牙周疾病发生的病理过程及牙槽骨的吸收过程中都起着重要的调控作用。例如，孕期的女性由于体内雌激素水平的改变，使其牙周疾病的严重程度大于其他时期；绝经后妇女体内雌激素缺乏可影响体内的骨转换过程，导致骨吸收大于骨形成，进一步引起全身骨质疏松。在口腔中主要表现为牙槽骨吸收加快，进而引起牙齿松动。[0004]雌激素主要通过雌激素受体a (ERa，estrogen receptor a )和雌激素受体β(ER^ , estrogen receptor β )两种受体介导来行使其功能,这两种受体存在于哺乳动物的很多细胞中，在对细胞功能的行使中也起着重要的调控作用，研究发现，雌激素可通过ER直接作用于牙周组织并发挥其作用，并且许多已知的骨代谢相关因子都受到雌激素的调控。有研究表明，在牙周组织细胞中ERi3的表达强于ERa表达，其对骨代谢作用稍大于ERa。并且当ERa基因结构遭到破坏时，ERβ基因表达模式不会发生明显变化，说明ERβ介导雌激素的作用部分，可能以一种不直接依赖于ER a的方式进行的基因调控。因此本发明开创性的采用构建ERi3启动子荧光素酶报告基因重组质粒来进行牙周疾病及骨代谢方面的研究。
[0005]牙周膜细胞是牙周膜内的主要成分，对牙周膜的形成有决定性的作用。牙周膜细胞具备多向分化及增殖的潜能。牙周膜细胞的增殖、分化除了可维持牙周组织的对牙齿的营养和支持功能外，还可进一步影响牙槽骨的成骨活性。并且牙周膜细胞内存在介导雌激素的ERi3受体，其在外源性雌激素的刺激下，可使牙周膜细胞的成骨作用增强。本发明将重组的ERi3启动子重组质粒转染至牙周膜细胞中，为后期有效要药物的筛选提供了基础。
[0006]因为雌激素长期服用会引起机体内环境的代谢紊乱，有一定的副作用。因此选择植物雌激素来替代雌激素治疗疾病越来越受到人们的关注。植物雌激素是一种来源于植物当中，具有类黄酮结构，并具类雌激素功能的物质。在我国中医药理中，许多中药中都含有植物雌激素成分。因此，筛选出能够替代雌激素的有效中药成分对指导临床治疗雌激素缺乏引起的牙周组织疾病及减缓牙槽骨的吸收有着重要的意义。
【发明内容】
[0007]由于雌激素缺乏后易引起的牙周组织疾病和牙槽骨吸收加快，进而导致牙齿过早的松动脱落。并且临床上尚未发现解决此问题的有效方法。本发明主要基于此治疗难点，通过构建ERi3启动子荧光素酶报告基因，构建牙周膜细胞ERi3启动子模型，筛选有效维持牙周营养及促进骨形成的中药药物成分。本发明对于开发治疗牙周疾病及减缓牙槽骨吸收的药物具有重要的应用价值。
[0008]ER^启动子重组质粒构建及药物筛选的过程包括以下步骤:
[0009]第一步:目的片段的获取
[0010]应用primer premier5.0引物设计软件设计ERβ启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR，得到从-1137至+116，全长1253bp的ER0启动子序列。
[0011]这段启动子的碱基序列为:
[0012]
tatagaagc aagcgaggac attccaccct agaaatggtt cagaaactca taggcaccct59
tagctgatgg aaac aatcaa tcatatttaa tacgcttaga atcagtttta ctccaatcag119
ctggcaattt, tgagctgccg gttatacacc aaaatgttct gttcagtacc tagctctgct179
cttttatatt gctttaaatt tttaaagaaa ttgtattgca tggatgtggt tatttgtgca239
tattttttaa caatgcccaa tctgtatgaa taatgtaaac ttcgattttt ttttaaaaaa299
attagatttt agctggagct tttgactaat gtaaagtaaa tgccaaacta ccgacttgat359
agggatgttt ttgtaagtta attttctaag actttttcac atccaaagtg atgctttgct419
ttgggtttta actgtttggc cacggcgggg gtgggggcgg ggggttggta cagaaacttg479
aagctgtttg tgatatgtac aactxagatg tttctxatta aaaaacaaaa ttagccagac539
ttctgttgta ctgaattctg taacaaagca gttcagtggt atgcttaatc ttccaaaaaa599
caaaaattat, tatttttaaa atatttggag agggcctttt attctaagtc ttatttacag659
aattaactta gctctggacc ctcgtgtatg tgtaaattaa attattcagc gtgtgaccct719
cagctattgt agggaatggc aaaggcagca tggcatgaga ggtggacgca aagggaagga779
tcttataccc agtttactct actctttttt ttgacagagt ctcactctgt cagtcaccca839
ggctggagtg cggtggccca atctcggctc actgcaacct ttgccttcca ggttcaagcc899
attctcatgc ctcagcctcc tgagtagctg ggattacaag cacacaccac catgcctggc959
taattattat atttttaata gagacggggt ttcgccatgt tggccaggct ggtttcaaac1019
tcctgacctc aactgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgttgggatt acaggtgtga1079
gccaccgcac ctggattccc agccctctcc atggcaaatg aacaggcaaa gccccttgtt1139
gcccatttaa gtccagtagc attttacttt ctacctaaac aaagaggata ggcatcggca1199
tttccccttt cttattggaa gatactgaac acagttccta acctgcatct gttg1253
[0013]第二步:克隆载体的构建
[0014]将扩增得到的目的片段与pGEM-T Easy载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定。
[0015]第三步:表达载体pGL2_ER0 promoter的构建
[0016]将克隆质粒和pGL-2载体进行双酶切后连接，经转化、培养和提取，构建pGL2-ER β promoter重组质粒,酶切鉴定重组序列，并且通过测序进一步确定。
[0017]第四步:牙周膜细胞(PDLCS periodontal ligament cells)培养与鉴定
[0018]牙周膜组织在孵育72h后进行首次换液，培养至第10d，细胞集落数量和面积明显增加，集落与集落之间无明显间隙，各个细胞集落扩大直至铺满培养瓶底面，细胞呈长梭形，排列成旋窝状。角蛋白染色阴性，波形蛋白染色阳性表明原代细胞为来自中胚层的成纤维细胞，所获取的细胞较纯可用于后续实验。[0019]第五步:药物筛选的应用
[0020]首先以2X IO5/孔的密度将TOLCS铺于48孔板中，使细胞达到70%的汇合率，37°CC02培养箱过夜；将脂质体101^和重组质粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3内参质粒(每孔25叩)分别溶于50(^1^ optimem中，震荡混匀，合并为一管，混匀，室温静置30min。20 μ L每孔加入48孔板中，37°C CO2培养箱过夜；48孔板分为阴性、人参(浓度分别为0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、西洋参(浓度分别为 0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、共七组，每组3个平行孔，370C CO2培养箱过夜；弃上清，每孔65 μ L PLB (荧光素酶报告基因裂解溶液)，摇床15min，室温，分别转入EP管中；13000rpm，IOmin,取20 μ L上清置于新EP管中，检测荧光值并计算平均值和标准差。
[0021]再次以2Χ IO5/孔的密度将TOLCS铺于96孔板中，使细胞达到70%的汇合率，37°CC02培养箱过夜；将脂质体101^和重组质粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3内参质粒(每孔25叩)分别溶于50(^1^ optimem中，震荡混匀，合并为一管，混匀，室温静置30min。IOyL每孔加入96孔板中，37°C CO2培养箱过夜；96孔板分为阴性、浓度为0.03mg/ml的人参、浓度为0.03mg/ml的西洋参，共三组，每组15个平行孔，37°C CO2培养箱培养；分别于培养Id、2d、3d后弃上清，加入10μ L5%MTT (3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐)，37°C CO2培养箱培养4小时，加入150 μ L DMSO (二甲基亚砜)。在492波长下读取吸光度值并计算平均值和标准差。
[0022]实验结果表明，一定浓度的西洋参成分可显著上调ERi3启动子的活性，促进牙周膜细胞增殖，对促进 牙周及骨组织再生有显著作用。
【专利附图】
【附图说明】:
[0023]图1为pGL2_ER0 promoter重组质粒的构建过程示意图；
[0024]图2为ER β promoter PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0025]图3为PCR扩增出的ER β promoter启动子片段凝胶回收电泳图；
[0026]图4为pGEMT - ER^ promoter重组质粒单酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
[0027]图5为pGEMT - ER β promoter重组质粒双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
[0028]图6为pGL2_ERβ promoter重组质粒単酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
[0029]图7为pGL2_ERβ promoter重组质粒双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]图8为PGL2-ER β promoter启动子重组质粒的测序结果
[0031]图9牙周膜细胞原代培养图
[0032]图10抗角质蛋白阴性图
[0033]图11抗波形蛋白阳性图
[0034]图12为药物筛选双荧光素酶检测结果数据图表；
[0035]图13为药物筛选MTT检测结果数据图表
【具体实施方式】:
[0036]实施例一:ER β promoter-pGL2重组质粒的构建【图1】
[0037]1.目的片段的获取
[0038]通过NCBI数据库查找ERP启动子，应用primer premier5.0引物设计软件设计ERP启动子全长的引物。以人类基因组为模板，上游引物为5’GGTACCTATAGAAGCAAGCGAGGAC(含KpnI酶切位点)，下游引物为5’ AAGCTTCAACAGATGCAGGTTAGGA (含 HindIII 酶切位点)，进行 PCR，成功扩增出 ERP 启动子目的片段，长度为1253bp，琼脂凝胶电泳【图2】可见显示一条清晰的特异性扩增条带，长度约为1253bp，与预期长度相符合。应用AxyPr印PCR清洁试剂盒回收ER β启动子的DNA片段【图3】。
[0039]2.ER β promoter-pGEMT Easy 重组质粒的构建
[0040]将ER β启动子片段与pGEMT Easy载体连接，连接体系为Ligase5ul，pGEMTVector0.5ul，纯化的DNA5ul，混合均匀，16°C连接过夜。将连接产物全部加入IOOul新鲜制备的感受态细胞中混匀，冰浴30min，放入已加温至42°C的水浴中，热激90s(期间不要摇动试管)，迅速放入冰浴中2min，加入600ulS0C培养基，放入37°C摇床振荡lh，铺到含氨苄(Amp)的抗性平板上，37°C平放待液体吸干后，倒置平皿继续培养12-16h，待出现乳白色菌落后挑克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以KpnI进行单酶切【图4】和KpnI&Hindlll分别双酶切鉴定【图5】。根据【图4】可以看出，进行单酶切后，pGEM-T-ERPpromoter为一条大小为4268bp的特异性条带。而双酶切回收后，pGEM-T-ER0 promoter则呈现大小为1253bp和3015bp的两条特异性条带，如【图5】，符合我们的预期。
[0041]3.ER^ promoter-pGL2 重组质粒的构建
[0042]首先将pGEM-T-ER β promoter与pGL_2分别进行单酶切，酶切体系为50 μ L，其中10XBuffer5.0μ L, 10XBSA5.0 μ L，质粒 2.0mg, KpnI2.0μ L, H2O 补足 50μ L 体系，37°C酶切过夜，琼脂糖凝胶 电泳回收，再向单酶切体系中补充:5M NaCl0.5 μ L, HindIII2.0 μ L,Η20补足50 μ L体系，进行双酶切后凝胶回收鉴定，PGL2为一条大小为5563bp的特异性条带，而pGEM-T-ERβ promoter则呈现大小为1253bp和3015bp的两条特异性条带，同样符合我们的预期。取上述回收ERi3启动子片段与pGl-2载体连接，连接体系为LigaselOul，pGL-2Vector2ul,ERβ promoter7ul,混合均匀，16°C连接过夜。将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，应用KpnI和KpnI&Hindlll对ERβ promoter-pGL2重组体进行单酶切【图6】和双酶切鉴定【图7】，根据酶切图我们可以看出，ERβ promoter-pGL2重组体为一条大小6851bp的特异性条带,对其进行双酶切后呈现出大小为5563bp和1253bp的两条特异性条带，其结果可证实ER β启动子片段已与PGL2载体连接成功。之后我们对ERi3 pr0m0ter-pGL2重组体进行测序【图8】,测序报告结果证实PGL2-ER β promoter启动子重组质粒序列完全正确。
[0043]实施例二:细胞培养及药物筛选
[0044]1.细胞系的培养及鉴定
[0045](I)细胞原代培养
[0046]标本取自临床因正畸治疗而拔除的健康、无龋坏的双尖牙。提供标本的患者年龄为13~18岁，无性别差异。在患者签署知情同意书后，先使用复方氯已定含漱3X3min，然后使用拔牙钳将牙拔除，并立即放入盛有含5%氯霉素、链霉素的PBS溶液中，在30min以内送至实验室。在超净工作台内用含2%双抗(霉素100U/ml，链霉素100μ g/ml)的PBS溶液反复冲洗，将牙根表面残留的血块冲洗干净，直到牙根表面变白。然后使用11号手术刀片，将根中1/3的牙周膜轻轻刮除，并剪成I X Imm3大小，然后放置在35mm的培养皿中并均匀摆放。开始加少量的20%完全培养基将牙周膜侵湿即可，并将其放入37°C恒温孵箱中，2~4小时后再补加适量培养基。前3天勿动，以后每2天换液I次，待细胞长满后传代培养【图9】。传代后细胞生长旺盛，状态良好，呈星形或梭形，具有牙周膜细胞的特性。
[0047](2)细胞爬片制作:
[0048]PDLCS消化后使用10%完全培养基重悬(3~5ml)，在24孔板里预先铺Φ 14mm细胞培养专用盖玻片，取细胞悬液分别滴加到圆形盖玻片上，注意不要滴在圆片外并让细胞贴附30min左右。然后在培养板中补加完全培养基，应注意轻微加入，以免将贴附上的细胞冲下来。然后将培养板放置孵箱中，待细胞长至70~80%聚合度时取出盖玻片。先用
0.01M PBS漂洗2min X3，然后在室温下使用4%多聚甲醛处理20min，PBS漂洗2minX3，然后0.5%tritonx-100室温处理20min用于细胞打孔，最后PBS再漂洗2minX3。
[0049](3)免疫组化染色
[0050]由于牙周膜细胞来源于外胚层的间充质，因此本实验用两种抗体进行免疫组化染色，来验证牙周膜细胞纯度。波形丝蛋白和角蛋白染色均根据试剂盒说明进行操作。波形蛋白是鉴定细胞来源于间充质细胞的特征性标志蛋白，而角蛋白则是鉴定上皮来源细胞的特异性标志蛋白。本实验免疫组化染色结果为抗波形蛋白染色阳性【图10】，而抗角蛋白染色阴性【图11】。证实细胞为间充质来源细胞而非上皮来源，细胞较纯，无其他细胞混入。
[0051]2.药物筛选 的应用
[0052]首先以2X IO5/孔的密度将TOLCS铺于48孔板中，使细胞达到70%的汇合率，37°CC02培养箱过夜；将脂质体101^和重组质粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3内参质粒(每孔25叩)分别溶于50(^1^ optimem中，震荡混匀，合并为一管，混匀，室温静置30min。20 μ L每孔加入48孔板中，37°C CO2培养箱过夜；48孔板分为阴性、人参(浓度分别为0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、西洋参(浓度分别为 0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、共七组，每组3个平行孔，370C CO2培养箱过夜；弃上清，每孔65 μ L PLB (荧光素酶报告基因裂解溶液)，摇床15min，室温，分别转入EP管中；利用Turner Designs TD20/20光度计中的双荧光素酶实验系统模式测定荧光素酶活性，所得的结果为各个实验样品的萤火虫荧光素酶的活性与Renilla荧光素酶活性的比值。实验结果均为3次独立的实验结果的平均值，制作图表【图12】。双突光素酶检测结果显示浓度为0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml的人参，西洋参对ER β启动子均有显著的激活作用，随着浓度增高，激活作用增强，并具有剂量依赖性。其中西洋参的作用效果较人参更为显著。
[0053]再次以2Χ IO5/孔的密度将TOLCS铺于96孔板中，使细胞达到70%的汇合率，37°CC02培养箱过夜；将脂质体101^和重组质粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3内参质粒(每孔25叩)分别溶于50(^1^ optimem中，震荡混匀，合并为一管，混匀，室温静置30min。IOyL每孔加入96孔板中，37°C CO2培养箱过夜；96孔板分为阴性、浓度为0.03mg/ml的人参、浓度为0.03mg/ml的西洋参，共三组，每组15个平行孔，37 °C CO2培养箱培养，分别于培养ld、2d、3d后弃上清，加入10 μ L5%MTT(3- (4，5- 二甲基噻唑_2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐)，37°C CO2培养箱培养4小时，加入150 μ L DMSO (二甲基亚砜)。在492波长下读取吸光度值并计算平均值和标准差。实验结果均为3次独立的实验结果的平均值，制作图表【图13】MTT检测结果显示浓度为0.03mg/ml的人参，西洋参可促进牙周膜细胞的增殖，并且随着培养时间的增加，细胞增殖数量增多。其中西洋参的作用效果较人参更为显著。
[0054]本发 明中利用ERi3启动子重组质粒筛选中药药物，证明了西洋参可以显著上调ER^启动子活性并促进牙周膜细胞的增殖及分化。后续实验可运用本发明的ERi3启动子重组质粒筛选其他中药，用以治疗雌激素缺乏引起的牙周炎症并改建吸收的牙槽骨，为临床治疗上述疾病药物的研发奠定基础。
[0055]
【权利要求】
1.ERi3启动子荧光素酶报告基因的重组，将该基因启动子-1137至+116序列克隆到空载体pGL2-Basic的多克隆位点中，其下游为荧光素酶Luc的表达序列，构建出ERP启动子-Luc表达载体。
2.根据权利I所述报告基因基因重组转染至于人类牙周膜细胞中，构建药物筛选模型。
3.根据权利2发现一定浓度的西洋参成分可使ERβ启动子活性升高并可以促进牙周膜细胞的增殖，且浓度越高活 性越强。
【文档编号】C12Q1/02GK103937834SQ201410098446
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】李江, 李晓菊, 杨柳, 赵超悦, 贺玺, 魏溦 申请人:吉林大学