重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其步骤为：①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；②优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上。
【专利说明】重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]20世纪30年代，科学家就发现在人的大脑和垂体的组织提取物中存在一种能够促进成纤维细胞生长的活性物质，到70年代，这种物质被分离提纯。鉴于这种物质的作用，它被命名为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)。后来,又在多种器官组织中发现了这类因子，统称为FGFs家族成员。不同的FGFs作为细胞间的信号分子在人胚胎发育和分化过程中起重要作用。迄今为止，共有大约23种人FGFs被发现。多数的FGFs在其N端具有信号肽帮助成熟蛋白分泌到胞外，但是某些FGFs成员缺乏信号肽，也能正常分泌到胞外。
[0003]FGFl也被称为人酸性成纤维细胞生长因子(human acidic fibroblast growthfactor, haFGF)，有广泛促分裂的作用，主要分布于脑、垂体、神经组织、视网膜、肾上腺、心脏和骨骼等器官或组织内，其他组织含量很少，在血清和体液中以极低的浓度存在。人的haFGF基因位于第4号染色体上，为单拷贝基因，由两个大的内含子和3个外显子组成。haFGF蛋白由154个氨基酸残基组成，等电点5~7，通过与其受体结合启动信号转导机制从而诱导多种细胞分化、增殖。
[0004]大量的研究表明，haFGF蛋白有刺激血管生长、加速创伤愈合和促进神经损伤修复等多种功能，外源性人酸性成纤维细胞生长因子蛋白有望成为临床上用于促进伤口愈合、胃溃疡、视神经萎缩、神经性耳聋、内脏缺血损伤等多种疾病治疗的有效药物。然而天然的haFGF蛋白含量很低，有必要开发基因工程重组haFGF，高效制备haFGF蛋白。
【发明内容】
[0005]本发明为了解决天然的haFGF含量很低不利于药物开发的问题，提供了一种重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其步骤为:
①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；克隆得到分子伴侣TOI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的roi基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；
②优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上，构建得到闻效表达载体；③高效表达载体转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有相应蛋白酶的质粒转入Rosseta菌株,一起诱导表达；随后将两种菌株以任意比例混合；
④用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使与蛋白酶切位点序列对应的蛋白酶酶切完全，释放出rhaFGF蛋白，得到高浓度的含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液；
⑤将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液进行纯化处理，得到高纯度的rhaFGF蛋白，进行SDS-PAGE分析和含量测定。
[0007]本发明中未详细叙述“替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子”，由于基因优化密码子的方法为本领域技术人员的公知常识，通常只需要给出最后优化后的全DNA序列即可，根据此序列本领域技术人员即可实现该方法的实现流程。
[0008]本发明中优化的PDI基因为分子伴侣，对于重组人酸性成纤维细胞生长因子的可溶性高效表达具有关键的辅助作用，与rhaFGF (重组haFGF)的相对位置是可变的。因此，步骤②中只要是载体上的优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接在一起，无论一次克隆进入载体或是分次克隆进入载体，任意变换它们在载体上的前后顺序，均可实现haFGF的高效表达。且序列的连接以及克隆进入载体均是本领域公知常识，本发明不作过多的阐述。
[0009]本发明步骤②中的标签序列除了采用本发明提到的六个连续的组氨酸标签序列HIS6，还可采用本领域常用的其它标签序列，例如Flag标签，HA标签，GST标签等等。
[0010]本发明步骤②中的蛋白酶切位点序列除了采用本发明提到的PP (PrescissionProtease)蛋白酶切位点序列，还可采用本领域常用的其它蛋白酶切位点序列，例如Thrombin 酶，Enterokinase 酶，TEV 酶等等。
[0011]本发明步骤②中的载体除了采用本发明提到的pET-26b，还可采用本领域常用的其它表达载体，例如pET-15，pET-21, pET28等等。
[0012]本发明步骤③中所述的相应蛋白酶指的是步骤②中的蛋白酶切位点序列所对应的蛋白酶。
[0013]进一步，步骤③中haFGF重组蛋白菌株与蛋白酶菌株的质量比为50:1。本发明步骤③中所述的两种菌株以任意比例混合，但是50:1的质量比为恰好蛋白酶能够酶切完全，且不造成浪费的质量比。若该比例小于50:1，含有蛋白酶的菌株过多，造成蛋白酶的浪费和杂蛋白的增多；若该比例大于50:1，蛋白酶含量过低，不能完全酶切完全，释放出的rhaFGF蛋白相对较少。
[0014]进一步，步骤⑤中的纯化处理为:将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液的PH值调整至8，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲液上柱，15mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白，透析过夜。
[0015]本发明步骤⑤中的纯化处理可以采用本领域常规使用的离子交换、亲和层析、液相色谱以及分子筛等手段来处理目的蛋白；但是本发明提供的纯化处理相对于常规手段，具有快速高效的特点。
[0016]利用本发明所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，使得PDI辅助rhaFGF保持可溶解高活性的正确折叠状态，SDS-PAGE分析纯化处理后的rhaFGF蛋白纯度在95%以上，浓度超过0.5mg/ml。制备方法简单，产品质量稳定，可以作为药物或保健用品，利于向大众推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为PET_26b载体的图谱以及载体上的多克隆位点。
[0018]图2 为 haFGF 基因在 pET-26b-haFGF_HIS6-pp-PDI 的质粒构建图。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法: I~2)构建pET-26b-PD1-pp的备用载体
设计ΗΠ的引物，相应的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，需要包含酶切位点，从5'-3'排列如下所示:
【权利要求】
1.重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤为: ①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的roi基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； ②优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上，构建得到闻效表达载体； ③高效表达载体转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有相应蛋白酶的质粒转入Rosseta菌株,一起诱导表达；随后将两种菌株以任意比例混合； ④用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使与蛋白酶切位点序列对应的蛋白酶酶切完全，释放出rhaFGF蛋白，得到高浓度的含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液； ⑤将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液进行纯化处理，得到高纯度的rhaFGF蛋白，进行SDS-PAGE分析和含量测定。
2.根据权利要求1所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，步骤②中的标签序列为六个连续的组氨酸标签序列HIS6，蛋白酶切位点序列为pp蛋白酶切位点序列，载体为pET-26b ;步骤③中的相应蛋白酶为pp蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤②为:优化的haFGF基因3'末端增加HIS6，构建得到基因片段haFGF- HIS6 ；优化的PDI基因5'末端加入pp蛋白酶`切位点序列，构建得到基因片段pp-PDI ;然后将基因片段PP-PDI接到基因片段haFGF- HIS6的3'末端一起克隆进入pET_26b载体，构建得到高效表达载体 pET-26b-haFGF- HIS6-pp_PDI。
4.根据权利要求2所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，所述的步骤②为:优化的PDI基因5'末端加入pp蛋白酶切位点序列，构建得到基因片段PP-PDI ;基因片段pp-PDI克隆进入pET-26b载体，构建得到pET-26b_ pp-PDI备用载体；优化的haFGF基因3'末端增加HIS6，构建得到基因片段haFGF- HIS6 ;基因片段haFGF- HIS6克隆进入pET-26b- pp-PDI备用载体，构建得到高效表达载体pET_26b_haFGF-HIS6-PP-PDI。
5.根据权利要求1至4的任一权利要求所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，步骤③中haFGF重组蛋白菌株与蛋白酶菌株的质量比为50:1。
6.根据权利要求1至4的任一权利要求所述的重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，步骤⑤中的纯化处理为:将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液的PH值调整至8，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲液上柱，15mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白，透析过夜。
【文档编号】C12N15/70GK103882047SQ201410098355
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】杨霞 申请人:太原锦波生物医药科技有限公司