Dgo_CA2008基因在微生物催化合成中的应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种在多聚酮类次生代谢产物合成过程中发挥聚酮合酶功能的新型基因。

背景技术：

戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)分离自沙漠戈壁，具有超强的耐电离辐射、耐紫外辐射、耐干旱和抗氧化的微生物。其保护DNA和蛋白免受氧化损伤的机理一直都是研究的热点，但是对于其次级代谢产物的研究却相当困乏。关于其他次级代谢产物的研究以及相关基因的功能鉴定鲜有报道。III型聚酮合酶作为次级代谢十分重要的一个酶而存在于异常球菌属，尤其是戈壁异常球菌中，其功能以及作用机理仍然未知。Dgo_CA2008预测为III型聚酮合酶基因，与拟南芥III型聚酮合酶查尔酮合成酶(Arabidopsis thaliana TT4CHS)的一致性仅为为30％。

次生代谢产物是由次生代谢产生，以初级代谢产物为前体的一类细胞生命活动生长发育正常运行非必需的小分子有机化合物。微生物次生代谢产物因其结构与活性的多样性在医药和农业生产上具有广泛的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是从戈壁异常球菌Deinococcus gobiensis中发现一种用于聚酮类化合物合成的聚酮合酶基因。

本发明通过如下研究，首次发现耐辐射异常球菌Dgo_CA2008基因(GeneID：12814735；ProteinID：WP_043801951.1)可用于微生物化合物生物合成。具体研究工作如下：

1、获得含有Dgo_CA2008基因的重组工程菌株

1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出Dgo_CA2008基因，基因序列号为：GeneID：12814735。其大小为1068bp，该基因编码355个氨基酸，将其克隆于载体pJET上，构建了含有完整Dgo_CA2008基因的重组质粒pJET-CA2008；

2)将Dgo_CA2008基因连接于pT7-FLAG^TM-3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌中都起作用的T7启动子，构建含有T7启动子的完整Dgo_CA2008基因重组质粒pT7-FLAG-CA2008；

3)将导入Dgo_CA2008基因的重组质粒pT7-FLAG-CA2008转入受体大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM-CA2008(详见实施例1)；

2、含有Dgo_CA2008基因重组工程菌株的化合物合成检测实验

实验证实，Dgo_CA2008基因在大肠杆菌中诱导表达，含有耐辐射异常球菌Dgo_CA2008基因的JM-CA2008重组菌株能够合成三酮吡喃酮。

此实验表明：耐辐射异常球菌Dgo_CA2008基因具有在微生物中催化小分子化合物发生脱羧缩合反应合成吡喃酮类聚酮化合物功能。

序列表信息

SEQ ID NO.1：Dgo_CA2008基因的DNA序列。

SEQ ID NO.2：Dgo_CA2008的氨基酸序列。

附图说明：

图1工程菌株JM-CA2008与对照菌株JM-F3的产物化合物的HPLC分析。

图2底物化合物和产物1号化合物质谱解析图；

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化羟基化的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

表达质粒pT7-FLAG^TM-3：为Sigma-Aldrich公司市售产品；

大肠杆菌JM 109：为北京全式金公司市售产品。

实施例1耐辐射异常球菌Dgo_CA2008基因序列在大肠杆菌中的表达

一、实验方法

1.根据已公布的耐辐射异常球菌基因组中的Dgo_CA2008基因序列设计1对PCR特异性引物：

CA2008-F：5′CTTGCGGCCGCGATGGCTCCCACCGTGCGGTC 3′

CA2008-R：5′ATCTAGATCTGCCTACGCCCCCGCAGAGGCCG 3′

2.通过PCR方法从耐辐射异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。

反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]35个循环，72℃10min。

3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-CA2008，并测序验证；然后通过NotI/BglII双酶切获得含有粘性末端的Dgo_CA2008基因及含有T7启动子的pT7-FLAG^TM-3载体，将Dgo_CA2008基因连接于pT7-FLAG^TM-3载体上，构建大肠杆菌表达载体pT7-FLAG-CA2008。

4.将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为JM-CA2008。含有pT7-FLAG^TM-3对照空质粒的E.coli JM109命名为JM-F3。

二、实验结果

成功构建了表达Dgo_CA2008的重组大肠杆菌工程菌株。

实施例2含耐辐射异常球菌菌株Dgo_CA2008基因重组工程菌株的催化活性实验

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的含有Dgo_CA2008基因的JM-CA2008菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM-F3菌株。

二、实验方法

1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；

2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的100mL液体LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6。

3.向培养基中加入终浓度0.5mM的蛋白表达诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和终浓度0.1mM的延伸底物丙二酰辅酶A，20℃继续培养20小时。

4.用6N HCl调节菌液的pH至5.0，加入100mL乙酸乙酯，旋转混匀提取约10min，室温下离心10分钟，收集上层液体。

5.向管中加入3mL无菌水，洗涤菌体。转移菌体至15mL离心管中。4℃，离心10min；弃去上清。

6.将上层液体转移至圆底烧瓶，真空低温(30℃)蒸馏，除去乙酸乙酯。加1mL甲醇重新溶解提取物。离心10min，取20μL上样HPLC分析或-80℃冰箱保存备用。

7.HPLC分析条件。流动相：H2O/乙腈；0min，H2O:乙腈＝100:0；30min，H2O:乙腈＝0:100；45min，H2O:乙腈＝0:100。流速0.8mL/min，分析波长主要有300nm，280nm，254nm

8.对HPLC分析所得的1号主峰化合物(即1号产物)进行液相色谱-质谱分析(LC-MS)和核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)分析。

三、产物分析

HPLC分析结果如图1显示，表达耐辐射异常球菌菌株Dgo_CA2008基因重组工程菌株JM-CA2008与含有空质粒的对照菌株JM-F3的产物峰型显著不同。图1中重组工程菌株JM-CA2008在保留时间30分钟处，出现一系列产物峰。HPLC分析所得1号产物的液相色谱-质谱分析(LC-MS)结果如图2显示，该化合物分子量为292。核磁共振方法(1H-NMR和13C-NMR)对1号产物结构进行了解析。分析结果确认该1号产物是4-羟基-6-(十三烷-6’-烯基)-2-吡喃酮(表1，图2)。

1号产物是一种聚酮类化合物。

表1.产物1的核磁共振数据

说明：在上述实验中：

1、IPTG是诱导重组菌株表达Dgo_CA2008蛋白的诱导物，并非催化反应的底物；

2、反应的起始底物源自菌株内，是细胞内代谢物。从产物的结构推测出，该起始底物应该是一种长链脂肪酰辅酶A。

2、丙二酰辅酶A是另一种反应底物，即延伸底物

Dgo_CA2008编码的酶催化的反应方程式如下：

上述实验表明，Dgo_CA2008能够以细胞内代谢物的长链脂肪酰辅酶A为起始底物，以丙二酰辅酶A为延伸底物合成聚酮类化合物。

四、实验结论

耐辐射异常球菌Dgo_CA2008基因编码的Dgo_CA2008蛋白能够作为聚酮合酶，催化微生物中小分子化合物发生脱羧缩合反应，合成吡喃酮类化合物。

已有证明，该蛋白为细菌III型聚酮合酶，在医药、工业和农业的化合物生物合成上具有重要的应用潜力。