一种高效重组表达PCV2的方法与流程

本发明涉及一种高效重组表达PCV2的方法，尤其是一种基于三维结构设计并构建重组表达PCV2的真核表达系统的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

PCV2(猪圆环病毒2型)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。自1991年在加拿大猪群中爆发PMWS以来，PMWS已给全世界养猪业造成极大的经济损失。近年来，我国猪群也有PMWS流行，所造成的危害十分严重。

目前，疫苗免疫是控制PCV2感染及其相关疾病的重要手段，2010年我国研制出全病毒灭活疫苗，但PCV2在体外细胞内增值能力弱，培养难度较大，病毒最终滴度低，提供的病毒抗原含量有限，制备高质量的PCV2疫苗需要浓缩病毒抗原，这将直接导致疫苗生产成本高昂，不能满足动物疫苗质优价廉的实际要求。

昆虫杆状病毒表达系统(insect baculovirus expression vector system,IBEVS)基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立起来的表达体系，是将外源基因整合到杆状病毒基因组上形成重组杆状病毒，在昆虫细胞或虫体中可表达外源蛋白的一种真核表达系统。是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统之后建立起来的，现已成为基因工程四大表达系统之一。利用该系统获得的重组蛋白可用于药物开发、疫苗生产、生物杀虫剂等多个领域。但由于表达出来的PCV2蛋白通过传统的CsCl₂密度梯度离心的纯化方法过程比较复杂，并且得率较低，大概只有5mg/L。

技术实现要素：

本发明根据PCV2已有结构，在PCV2蛋白的第62-63个氨基酸之间或者第112-113个氨基酸之间插入His亲和标签，再通过杆状病毒表达系统构建用Sf9细胞在无血清培养基表达重组蛋白PCV2，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白PCV2。

PCV2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，分别在第62-63个氨基酸之间或者第112-113个氨基酸之间插入His亲和标签，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的重组蛋白序列。

在本发明的一种实施方式中，本将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25～27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组PCV2蛋白。

在本发明的一种实施方式中，本将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，Sf9的活细胞浓度为0.45×10⁶cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h；所得细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过His FF柱，用200ml PBS洗柱子后，先用100ml含10mM咪唑的PBS溶液洗杂，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到重组蛋白。

杆状病毒表达系统是一个成熟、高效的真核表达系统，其表达产物的生物学活性、结构与功能特点、抗原性和免疫原性等与天然外源基因产物极其相似，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，病毒的增殖和病毒蛋白的表达仅发生在昆虫细胞中，对脊椎动物无感染性，其表达的产物具有较高的生物安全性。

本发明在PCV2结构的合适的loop区插入His标签，通过bac to bac杆状病毒表达系统用Sf9细胞在无血清培养基实现表达，并且通过His FF的一步分离富集轻松获得了较多的目的蛋白，得率为15mg/L，比传统的CsCl₂、蔗糖密度梯度离心方法得到的蛋白产量提高了3倍之多。本发明制备得到的P3代重组杆状病毒通过蚀斑实验测得其病毒滴度为1.035×10⁹pfu/ml。总的来说，本发明与传统的CsCl₂、蔗糖密度梯度离心方法相比，减少了反复高速超速离心所需要的高端离心机，同时也缩短了至少一天的实验时间，提高了蛋白提取效率，降低了由于反复离心过程中蛋白的损耗，为之后PCV2亚单位疫苗的研制打下了基础。

附图说明

图1重组BacmidPCR检测电泳结果；其中，Lane M＝DNA Marker，Lane 1＝Bacmid(PCV2(V62-K63ins His))PCR产物，Lane2＝Bacmid(PCV2(V62-K63ins His))PCR产物，Lane3＝未重组杆状病毒DNA PCR产物。

图2转染后细胞状态对比；其中(A)正常sf9细胞(B)转染的sf9细胞。

图3 PCV2(V62-K63ins His)重组病毒表达优化全细胞检测电泳结果；其中Lane M＝标准蛋白Marker；Lane 1＝普通细胞对照；Lane 2-10＝重组病毒感染24h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h时的细胞。

图4 PCV2(T112-Q113ins His)重组病毒表达优化全细胞检测电泳结果；其中Lane M＝标准蛋白Marker；Lane 1＝普通细胞对照；Lane 2-10＝重组病毒感染24h，48h，60h，72h，84h，96h，108h，120h，132h时的细胞。

图5 PCV2(V62-K63ins His)SDS-PAGE及WB检测结果；其中，Lane M＝蛋白Marker，Lane 2＝His FF洗脱液，Lane 2＝细胞培养上清液，Lane 3＝全细胞沉淀物。

图6 PCV2(T112-Q113ins His)SDS-PAGE及WB检测结果；其中，Lane M＝蛋白Marker，Lane 2＝His FF洗脱液，Lane 2＝细胞培养上清液，Lane 3＝全细胞沉淀物。

具体实施方式

质粒、菌种和细胞：昆虫细胞草地夜蛾(Spodoptera frugierda)卵巢组织细胞购自Invitrogen生物公司。转染所用重组杆状病毒pFastBac1_PCV2(V62-K63ins His)，pfastBac1_PCV2(T112-Q113ins His)由金斯瑞公司合成。

培养基及试剂：Sf9无血清培养基、Grace’s Insect Medium培养基、Sf-900ⅡSFM无血清培养基、转染试剂Cell Fectin、Bac PAK qPCR Titration Kit、Bac PAK Baculovirus Rapid Titer Kit、Chromogenic Western Blot Immunodetection Kit购自Invitrogen公司。

仪器：NBS Innova 4300恒温摇床，生物反应器为无锡汇森5L搅拌式生物反应器，细胞计数仪为罗氏医用细胞计数仪，AKTA FPLC快速蛋白纯化液相，安捷伦LC-MS质谱分析仪。

实施例1

主要步骤包括：合成插入His亲和标签的携带重组PCV2的重组质粒，重组质粒转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞、经抗性及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒DNA(重组Bacmid)，提取的重组杆状病毒DNA转染至Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒。

(1)重组杆状病毒穿梭载体的构建与筛选

原蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，将GQGSSHHHHHHSSGQG序列插入到62-63氨基酸中间，最终得到的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。将编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因序列连接到pFast Bac1载体4102-4103bp多克隆位点上，得到重组杆状病毒穿梭载体。

重组杆状病毒穿梭载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid质粒发生定点转座，进行卡那霉素、庆大霉素、四环素和IPTG、X-gal平板蓝白斑筛选，经过48h避光生长，挑取平板上的白色单菌落接入5ml LB培养基中培养过夜，提取重组Bacmid质粒，PCR鉴定目的片段，以蓝斑菌落作为阴性对照。如图1所示，提取的重组Bacmid质粒为重组成功的Bacmid。

(2)高滴度重组杆状病毒的获得

利用Cellfectin转染试剂将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，活细胞浓度为0.45×10⁶cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h，待细胞出现明显病变后，收集细胞上清，3500rpm/min，离心5min，4℃避光保存，即为P1代病毒。取P1代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％～70％之间，则收集上清，此为P2代病毒。取P2代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％-70％之间，则收集上清，此为P3代病毒。通过蚀斑实验纯化得到高效的病毒，于4℃避光保存。如图2所示，为P3代病毒转染Sf9昆虫细胞，约96h后，细胞出现明显的病变状态，细胞核变大，细胞膨胀甚至破裂死亡，贴壁状态明显变少。制备得到的P3代重组杆状病毒通过蚀斑实验测得其病毒滴度为1.035×10⁹pfu/ml。

(3)重组病毒蛋白的表达优化

用P3病毒感染对数期SF9细胞，MOI＝10，在24h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h时分别取样跑胶，检测PCV的最适及最佳表达量的生长时间。根据如图3所示的SDS-PAGE结果，PCV2cap蛋白在感染60h后在SDS-PAGE上出现一条明显的条带(≈27kD)，与目的蛋白大小一致，通过蛋白条带的粗细可以初步判断，目的蛋白的表达量在感染84h～108h时达到最高点，120h之后开始有减弱的趋势，可能由细胞衰老和蛋白降解导致。

(4)重组病毒蛋白的大量表达及纯化

根据步骤(3)得到的最适时间，用P3病毒感染对数期Sf9细胞，MOI＝10，96h后收细胞。细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取细胞破碎液上清过His FF柱，用PBS洗柱子约200ml后，先用含10mM咪唑的PBS溶液洗杂约100ml，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到的样品中PCV2的浓度为15mg/L，样品跑胶并做Western检测，如图5所示，在27kD处得到单一条带，确定重组蛋白成功表达。

实施例2

(1)重组杆状病毒穿梭载体的构建

原蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，将GQGSSHHHHHHSSGQG序列插入到112-113氨基酸中间，最终得到的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。将编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因序列连接到pFast Bac1载体上，得到重组杆状病毒穿梭载体。

重组杆状病毒穿梭载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid质粒发生定点转座，进行卡那霉素、庆大霉素、四环素和IPTG、X-gal平板蓝白斑筛选，经过48h避光生长，挑取平板上的白色单菌落接入5ml LB培养基中培养过夜，提取重组Bacmid质粒，PCR鉴定目的片段，以蓝斑菌落作为阴性对照。如图1所示，提取的重组Bacmid质粒为重组成功的Bacmid。

(2)高滴度重组杆状病毒的获得

利用Cellfectin转染试剂将重组质粒转染的Sf9昆虫细胞，活细胞浓度为0.45×10⁶cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h，待细胞出现明显病变后，收集细胞上清，3500rpm/min，离心5min，4℃避光保存，即为P1代病毒。取P1代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％～70％之间，则收集上清，此为P2代病毒。取P2代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％-70％之间，则收集上清，此为P3代病毒。通过蚀斑实验纯化得到高效的病毒，于4℃避光保存。病毒滴度为1.035×10⁹pfu/ml。

(3)重组病毒蛋白的表达优化

用P3病毒感染对数期SF9细胞，MOI＝10，在24h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h时分别取样跑胶，检测PCV的最适及最佳表达量的生长时间。根据图4所示的SDS-PAGE结果，PCV2cap蛋白在感染60h后在SDS-PAGE上出现一条明显的条带(≈27kD)，与目的蛋白大小一致，通过蛋白条带的粗细可以初步判断，目的蛋白的表达量在感染84h～108h时达到最高点，120h之后开始有减弱的趋势，可能由细胞衰老和蛋白降解导致。

(4)重组病毒蛋白的大量表达及纯化

根据之前小试得到的最适时间，用P3病毒感染对数期Sf9细胞，MOI＝10，96h后收细胞以及上清。细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过His FF柱，用PBS洗柱子约200ml后，先用含10mM咪唑的PBS溶液洗杂约100ml，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到的样品跑胶并做Western检测。如图6所示，在27kD处得到单一条带，确定重组蛋白成功表达。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 无锡佰翱得生物科学有限公司

<120> 一种高效重组表达PCV2的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> 猪

<400> 1

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Leu His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Ser Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

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