香菇C91‑3菌株的Latcripin‑8基因片段、编码蛋白、制备方法及用途与流程

本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-8基因片段、编码蛋白制备方法及用途，所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤及清除自由基及染料废水脱色等功能。

背景技术：

真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-40]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。虽然目前已有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段、编码蛋白及制备方法的相关报道，但是不同的基因片断的作用效果不尽相同，亟待开发更多的表达蛋白药效强、靶向性好、具备产业价值的香菇C91-3cDNA的基因片段。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-8基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤及清除自由基等功能。

本发明的技术解决方案是：一种香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ和NotⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

d. 回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化762bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

所述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000 r/min离心，15 min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15 min，再次4˚C，12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

所述c步骤的PCR反应体系50 µl： cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTP Mixture 4 µl、5×PrimeSTAR Buffer 10 µl、2.5 U/µl 的PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段编码蛋白在制备抗肿瘤、抗氧化或抗衰老药物中的应用。

本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-8基因片段，该基因片段所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤及清除自由基等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于原核表达体系中进行高效表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备治疗肿瘤、抗氧化或抗衰老药物，增加药物种类。

附图说明

图1是本发明实施例 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2是本发明实施例所用载体 pET-32a（＋）双酶切后的电泳图。

图3是本发明实施例提取的Latcripin-8基因片段转化后的单克隆阳性菌落。

图4是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图5是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。

图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。

图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白对SGC细胞的生长抑制率示意图。

香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；

分类命名：香菇（Lentinula edodes）；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏号：CGMCC No.7354。

具体实施方式

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA：

取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入1ml的Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入然后加入0.2 ml氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000 r/min离心，15 min；吸取上层水相溶液0.5 ml并转移至另一干净的1.5 ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置15 min，再次4˚C,12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇1 ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

紫外分光光度计验证纯度，OD260/280比值在1.8~2.0之间。

进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

反应体系：香菇菌丝体总RNA (1µg/µl) 1 µl、3’ RACE Adaptor (5 µM) 1 µl、dNTP Mixture (10 mM each) 1 µl、RNase Free dH₂O 4.5 µl；

反应条件：70℃，10 min 立即冰上放置2分钟；

然后加入下列组分：5× M-MLV Buffer 2µl、 RNase Inhibitor (40 U/µl) 0.25 µl、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNA酶) (200 U/µl) 0.25 µl，体系总体积达到10 µl。

反应条件： 42℃，60 min 70℃，15 min 得到反转录反应液（cDNA）。

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ和NotⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

引物委托宝生物（大连）公司合成。

PCR反应体系50 µl： cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg^2＋plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。

PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M ： DL2,000 DNA Marker；1：Latcripin-8目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。

d. 回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化762bpMarker附近的明

显条带，切胶回收DNA片段，命名为Latcripin-8基因片段。

实验：

1. Latcripin-8基因片段序列测定：

测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin-8基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1。Latcripin-8的基因片段序列长为762bp的cDNA，其含有254个密码子可读框（ORF）。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。

2. Latcripin-8基因片段的克隆表达

2.1 载体构建

2.1.1 将质粒pET-32a（＋），使用BamHⅠ/NotⅠ进行酶切；

反应体系 （37℃过夜）：

pET-32a（＋）（100 ng/µl） 10 µl

10×K Buffer 5 µl

EcoRⅠ（10 U/µl） 1 µl

XhoⅠ（10 U/µl） 1 µl

dH₂O Up to 50 µl

取5 µl 进行1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，M ： λ-Hind Ⅲ digest；1 ：pET-32a（＋）-plasmid；p；2 ：ET-32a（＋）- BamHⅠ/NotⅠ，表明质粒切割完全，可进行后续实验。

2.1.2 载体回收

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收约5.9 kbp 的DNA 片段。

2.1.3 将pET-32a（＋）载体与本发明实施例的Latcripin-8基因片段进行重组

使用In-Fusion® HD Cloning Kit，分别将本发明实施例的Latcripin-8基因片段与酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下：

Latcripin-8基因片段（100 ng/µl） 2 µl

酶切后回收载体（50 ng/µl） 1µl

5xIn-Fusion HD Enzyme Premix 2 µl

dH₂O Up to 10 µl

50℃ 15 min

取上述In-Fusion 产物2.5 µl 热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中，涂布于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37 ℃ 过夜培养。培养结果如图3所示，表明重组载体成功转化到宿主菌中，并获得阳性菌落。

同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基于37 ℃ 培养14小时，采用宝生物公司Plasmid Miniprep Kit V3.l 抽提质粒进行测序鉴定，结果如SEQ ID NO.1。

2.2 Latcripin-8蛋白的诱导表达及鉴定

2.2.1 Latcripin-8蛋白的自诱导表达

挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于10 ml 含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基中，于37 ℃ 下，120 r/min 振荡培养过夜，再接种于100 ml含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的自诱导培养基中，于37 ℃ 下，120 r/min 振荡培养4小时。取菌液进行反复冻融破碎（4次），低温（4℃）离心5000 r/min，5 min，取上清，加入50 μl PBS。将上清按蛋白样品处理方法处理后，做12%SDS-PAGE电泳图如

图4所示，图4中M：标准蛋白； 1：Lp-8全菌蛋白，表明重组蛋白在阳性菌株中成功表达。

2.2.2目标蛋白Western-blotting 鉴定分析

将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭120分钟后，第一抗Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody，4℃孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育60分钟，显色试剂盒显色如图5所示，证明诱导表达的重组蛋白确实为目的蛋白。

2.3 Latcripin-8蛋白的纯化及活性鉴定

2.3.1. Latcripin-8蛋白的纯化

将上述条件诱导的菌体低温5000 r/min，10 min~20 min离心，每50~100 mg菌体（湿重）加入1~2 ml细菌裂解液。10000×g，4℃离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀（包涵体）。将沉淀重悬于Binding Buffer中，10,000×g离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12%SDS-PAGE电泳验证如图6所示。图6中，1： M：标准蛋白； 1：Lp-8纯化前；2：纯化1 ；3：纯化2；4：纯化3 。

采用现有方法对纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.3.2. Latcripin-8蛋白的除盐和复性

将纯化后的Latcripin-8蛋白进行梯度透析，将Latcripin-8蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5 L~2 L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24 h~72 h，每6~8 h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至0。将透析袋中的溶液离心10000 rpm，4℃离心，20~30 min上清即为复性的重组蛋白。

2.33. Latcripin-8蛋白的活性鉴定（CCK8法）

将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用CCK8法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白作用的终浓度分别调整为12.5 µg / mL、25 µg / mL、50 µg / mL、100 µg / mL、200 µg / mL，备用。以PBS作为空白对照，评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用，选用人胃癌SGC细胞株进行CCK8实验。用0.25~1%胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×10⁴/ml。每孔加入100 ul，边缘孔用无菌PBS填充，5% CO₂，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）加入上述100 μg / mL的药物每孔200 μL，每个浓度设6个复孔，5% CO₂，37 ℃孵育24小时，48小时，并倒置显微镜下观察。48小时后弃去含有药物的培养基，然后每孔加入CCK8溶液（即10% CCK8）200μL，继续培养3小时。终止培养，置摇床上低速振荡5 min。在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值，按照下面公式计算抑瘤率（细胞生长抑制率）=（对照组平均OD值－实验组平均OD值）/（对照组平均OD值－空白组平均OD值）。目标蛋白的CCK8实验结果说明本发明基因表达的蛋白对人胃癌SGC细胞株有明显地抑制作用，在蛋白浓度为12.5 µg / mL、25 µg / mL、50 µg / mL、100 µg / mL时，24 h、48 h的抑瘤率见图7。

序列表

<110> 大连医科大学

<120>香菇C91-3菌株的Latcripin-8基因片段、编码蛋白、制备方法及用途

<160> 4

<210> 1

<211> 762

<212> DNA

<213>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）

<400> 1

1 GACTGGAAAACTCTTGGATCTGGCTCGTTTGGCAAGGTTTACAAGGGCACTTATCTTGGA

61 ATCGACGTCGCCATCAAGGAAGTCTTACCATCTACTGAATACGACGTGGCSAAATACTTT

121 GAGCGTGAATGGCGTCTCATGAAGGAATCTCGCCATCCTAATATCGTCCTCTTTCTTGGT

181 CTCTCTCGTGCTCCCGAGCCAGACAATCGCATTTTCATCGTCTCCGAGTTCATAGACAAC

241 GGCAACCTGCGTCATTACATTCACGACAAGAACAAACCRTTCCCGTGGCGTCTTCGATTG

301 TCTTTTGCCACAGATATTGCCCGTGCGCTTGCATATTTACATGCTCGAAAATGCATACAT

361 CGAGATTTGAAAGGCGAAAACCTGCTTGTCACCGCTAATGGTCGTTTGAAGATTACAGAC

421 TTTGGCTTTGCTCGGATAGCTGCCCGAAGCGAAGACGAATCSAARCGACTCACGTTTTGT

481 GGRACCGATTCGTACATGTCTCCCGAAATCCTCCTTGGAGAGGAGTTTGATCTCCCTACC

541 GACATATTCTCCTTYGGTATCATYCTCTGTGAGATCGCTGCYCGCCGACTTGCGGACGAC

601 CATCATTTCAAGCGAGCYGCACCSACTTTCTCCATMGATGCAGATGAGATCCGCAGTCTC

661 GCTAATCCAGGATGTCCGCCTGACTTGATATCATTGTGCATTGAATGCTGCTCTTCAAAT

721 CCTGCCGCTCGTCCAACGACTCGTCAAATTCTCGAGAAACTT

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）表达产物

<400> 2

1 GACTGGAAAACTCTTGGATCTGGCTCGTTTGGCAAGGTTTACAAGGGCACTTATCTTGGA

1 D W K T L G S G S F G K V Y K G T Y L G

61 ATCGACGTCGCCATCAAGGAAGTCTTACCATCTACTGAATACGACGTGGCSAAATACTTT

21 I D V A I K E V L P S T E Y D V A K Y F

121 GAGCGTGAATGGCGTCTCATGAAGGAATCTCGCCATCCTAATATCGTCCTCTTTCTTGGT

41 E R E W R L M K E S R H P N I V L F L G

181 CTCTCTCGTGCTCCCGAGCCAGACAATCGCATTTTCATCGTCTCCGAGTTCATAGACAAC

61 L S R A P E P D N R I F I V S E F I D N

241 GGCAACCTGCGTCATTACATTCACGACAAGAACAAACCRTTCCCGTGGCGTCTTCGATTG

81 G N L R H Y I H D K N K P F P W R L R L

301 TCTTTTGCCACAGATATTGCCCGTGCGCTTGCATATTTACATGCTCGAAAATGCATACAT

101 S F A T D I A R A L A Y L H A R K C I H

361 CGAGATTTGAAAGGCGAAAACCTGCTTGTCACCGCTAATGGTCGTTTGAAGATTACAGAC

121 R D L K G E N L L V T A N G R L K I T D

421 TTTGGCTTTGCTCGGATAGCTGCCCGAAGCGAAGACGAATCSAARCGACTCACGTTTTGT

141 F G F A R I A A R S E D E S X R L T F C

481 GGRACCGATTCGTACATGTCTCCCGAAATCCTCCTTGGAGAGGAGTTTGATCTCCCTACC

161 G T D S Y M S P E I L L G E E F D L P T

541 GACATATTCTCCTTYGGTATCATYCTCTGTGAGATCGCTGCYCGCCGACTTGCGGACGAC

181 D I F S F G I I L C E I A A R R L A D D

601 CATCATTTCAAGCGAGCYGCACCSACTTTCTCCATMGATGCAGATGAGATCCGCAGTCTC

201 H H F K R A A P T F S I D A D E I R S L

661 GCTAATCCAGGATGTCCGCCTGACTTGATATCATTGTGCATTGAATGCTGCTCTTCAAAT

221 A N P G C P P D L I S L C I E C C S L N

721 CCTGCCGCTCGTCCAACGACTCGTCAAATTCTCGAGAAACTT

241 P A A R P T T R Q I L E K L

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>3

GCTGATATCGGATCCGACTGGAAAACTCTTGGAT 35

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

CTTACGAGGACATCAAAGGCGACT 24