一种分离的中黑盲蝽基因及其编码的蛋白的制作方法

本发明属于昆虫基因工程技术领域。具体涉及一种分离的中黑盲蝽基因及其编码的蛋白，该基因被命名为Fatty acyl-CoA reductase基因，本发明还包括包括一条中黑盲蝽基因的RNA干扰序列的应用，通过生物学验证，本发明克隆的基因的RNA干扰序列可用于转基因抗虫植物的开发。

背景技术：

中黑盲蝽Adelphocoris suturalis(分类学上为半翅目：盲蝽科)是一种重要的多食性农业害虫，目前已记载的寄主植物有50科270种，主要寄主有棉花、小麦以及大豆等(姜玉英等，2015)。近年来，随着种植结构的调整，尤其是1997年转基因Bt棉的推广与普及，降低了棉田化学农药的施用次数和用量，导致盲蝽田间的种群数量剧增，使其由原来的次生害虫逐渐上升为主要害虫(Lu et al.,2008；Lu et al.,2010)。据统计盲蝽在2004、2005和2006年造成的产量损失分别为1991-1996年平均水平的7.77、6.58、8.81倍，并呈进一步蔓延和大面积灾变的发展趋势(陆宴辉和吴孔明，2008)。目前对于中黑盲蝽的防治还是以施用化学杀虫剂为主(刘仰青等，2007)。由于长期大量使用化学农药带来的环境压力以及抗药性等问题，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施成为了当前的防治热点。

Fatty acyl-CoA reductase的主要功能是催化脂酰辅酶A的还原反应最终生成脂肪醇类物质，广泛的存在于植物、无脊椎动物、昆虫、鸟类和哺乳动物中。近年来，人们发现Fatty acyl-CoA reductase在桡脚类动物(Teerawanichpan and Qiu,2012)，一些双翅目昆虫(Teerawanichpan and Qiu,2010；Teerawanichpan et al.,2010)，植物(Wang et al.,2015；Iven et al.,2016)以及鸟类(Hellenbrand et al.,2011)中参与了蜡酯的生物合成。在哺乳动物中，Fatty acyl-CoA reductase则是合成重要的代谢物质缩醛磷脂的关键酶酶类，Fatty acyl-CoA reductase基因的缺陷会直接影响中枢神经和软骨细胞的发育(Honsho et al.,2013)。在昆虫中，大量的研究表明Fatty acyl-CoA reductase是合成各种脂肪醇类信息素的关键酶类，对于物种的信息交流和生存十分重要(Lienard et al.,2014；Antony et al.,2015)。

目前，对于昆虫中Fatty acyl-CoA reductase的功能认知主要是其参与了各种脂肪醇类信息素的生物合成，对于其是否参与了其他重要的生命过程尚没有没有任何报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种分离的中黑盲蝽基因(该基因命名为Fatty acyl-CoA reductase)及其编码的蛋白。

本发明运用RNA干扰技术，通过体外注射中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA，发现抑制中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率。本发明首次发现Fatty acyl-CoA reductase的缺失会显著抑制中黑盲蝽的生殖能力，最终导致种群发展的衰退，为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了基础。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人分离了一种中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长为1563bp。

申请人分离了一种中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因编码的蛋白，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，编码520个氨基酸残基。

基于上述基因的分离和克隆，本发明还提供了Fatty acyl-CoA reductase基因的RNA干扰序列，该干扰序列为双链RNA分子，利用特异性引物体外合成该序列的dsRNA，显微注射至中黑盲蝽新羽化雌虫体内。结果显示该序列可显著抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达。进一步研究沉默Fatty acyl-CoA reductase基因对中黑盲蝽雌虫卵巢发育及生殖能力的影响，结果发现抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率，最终影响了中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展。该干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。

合成dsRNA特异性引物的序列如下：

上游引物dsFACR-F：CAGGAGGCTCGGGGTTTATG

下游引物dsFACR-R：TATGCGGTGGAGACGTGAAC。

本发明的积极有益效果：

(1)本发明首次发现了Fatty acyl-CoA reductase基因参与了中黑盲蝽的卵巢发育过程，Fatty acyl-CoA reductase基因表达的缺失显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率，最终导致了中黑盲蝽的生殖能力下降和种群的衰退。该基因可用于开发防治盲蝽科昆虫的产品。

(2)本发明提供了一种中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的干扰序列，该序列可显著抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，可利用该序列干扰Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，抑制中黑盲蝽的生殖能力，最终控制其种群的发展。可用于开发绿色环保的抗虫植物，最终达到绿色防治害虫的目的。

(3)利用基因工程技术，可以将外源基因导入植物表达的载体，然后导入植物细胞，可以获得抗虫的转基因细胞和转基因植株。

更详细的技术方案及其发明效果参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的核苷酸序列(即其cDNA序列)，序列全长为1563bp。

序列表SEQ ID NO：2是中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因编码的蛋白质序列，编码520个氨基酸残基。

图1：Fatty acyl-CoA reductase基因功能验证流程图。

图2：pEASY-T1克隆载体结构示意图。

图3：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA后，Fatty acyl-CoA reductase基因的沉默效率。附图标记说明：图3中的a图：Fatty acyl-CoA reductase基因在脂肪体(FB)中的沉默效率；图3中的b图：Fatty acyl-CoA reductase基因在卵巢(O)中的沉默效率。其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。图中英文缩写含义：“dsFACR”表示注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组.

图4：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢发育的影响，附图标记说明：图4中的a图：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢干重的影响；图4中的b图：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢挂卵量的影响；图4中的c图：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢发育级别的影响。其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。图中英文缩写含义：“dsFACR”表示注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组.

具体实施方式

下面实施例中所使用的技术，包括RNA的提取、cDNA合成，PCR扩增与检测，以及dsRNA合成等分子生物学技术，除非特别说明，均为本领域内技术人员已知的常规技术。所使用的仪器设备、试剂等，除非本说明书特别注明，均为本领域技术人员可通过公关途径或商业途径获得。

实施例1中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的克隆与分析

(1)中黑盲蝽总RNA的提取：称取20mg的中黑盲蝽样品置于1.5ml无酶管中，利用一次性无酶研磨棒及液氮充分研磨后，使用Promega公司的SV total RNA isolation system提取试剂盒提取总RNA，详细步骤参照该试剂盒说明书。

(2)cDNA的合成：使用宝生物工程大连有限公司的PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒将上述步骤(1)中提取的总RNA合成cDNA模板(详细步骤参照该试剂盒说明书)。

(3)引物设计：利用转录组测序得到Fatty acyl-CoA reductase基因核酸序列(见SEQ ID NO：1)，设计引物验证预测的开放阅读框。设计并合成的引物如下：

上游引物序列FACR-F：5'-GCTCGTGCCAAACCAGTCAG-3'，

下游引物序列FACR-R：5'-ATCCACGTGGTTGGTGCTTG-3'。

以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(4)PCR扩增：利用上述引物FACR-F和FACR-R进行PCR扩增，PCR体系参照宝生物工程大连有限公司的Ex Taq酶使用说明书。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen公司的的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。

(5)PCR产物的克隆：利用TransGen公司的的pEASY-T1Simple Cloning Kit，按照说明书将PCR产物连接到pEASY-T1载体(见图2)上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆子送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

(6)序列分析：利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)将测序所得的Fatty acyl-CoA reductase基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列比对验证其正确性，结果显示，测序结果一致。利用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(见SEQ ID NO：2)，结果显示，Fatty acyl-CoA reductase基因开放阅读框架全长1563bp，编码520个氨基酸残基，预测分子质量为58.9628KD，理论等电点为8.73。本发明进一步将其与其它昆虫的5条Fatty acyl-CoA reductase氨基酸序列进行比对，确认本发明分离的蛋白具有典型的Fatty acyl-CoA reductase蛋白特征。

实施例2 dsRNA合成

1.dsRNA模板的制备：

(1)根据实施例1中所获得的Fatty acyl-CoA reductase基因序列，通过siDirect version 2.0预测dsRNA区域，并利用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)设计特异性扩增引物(5'-端加上T7promoter序列)，用于Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA片段的扩增，设计的特异性引物如下：

上游引物序列dsFACR-F：CAGGAGGCTCGGGGTTTATG，

下游引物序列dsFACR-R：TATGCGGTGGAGACGTGAAC。

利用上述引物dsFACR-F和dsFACR-R进行PCR扩增，PCR反应体系参照宝生物工程大连有限公司的Ex Taq酶使用说明书。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。最后通过TA克隆将其连接到pEASY-T1载体(见图2)上。

(2)利用AxyGen的AxyPrep Plasmid Miniprep kit试剂盒提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，利用上述特异性引物dsFACR-F和dsFACR-R进行第二次PCR扩增，PCR体系和反应程序同上述(1)。

2.dsRNA模板的纯化

将第二次PCR的产物利用酚氯仿抽提法纯化，具体操作步骤如下：

(1)将需要纯化的材料用DEPC H₂O定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。

(2)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，充分震荡后，室温，12000rpm，离心10min。

(3)取上层相(约250μl)，置于新的无RNA酶1.5ml离心管中加入1/10体积(25μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(约550μl)的无水乙醇(-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃沉淀3h。

(4)4℃，12000rpm，离心15min，弃上清液。

(5)加入75％乙醇(用DEPC H₂O配制，-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。

(6)4℃，7500rpm，离心5min。

(7)弃上清液，风干沉淀，加入20μl DEPC H₂O溶解沉淀。

(8)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，并用NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值。

3.dsRNA合成：

(1)dsRNA合成反应体系

dsRNA的合成反应体系见表1。

表1 dsRNA合成反应体系

轻弹混匀，瞬时离心。37℃，4小时。

(2)DNAse I消化DNA模板，按照比例加入如表2所述的试剂。

表2 DNAse I消化反应体系

充分混匀，瞬时离心，37℃，30min。

4.dsRNA纯化：

(1)将需要纯化的材料用DEPC H₂O定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。

(2)加入150μl的水饱和酚和150μl氯仿，充分震荡后，4℃，12000rpm，离心15min。

(3)取上层相(约250μl)，置于新的无RNA酶1.5ml离心管中加入1/10体积(25μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(约700μl)的无水乙醇(-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃静置过夜。

(3)4℃，12000rpm，离心30min，弃上清液。

(4)加入75％乙醇(DEPC H₂O配制，-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。

(5)4℃，7500rpm，离心5min。

(6)弃上清液，风干沉淀，加入20μl DEPC H₂O溶解沉淀。

(7)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA质量，并用NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值。

(8)将dsRNA稀释成10μg/μl备用。

实施例3注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA后基因的沉默效率及其对中黑盲蝽生殖发育的影响。

以合成的dsGFP为对照，利用显微注射仪，将合成的dsRNA从中黑盲蝽后胸与腹部节间膜的最外侧注射入新羽化雌虫体内。

分别收集注射处理后5和10天的中黑盲蝽脂肪体及卵巢组织，提取总RNA，合成cDNA后，利用宝生物工程大连有限公司的Premix ExTaq^TM II和Bio-Rad Detection iQ2System.检测Fatty acyl-CoA reductase基因的沉默效应。

注射处理10天后，解剖并观察中黑盲蝽卵巢发育情况，20头虫子为一个处理组，统计并分析中黑盲蝽卵巢的挂卵量及其干重的变化。

分别解剖并观察注射处理1、5、10天后中黑盲蝽卵巢的发育级别，20头虫子为一个处理组，统计并分析注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽卵巢发育级别的影响。

将注射dsRNA处理后的雌虫与新羽化的雄虫一一配对，单独饲养，雄虫死亡及时补充新的性成熟的雄虫，分别统计产卵前期及产卵量，以35-45对虫子为一个处理组，分析注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽产卵前期及产卵量的影响。

分别收集注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组及注射GFP基因dsRNA的对照组交配雌虫所产卵粒，500-600粒卵为一个处理组，统计并分析注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽卵的孵化率的影响。实施效果见表3。

试验结果及分析：

(1)注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA后该基因的沉默效率

qRT-PCR检测结果显示：与对照组相比，注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA显著抑制了Fatty acyl-CoA reductase在脂肪体(见图3中的a图)及卵巢(见图3中的b图)内的表达。由此可见，该中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的干扰序列可显著抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达。

(2)注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽雌虫卵巢发育的影响

在实验室内，申请人利用体式显微镜(型号SMZ—t4，重庆奥特光学仪器有限责任公司)解剖并观察注射处理10天后中黑盲蝽卵巢发育情况，分别统计了卵巢的挂卵量及干重，结果显示，与对照组相比，注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA处理组的中黑盲蝽卵巢的干重和挂卵量分别下降了45.52％(见图4中的a图)和35.87％(见图4中的b图)。此外申请人还观察并统计了注射处理1、5、10天后中黑盲蝽卵巢发育级别的变化，结果显示，仅在注射处理5天时Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA处理组卵巢的发育级别显著低于与对照组。注射处理1和10天均无显著差异(见图4中的c图)。由此可见，注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA可显著减少了中黑盲蝽雌虫卵巢的挂卵量和干重，抑制了卵巢的发育。

(3)注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响

将注射dsRNA处理后的雌虫与新羽化的雄虫一一配对，单独饲养，雄虫死亡及时补充新的性成熟的雄虫，分别统计产卵前期及产卵量，结果显示，与对照组相比，注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA处理组的中黑盲蝽产卵量下降了51.51％，产卵前期则没有显著差异(见表3)。申请人同时收集了注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组及注射GFP基因dsRNA的对照组交配雌虫所产卵粒，观察并统计其孵化率，结果显示处理组卵的孵化率仅

表3注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响

表3说明：注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响。其中“ns”表示无显著差异；“*”表示p<0.05“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。图中英文缩写含义：“dsFACR”表示注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组。为28.19％，与对照组相比下降了68.45％(见表3)。由此可见，抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率，最终影响了中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展。因此本发明提供的RNA干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。进一步开发其蛋白可应用于中黑盲蝽的生物防治。

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