一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途与流程

本发明涉及一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途，具体地，涉及一种DNA分子及其制备方法与应用、重组病毒及其制备方法与应用以及重组蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

手足口病(hand,foot and mouth disease，HFMD)是由人类肠道病毒(Enterovirus)感染引起的一种自限性疾病，临床症状主要表现为发热，手和足部出现皮疹，口腔粘膜出现水疱，有时还会出现严重的神经系统并发症(无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、迟缓性瘫痪等)。在西太平洋地区，HFMD已成为5岁以下儿童发病和死亡的主要原因。

在过去的十年间，全球暴发了多次较大的HFMD疫情，主要发生于中国、日本、马来西亚、新加坡和越南等国家。2008年，我国的安徽省阜阳市发生了HFMD大暴发，自此，HFMD被列为我国法定的C类传染病。而且，在我国，HFMD的发生正呈现逐年上升的趋势。目前，HFMD已成为全球重要的公共卫生问题，针对手足口病的治疗尚无特效药，主要以对症治疗和支持疗法为主。因此，研发有效的HFMD疫苗已迫在眉睫。

EV71和CA16同属小RNA病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus genus)A群，具有相似的基因组结构，为单股正链RNA，基因组大小为7.5Kb，编码4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。病毒颗粒为正二十面体立体对称的球形，直径约为24-30nm。病毒衣壳由60个相同的亚单位构成，每个亚单位由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成，其中VP1、VP2、VP3暴露在病毒颗粒的表面，与病毒的免疫应答有关，而VP4则完全位于病毒颗粒的内部，保持病毒的完整性。在4种结构蛋白中，VP1含有主要的中和表位，用于病毒的识别和进化分析。

目前，针对手足口病的疫苗多为单价候选株，其中，甲醛灭活的EV71疫苗候选株发展最为迅速，已经进入了临床III期试验，在人体可产生完全的保护。但是，分子流行病学监测结果显示，肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16，CA16)是引起HFMD的最常见的病原体，而且，通常情况下，这两种病毒会共流行。遗憾的是，EV71疫苗免疫并不能保护CA16的攻击。因此，如果在临床上应用EV71单价疫苗将不能减少HFMD的发病率。而且，如果EV71单价疫苗免疫获得成功，CA16将成为HFMD的主要病原体。因此，发展针对EV71和CA16的双价疫苗是预防HFMD流行的理想策略。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够用于制备针对EV71和CA16的双价疫苗的DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种DNA分子，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白VP4的编码序列、衣壳蛋白VP2的编码序列、衣壳蛋白VP3 的编码序列、重组的衣壳蛋白VP1的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白VP4的编码序列、衣壳蛋白VP2的编码序列、衣壳蛋白VP3的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于肠道病毒71型，重组的衣壳蛋白VP1的编码序列由串联连接的第一衣壳蛋白VP1的编码序列、短肽的编码序列和第二衣壳蛋白VP1的编码序列组成，所述第一衣壳蛋白VP1的编码序列和第二衣壳蛋白VP1的编码序列分别来源于肠道病毒71型的衣壳蛋白VP1的编码序列的第1-300位核苷酸序列和第301位之后的核苷酸序列，所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的DNA分子的方法，该方法包括在肠道病毒71型基因组RNA对应的cDNA中衣壳蛋白VP1的编码序列第300-301位核苷酸之间插入短肽的编码序列。

第三方面，本发明提供了一种重组病毒，该重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与第一方面所述的DNA分子的序列相同。

第四方面，本发明提供了一种制备上述重组病毒的方法，该方法包括在肠道病毒71型基因组中衣壳蛋白VP1的编码序列第300-301位核苷酸之间插入短肽的编码序列。

第五方面，本发明提供了一种重组蛋白，该重组蛋白含有串联连接的第一衣壳蛋白VP1的氨基酸序列、短肽的氨基酸序列和第二衣壳蛋白VP1的氨基酸序列，所述第一衣壳蛋白VP1的氨基酸序列和第二衣壳蛋白VP1的氨基酸序列分别来源于肠道病毒71型的衣壳蛋白VP1的氨基酸序列的第1-100位氨基酸序列和第101位之后的氨基酸序列，所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第六方面，本发明提供了编码上述重组蛋白的DNA分子。

第七方面，本发明提供了含有第一方面和/或第六方面所述的DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

第八方面，本发明提供了一种疫苗，该疫苗的活性成分为上述重组病毒和/或重组蛋白。

第九方面，本发明提供了上述DNA分子、重组病毒和重组蛋白中的至少一个在制备用于预防EV71型感染和CA16型感染的双价疫苗中的应用。

第十方面，本发明提供了一种预防EV71型感染和CA16型感染的方法，该方法包括为受试者接种上述疫苗。

本发明的DNA分子能够用于构建重组病毒，获得能够用于制备预防EV71和CA16感染的疫苗。本发明提供的重组病毒具有如下多方面的优点：(1)所述重组病毒只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(2)能诱导产生针对EV71病毒和CA16病毒特异性的免疫应答；(3)所述重组病毒能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的外源肠道病毒的攻击，作为肠道病毒双价疫苗用于预防手足口病具有良好的应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为EV71恢复病毒的间接免疫荧光结果，其中，WT为阳性对照，Neg为细胞对照；

图2为EV71恢复病毒的Western Blot结果，其中，泳道1为细胞对照，泳道2为恢复病毒感染上清，泳道3为野生型病毒感染上清，M为蛋白Marker；

图3为EV71恢复病毒的空斑形态；

图4为EV71恢复病毒在RD细胞上的生长曲线；

图5为本发明的重组病毒全长cDNA克隆的构建示意图；

图6为本发明的重组病毒的间接免疫荧光和空斑形态结果；

图7为本发明的重组病毒免疫组血清对EV71病毒总的IgG滴度；

图8为本发明的重组病毒免疫组血清对CA16病毒总的IgG滴度；

图9为本发明的重组病毒诱导小鼠产生的细胞因子表达水平；

图10为本发明的重组病毒免疫组血清对1日龄BALB/c乳鼠的保护试验结果；

图11为本发明的重组病毒对乳鼠的神经毒力的试验结果。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供的DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白VP4的编码序列、衣壳蛋白VP2的编码序列、衣壳蛋白VP3的编码序列、重组的衣壳蛋白VP1的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白VP4的编码序列、衣壳蛋白VP2的编码序列、衣壳蛋白VP3的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于肠道病毒71型，重组的衣壳蛋白VP1的编码序列由串联连接的第一衣壳蛋白VP1的编码序列、短肽的编码序列和第二衣壳蛋白VP1的编码序列组成，所述第一衣壳蛋白VP1的编码序列和第二衣壳蛋白VP1的编码序列分别来源于肠道病毒71型的衣壳蛋白VP1的编码序列的第1-300位核苷酸序列和第301位之后的核苷酸序列，所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，本发明中使用的“来源于”意指根据病毒的基因序列(RNA)构建某蛋白的编码序列(DNA)，并不限于从病毒基因组中提取获得基因序列，例如，来源于肠道病毒71型的序列是指与肠道病毒71型的基因序列具有90％以上(优选100％)的同一性的序列；“串联连接”是指将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸(或多肽)序列是连续的。

本发明中，所述短肽的编码序列可以为任何能够编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽的序列，优选地，所述短肽的编码序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中，所述肠道病毒71型可以为野生型毒株，也可以为减毒株。本领域技术人员公知的是，使用野生型毒株时，通常需要对构建的重组病毒进行灭活处理后才用于制备疫苗。优选情况下，所述肠道病毒71型为减毒株，更优选为AH08/06减毒株。

本发明中，所述5’非编码区序列、衣壳蛋白VP4的编码序列、衣壳蛋白VP2的编码序列、衣壳蛋白VP3的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列可以来源于同一基因型的肠道病毒71型，也可以来源于不同基因型的肠道病毒71型。

所述5’非编码区序列可以为SEQ ID NO:3中第1-742位所示的序列。

所述衣壳蛋白VP4的编码序列可以为SEQ ID NO:3中第743-949位所示的序列。

所述衣壳蛋白VP2的编码序列可以为SEQ ID NO:3中第950-1711位所示的序列。

所述衣壳蛋白VP3的编码序列可以为SEQ ID NO:3中第1712-2437位所示的序列。

所述重组的衣壳蛋白VP1的编码序列可以为SEQ ID NO:3中第2438-3391位所示的序列。

所述非结构蛋白的编码序列可以为SEQ ID NO:3中第3392-7384位所示的序列，通常包括非结构蛋白2A的编码序列、非结构蛋白2B的编码序列、非结构蛋白2C的编码序列、非结构蛋白3A的编码序列、非结构蛋白3B的编码序列、非结构蛋白3C的编码序列和非结构蛋白3D的编码序列。

所述3’非编码区序列可以为SEQ ID NO:3中第7388-7468位所示的序列。

根据本发明最优选的实施方式，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

第二方面，本发明提供的制备上述DNA分子的方法包括在肠道病毒71型基因组RNA对应的cDNA中衣壳蛋白VP1的编码序列第300-301位核苷酸之间插入短肽的编码序列。

其中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明的DNA分子相连获得。

所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可为重组表达载体。根据本发明的一种实施方式，所述重组载体可以为pEV载体的多克隆位点(如SnaBI和MluI)间插入有所述DNA分子的重组载体。

所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞(如Vero细胞)中而获得。

所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株Top10)中而获得。

本发明的重组病毒可以通过将所述重组载体导入离体的哺乳动物细胞(如RD细胞或Vero细胞)中得到。

第三方面，本发明提供的重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与上述DNA分子的序列相同。

第四方面，本发明提供的制备上述重组病毒的方法包括在肠道病毒71型基因组中衣壳蛋白VP1的编码序列第300-301位核苷酸之间插入短肽的编码序列。

第五方面，本发明提供的重组蛋白含有串联连接的第一衣壳蛋白VP1的氨基酸序列、短肽的氨基酸序列和第二衣壳蛋白VP1的氨基酸序列，所述第一衣壳蛋白VP1的氨基酸序列和第二衣壳蛋白VP1的氨基酸序列分别来源于肠道病毒71型的衣壳蛋白VP1的氨基酸序列的第1-100位氨基酸序列和第101位之后的氨基酸序列，所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的重组蛋白具有一定的免疫原性，可以用于制备双价疫苗。所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。

第六方面，本发明提供了编码所述重组蛋白的DNA分子，该DNA分子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3的第2438-3391位核苷酸所示。

第七方面，本发明还提供了含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

第八方面，本发明提供的疫苗的活性成分为上述重组病毒和/或重组蛋白。

第九方面，本发明提供了上述DNA分子、重组病毒和重组蛋白中的至少一个在制备用于预防EV71型感染和CA16型感染的双价疫苗中的应用。

第十方面，本发明提供的预防EV71型感染和CA16型感染的方法包括为受试者接种上述疫苗。所述受试者可以为人和/或鼠。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)：购自ATCC，产品目录号为别为CCL-136、CCL-81；RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit：购自QIAGEN公司，货号74104；DNA凝胶回收和纯化试剂盒Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System、SP6体外转录试剂盒RiboMAX^TMLarge Scale RNA Production System、Oligo d(T)15premier、dNTP mix、反转录酶M-MLV、DTT、RNA酶抑制剂：购自Promega公司，货号分别为A9281、P1280、C1101、U1515、M1701、P1171、N2111；Phusion超保真DNA聚合酶Master Mix和限制性内切酶包括SnaBI、MluI、BamHI、NruI、EcoRI、XhoI内切酶：购自NEB有限公司，货号分别为R0130、R1098S、R1036L、R0138L；克隆载体pEV的序列如SEQ ID NO:45所示；大肠杆菌Top10感受态、质粒提取试剂盒TIANprep Mini Plasmid Kit、TMB底物、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)：购自天根生化科技(北京)有限公司，货号分别为CB104、CB101、CB105、DP103、PA107、RT108-01；EV71减毒株为EV71AH08/06株(Genbank登录号：HQ611148.1)，北京军事医学科学院微生物与流行病学研究病毒实验室2008年于安徽省手足口病疫区所采集的咽拭子标本中分离；低糖DMEM培养基干粉、1640培养液、液体OPTI-MEM Medium、Lipofactamine 2000：购自Life technologies公司，货号分别为31600-034、31985-070、11668-019、22400-089；BALB/c雌性小鼠：购自北京军事医学科学院实验动物中心；本发明所用所有核酸序列均由Invitrogen公司合成。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用来说明本发明的DNA分子及含有本发明的DNA分子的重组载体及其构建方法。

(一)EV71减毒株基因组全长感染性cDNA克隆的构建与鉴定

(1)根据AH08/06株基因组序列中含有的特异酶切位点，利用DNAstar及Oligo6软件设计1对用于全长克隆的引物(5′-SnaBI，3′-MluI，斜体加黑为SP6启动子核心序列且黑体下划线为引入的特异酶切识别序列)。在上游引物中病毒基因组5′端引入SnaBI酶切位点与SP6启动子核心序列，并在酶切位点与SP6核心序列之间插入保护碱基T；在下游引物polyA之后引入MluI酶切位点。引物由Invitrogen公司合成。

5′-SnaBI：5′‐GCGCTATTTAGGTGACACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACTC‐3′(SEQ ID NO:4)

3′-MluI：5′‐CGCCGGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTATTCTGG‐3′(SEQ ID NO:5)

(2)病毒RNA制备：将AH08/06株接种单层RD细胞。当细胞病变(CPE)达到++++(90-100％)时，将病毒液冻融一次后，10,000rpm离心3min收集上清，用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit)提取病毒RNA：将病毒上清200μl转至无RNA酶的1.5ml离心管中，快速加入700μl RLT溶液和7μlβ-巯基乙醇，振荡混匀然后加入490μl无水乙醇，剧烈振荡后，分两次加至离心吸附柱中，10,000g离心15s。加入700μl RW1洗液10,000g离心15s洗柱一次，再加入500μl RPE洗液10,000g离心15s洗柱两次。最后将离心吸附柱转至新的收集管中，10,000g离心2min以去除残留洗液，转至1.5ml无RNA酶离心管中，加入50μl无RNase水，室温静置2min，10,000g离心2min，最后在洗脱液中加入1μl RNA酶抑制剂(RNasin Ribonulease Inhibitor)，-80℃保存。

(3)反转录合成cDNA：向无RNA酶小离心管中加入2μl Oligo d(T)，9ul病毒RNA，混匀70℃作用10min后，迅速冰浴2min，使其冷却，然后加入5×M-MLV Buffer 4μl，5×M-MLV反转录酶0.5μl，dNTP mix(10μM)1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，无RNase水3μl，42℃反应1h，然后70℃15min将酶灭活，所得产物-20℃保存备用。

(4)病毒cDNA的全长PCR扩增：EV71的基因组为7.4kb，因此为了保证一步法全长扩增的准确性，采用超保真Phusion PCR Master Mix聚合酶体系进行全基因组扩增。PCR反应体系如下：

cDNA模板3μl，上下游引物(5′-SnaBI和3′-MluI)各2μl，2×Phusion PCR Master Mix(HF Buffer)25μl，补加不含RNase的水至50μl。反应条件为：98℃30s，98℃10s，60℃10s，72℃4min，35个循环；72℃7min。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，在电泳上样量一致的情况下，PCR目的条带的亮度高于Marker，因此一步法能够以高效率对全基因组进行扩增，扩增产物能够满足后续纯化、酶切、连接等实验需求。用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System回收扩增产物，具体步骤如下：配置8％的回收胶，上样后100V电泳1h，将目的条带切下，加入一倍体积的膜结合液，50℃作用15min，待胶完全融化后平衡至室温，加入离心吸附柱，13,000rpm离心1min，然后加入洗膜液750μl，13,000rpm离心1min，继续加入洗膜液500μl，13,000rpm离心1min，弃掉洗液后13,000rpm空甩2min，室温放置1min后加入50μl无RNAse水，13,000rpm离心2min，回收产物-20℃冻存。

(5)基因组全长cDNA克隆的构建：将上述PCR产物经SnaBI和MluI按照以下体系进行双酶切：PCR产物10μg，SnaBI 3μl，MluI 3μl，10×Promega缓冲液C 10μl，补水至100μl，37℃反应3h。酶切后利用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System将DNA进行纯化：向反应体系内加入等体积的膜结合液，混匀后加入离心吸附柱，13,000rpm离心1min，然后加入洗膜液750μl，13,000rpm离心1min，继续加入洗膜液500μl，13,000rpm离心1min，弃掉洗液后13,000rpm空甩2min，室温放置1min后加入50μl无RNAse水，13,000rpm洗脱2min，获得带有酶切位点的全长基因组片段。

同时将pEV载体按照以下体系进行双酶切：载体质粒10μg，SnaBI 3μl，MluI 3μl，10×Promega缓冲液C 10μl，补水至100μl，37℃反应3h。酶切后利用琼脂糖凝胶回收2.5kb的载体片段。将载体片段利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理以去除载体片段的5′磷酸末端，体系如下：40μl载体，1μl CIP，5μl 10×NEBufer 3，补水至50μl体系，37℃反应1h。纯化后将载体和基因组全长PCR产物进行连接：载体约20ng，基因组全长DNA 200ng，2μl T4 DNA连接酶(200U)，2μl 10×连接酶缓冲液，用ddH₂O补足体积至20μl，4℃连接过夜。

连接产物转化Top10感受态细菌：将20μl连接产物加入100μl Top感受态细胞，轻轻搅动混匀，冰浴20min，42℃热激90s后，迅速冰浴2min，加入450μl无抗生素的LB培养基，37℃、180rpm震荡培养60min。然后取200μl菌液涂布Amp⁺平板，37℃倒置培养16h。

(6)基因组全长cDNA克隆的鉴定：利用快速鉴定液对阳性克隆进行鉴定。首先将快速鉴定液从-20℃取出，置37℃水浴溶解至完全透明，之后将快速鉴定液加入离心管中，每管20μl，用灭菌的10μl枪头挑取菌落，置于鉴定液中，37℃水浴5min，期间捻动枪头一次以促进裂解，紧接着置于4℃水浴5min，10,000rpm离心2min，取10μl上清进行琼脂糖凝胶电泳。

挑取阳性克隆后，置于3ml Amp+LB培养基中扩大培养，用TIAN prep Mini Plasmid Kit按照说明书提取质粒。提取的质粒分别利用EcoRI和XhoI限制性内切酶进行酶切鉴定，以验证插入序列和方向是否正确：阳性质粒10μl，EcoRI或XhoI 1μl，10×NEBuffer 32μl，BSA 0.2μl，补水至20μl，37℃水浴反应3h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。为进一步验证阳性菌落中的质粒是否为含有EV71基因组的质粒，将阳性菌落在Amp+LB培养基中扩大培养，提取质粒后利用EcoRI，XhoI进行酶切鉴定。结果显示，重组质粒被EcoRI酶切后产生2.5kb和7.5kb的片段，被XhoI酶切后能够产生6.2kb，2.8kb和1.0kb的片段，均和预期结果一致。

(7)全长感染性cDNA克隆的体外转录及恢复病毒的制备：挑取酶切鉴定正确的阳性克隆，置于10ml Amp+LB培养基中扩大培养16h，用TIANprep Mini Plasmid Kit按照说明书制备质粒。将制备好的质粒用MluI限制性内切酶进行线性化：质粒10μg，MluI 2μl(20U)，10×Promega缓冲液D 10μl，补水至100μl，37℃反应3h，1％琼脂糖凝胶电泳检测线性化是否完全。获得的线性化质粒经Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System回收，定量后置-20℃保存。取2μg的线性化质粒作为体外转录模板，用SP6体外转录试剂盒进行体外转录，反应体系为20μl：5×SP6Buffer 4μl，rNTPs Mix(25mM rATP、rCTP、rUTP以及rGTP)6μl，Enzyme Mix(SP6)2μl，线性化模板2μg，补加无RNAse水至20μl。37℃水浴3h。反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳观察转录结果。成功获得大小与病毒基因组RNA一致的转录体，经纯化后定量，转录体RNA的量为微克级。

利用脂质体2000转染RD细胞，步骤如下：首先将RD细胞接种6孔板，用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素以及100g/ml链霉素)培养至90％单层。将6μl脂质体2000与125μl OPTI-MEM混合，室温静置5min，同时将20μl转录体与125μl OPTI-MEM混合；将上述两种混合物充分混匀，静置20min；用500μl OPTI-MEM洗单层细胞，洗两次后加入800μl OPTI-MEM培养基；将静置满25min的混合物加入单层细胞，摇匀；37℃5％CO₂孵箱中培养中培养6h，期间摇动一次；6h后弃去上清，加入2ml DMEM维持培养基(含2％胎牛血清、100U/ml青霉素以及100g/ml链霉素)培养48h。

(8)恢复病毒的鉴定：脂质体转染后48h后，当细胞病变(CPE)达到++++(90-100％)时，将病毒液冻融一次后，10,000rpm离心3min收集上清。按照以下步骤进行恢复病毒的扩大培养：取500μl病毒种子液，接种于长满90％的单层RD细胞(25cm²细胞培养瓶)，37℃吸附1h，补加含2％FBS的DMEM培养基维持液，置37℃5％CO₂培养。待细胞病变达到++++时，冻融一次，10,000rpm离心3min收取病毒培养液，作为恢复病毒的来源。

对恢复病毒基因组进行RT-PCR鉴定。用普通RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit)提取 恢复病毒中的RNA(方法见前)。以RNA为模板，以Oligo(dT)引物反转录第一链cDNA(方法见前)。再以此为模板，用特异引物F2/R2、F4/R4、F6/R6和F8/R8进行PCR扩增(引物序列见下表1)。反应体系：cDNA模板1.5μl，上下游引物各1μl，2×Phusion PCR Master Mix(HF Buffer)10μl，补加不含RNase的水至20μl。反应条件：98℃30s；98℃10s，58℃10s，72℃1min，30个循环；72℃7min，4℃维持。琼脂糖电泳结果显示，所有扩增片段的大小与预期的大小一致。

表1

将以上PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，之后进行切胶回收。利用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System进行胶纯化后，将引物和纯化产物送至Invitrogen公司进行序列测定。测序结果也显示，恢复病毒的序列与野生病毒的特异序列一致。以上结果表明，由全长克隆所拯救的恢复病毒基因组源自野生型EV71AH08/06株基因组。

将转染后获得的恢复病毒接种于6孔板单层RD细胞，吸附1h后，弃掉病毒液，补加2％FBS的DMEM维持培养基，置于37℃5％CO₂孵箱分别培养培养6、12、18、24、30h后，用2ml PBS洗三遍细胞，加入500μl 0.25％胰酶消化病毒感染后的细胞，按照约10⁶细胞/ml的密度配制成细胞悬液。将细胞悬液滴加于经过清洗、灭菌处理的多点镀膜载玻片加样孔上，20μl/孔。然后将该细胞玻片置于湿盒中，37℃5％CO₂培养箱中继续培养6h。将载有细胞的玻片垂直轻蘸PBS一次，空气中晾干后，将其置预冷的丙酮中，-20℃固定过夜。取出后室温干燥，置-20℃保存备用。

取出上述低温保存的抗原片，平衡至室温，小心向每孔滴加EV71的小鼠单抗(1：200稀释)20μl，37℃湿盒中孵育1h，取出抗原片PBS震荡漂洗3次，每次5min。室温晾干后加入用0.02％伊文思蓝稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体(1:800稀释，购自中杉金桥，货号ZF-0312)20μl，37℃湿盒中孵育30min，首先用蒸馏水漂洗1次，再置于PBS中振荡漂洗3次，每次漂洗10min。室温晾干后置于荧光显微镜下观察结果，同时分别以未接种EV71和接种野生型EV71的RD细胞作为阴性和阳性对照。

结果显示，恢复病毒感染6h后开始观察到绿色荧光，荧光量与感染时间呈正相关，恢复病毒的免疫荧光表征和野生型病毒一致(图1)。免疫荧光结果表明，恢复病毒能够在感染敏感细胞后表达病毒特异蛋白。

将扩大培养的恢复病毒上清和野生型病毒上清加入蛋白上样缓冲液中，水煮沸10分钟后，上样，在5％堆积胶、12％分离胶中进行SDS-PAGE后，按照以下步骤进行转膜：首先按照胶的大小裁剪滤纸和PVDF膜，将PVDF膜浸入甲醇激活至蓝色，取出，按照从上往下滤纸-胶-PVDF膜-滤纸的顺序排列好，浸入转膜缓冲液湿润并排出气泡后放在转膜仪上，以0.8mA/cm²转膜1h后，放入TBST震荡洗5min，在10％脱脂奶粉中4℃封闭过夜。将anti-VP1单抗按照1:1000稀释后，室温摇床上孵育1h，以TBST洗5次，每次10min，之后将碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗按照1:1000稀释后，室温摇床孵育1h。TBST洗5次，每次10min，最后以1ml显色液冲洗显色。结果显示，在恢复病毒感染上清中能够检测到EV71特异蛋白VP1蛋白条带，其大小与浓度与野生型病毒一致。证明恢复病毒感染上清中含有病毒衣壳蛋白VP1(图2)。

将恢复病毒进行传代鉴定：取恢复病毒液200μl，接种至长满50％的12孔板中，37℃吸附1h后弃去病毒液，补加含2％FBS的DMEM维持液，置37℃5％CO2培养，每天观察细胞病变情况，连续传3代以确认病毒产生CPE的能力，同时以未接种病毒和接种野生型EV71的RD细胞作为阴性和阳性对照。

将恢复病毒以10倍为梯度，倍比稀释为10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7和10^-8，分别接种于单层RD细胞。37℃5％CO₂吸附1h后，弃去病毒液，加入含有1％低熔点琼脂糖的DMEM维持培养基(2％FBS)。3d后加入PBS稀释的4％甲醛溶液室温固定3h，去掉琼脂盖后加入结晶紫染色液，室温染色20min，最后用流水轻轻洗去残余的染色液，观察蚀斑形态，并计算PFU。同时分别以未接种EV71及接种野生型EV71的细胞作为阴性和阳性对照。结果显示，恢复病毒与野生型病毒均能够在感染后72h在RD细胞上形成蚀斑，其蚀斑形态相同。这表明恢复病毒与野生型病毒在RD细胞上具有相似的感染性(图3)。

将恢复病毒和野生型病毒稀释成相同滴度，按照0.01MOI剂量接种RD细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，加入含2％FBS的DMEM维持培养基，分别在接种后第6、12、24、36、48h收取细胞上清液，利用蚀斑滴定法测定病毒滴度(PFU)，根据蚀斑滴度绘制一步生长曲线。结果显示，恢复病毒与野生病毒能够产生相似的生长曲线。两者在感染RD细胞后24h内迅速复制，36-48h内达到最高滴度，约为10⁷PFU/ml。以上结果表明，恢复病毒与野生型病毒的增殖特性相似(图4)。

上述结果表明获得的重组质粒(EV71cDNA质粒)载有EV71减毒株基因组全长感染性cDNA，即，成功获得了EV71减毒株的全长感染性cDNA克隆。

(二)重组病毒基因组全长cDNA克隆的构建与序列测定

用短肽的编码序列以EV71减毒株为基因骨架构建重组病毒，使用的引物序列(5＇-3＇)如下表2所示。

表2

利用融合PCR技术将短肽的编码序列(CNE21，序列如下表3所示)插入到EV71病毒基因组内部(参见图5，衣壳蛋白VP1的编码序列的第300-301位核苷酸之间)，PCR体系及 条件如下：

反应条件如下：98℃变性30s；98℃10s、60℃退火10s、72℃延伸1min，30个循环，72℃5min。

反应条件如下：98℃变性30s；98℃10s、60℃退火10s、72℃延伸30s，30个循环，72℃5min。

然后胶回收PCR片段CA16-CNE21-S1(2000bp)和CA16-CNE21-S2(750bp)。

胶回收后测回收产物浓度，按分子量1:1的比例做融合PCR，体系及反应条件如下：

反应条件：98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃1min，11个循环。

然后在上述产物中加入引物CA16-CNE21-S1-F和CA16-CNE21-S2-R各1μl，反应条件：98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃1min 30s，30个循环；72℃5min。最后对融合PCR产物切胶回收，即为需要的目的片段。

用BamHI和NruI分别酶切回收的目的片段和EV71cDNA质粒，酶切完成后跑电泳切胶回收，目的片段和EV71cDNA质粒回收的片段大小分别为2500bp和7500bp。

将上述两个回收片段用T4连接酶连接，然后转化Top10感受态细胞，待克隆长出后，挑单克隆用含氨苄的LB培养基摇菌6小时后，用菌液PCR法鉴定，所用引物为：CA16-YZ-F：AGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAA(SEQ ID NO:31)和CA16-YZ-R：CTTAGGGGCTCCAGGTGGCACAAAC(SEQ ID NO:32)；体系为：菌液3μl，CA16-YZ-F和CA16-YZ-R各1.5μl，2×Q5mix 12.5μl，H₂O 6.5μl；反应条件为：98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃30s，25个循环；72℃5min。然后跑电泳验证，对电泳结果正确的克隆送去测序进一步确认插入片段插入的方向是否正确，从而获得重组载体rEV71-CNE21。

利用短肽CNE55、CNE70和CNE28的编码序列构建对照重组载体rEV71-CNE55、rEV71-CNE70和rEV71-CNE28，方法同rEV71-CNE21，只是短肽的编码序列替换为表3所示的编码序列且引物分别替换为表2中列出的相应引物。

表3

实施例2

本实施例用来说明重组病毒的拯救，即制备重组病毒。

(1)重组质粒线性化

对实施例1测序正确的重组质粒及基因载体质粒EV71cDNA摇菌，提质粒，然后用限制性内切酶MluI单酶切，回收线性化产物得到大小为10000bp的单一线性化分子，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收，并测回收产物的浓度。

(2)对线性化产物体外转录

对回收的线性化分子用SP6体外转录试剂盒进行体外转录，体系及反应条件如下：酶2μl，5×Buffer 4μl，NTP 6μl(A:U:C:G＝1:1:1:1)，线性化产物和水8μl(线性化产物总量为1μg)；37℃3小时；之后每管加入DNAse 2μl 37℃消化20min；置-80℃备用。

(3)转染RD细胞

利用脂质体(Lipofectamine 2000)将RNA转录体转染RD细胞，步骤如下：(1)首先将Vero细胞接种6孔板，用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)培养至90％单层；(2)将6μl脂质体与125μl OPTI-MEM培养基混合并室温静置5min，同时将20μl RNA转录体与125μl OPTI-MEM培养基混合，将上述两种混合物充分混匀，室温静置20min；(3)用500μl OPTI-MEM培养基洗涤步骤(1)中的单层细胞两次，然后每孔加入800μl OPTI-MEM培养基；(4)将步骤(2)得到的混合物加入完成步骤(3)的6孔板并摇匀，置于37℃5％CO₂的培养箱中培养6h(期间摇动一次)，然后吸弃上清，加入2ml细胞维持液(含2％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，置于37℃5％CO₂的培养箱中培养。

当上述转染的细胞病变达到4+时，把转染的板子放-80℃反复冻融3次，10000rpm离心10min，弃沉淀收集上清，上清中即含有重组病毒。

实施例3

本实施例用来说明重组病毒的鉴定。

(1)重组病毒特异蛋白表达的鉴定

用间接免疫荧光法鉴定重组病毒在Vero细胞上的蛋白表达，步骤：用0.01MOI的病毒量提取RNA转染Vero细胞，分别在24小时、48小时、60小时收集转染的细胞，用冷的丙酮固定，然后用EV71特异性的单抗2G8(1:500稀释)和488标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:300稀释)进行鉴定。间接免疫荧光的结果显示(图6)，重组病毒感染的Vero细胞中可检测到EV71病毒VP1蛋白。

(2)重组病毒基因组的PT-PCR鉴定

提取重组病毒的RNA：将200μl病毒悬液与200μl lysis Buffer(含1％的β-巯基乙醇)以及200μl无水乙醇混合，剧烈震荡，得到裂解液；将裂解液加入吸附柱，12000rpm离心1min；700μl Wash buffer I洗柱一次，12000rpm离心1min；500μl Wash buffer II洗柱一次，12000rpm离心1min；空柱12000rpm离心2min。加50μl无RNase的水，静置2min，12000rpm离心1min。加2μl RNase Inhibitor。混匀后置-80℃待用。

RT-PCR步骤：RNA 9μl，oligdT 2μl，70℃10min然后放冰上迅速冷却，之后再加入5×Mlv Buffer 4μl，dNTP mix(10Μm)1μl，RRI 0.5μl，H₂O 3μl，Mlv 0.5μl；42℃1小时，70℃15min；最后得到的产物即为重组病毒的cDNA。

取cDNA 3μl，引物CA16-YZ-F和CA16-YZ-R各1μl，2×Q5mix 12.5μl，H₂O 7.5μl；98℃30s；98℃10s、60℃10s、72℃30s，25个循环；72℃5min。然后将PCR产物送去测序。

测序使用的引物序列(5＇-3＇)如下：

测序结果表明，重组病毒中插入的短肽的编码序列与预期完全一致。

实施例4

本实施例用来说明本发明重组病毒的空斑特征。

为了观察重组病毒的空斑形态特征，将骨架病毒和重组病毒分别以10倍梯度稀释，稀释度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，10^-5、10^-6和10^-7，以500μl/孔接种于铺于6孔板的单层RD细胞。吸附1.5h后，弃去病毒液，添加含有DMEM培养基(2％FBS)的1％的琼脂盖，置于37℃，5％CO₂的孵箱中培养。3d后用4％的甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，结晶紫室温染色20min，观察空斑形态。空斑试验的结果显示，重组病毒能形成大小均一，边缘清晰的空斑，其大小与亲本病毒产生的空斑基本相同(图6)。

实施例5

本实施例用来说明本发明的重组病毒的免疫原性。

(1)小鼠免疫

取6周龄的BALB/c雌性小鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别皮下注射1×10⁵PFU 的重组病毒，对照组只注射PBS，每隔两周加强免疫一次，共免疫三次，在第三次免疫两周后断尾取血，待血清和血浆分离后，3,000rpm离心10min，收集血清，56℃加热灭活30min，分装后于-20℃保存备用。

(2)血清IgG抗体分析

用ELISA法检测免疫血清对EV71病毒总的IgG滴度。用加热灭活的EV71病毒包被96孔板，4℃过夜。甩干板子，PBST洗板1次，300μl/孔。加2％BSA封闭液进行封闭，150μl/孔，37℃孵育1h。将免疫血清2倍倍比稀释(1:100～1:6400)，把稀释好的免疫血清或PBS加入96孔酶联板中，100μl/孔，PBS为阴性对照，37℃孵育1小时。PBST洗板5次，300μl/孔。最后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:5000稀释)，100μl/孔，37℃孵育30min，重复洗板5次，300μl/孔。加入TMB显色液100μl/孔，37℃避光孵育15min，加入终止液(5％H₂SO₄)，100μl/孔，在5min之内测定OD₄₅₀值。

结果判定：当重组病毒免疫组血清的OD₄₅₀值/PBS组免疫血清的OD₄₅₀值≥2.1时即为阳性值。结果显示，重组病毒可诱导小鼠产生针对EV71的IgG抗体，抗体效价与亲本病毒免疫组无明显差异(图7)。

用IFA法测定免疫血清对CA16病毒总的IgG滴度。用CA16病毒感染单层RD细胞，当细胞病变明显时，收集细胞，用10％DMEM重悬后加到镀膜细胞玻片孔内，随后用冷的丙酮固定细胞备用。分别将重组病毒组免疫血清和PBS组免疫血清2倍倍比稀释(1:100-1:6400)，随后加到含有CA16抗原的片子上37℃孵育1h。PBS缓冲液漂洗3次，5分钟每次。最后加入0.02％伊文思蓝稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1:200稀释)，37℃孵育30min，PBS缓冲液漂洗3次，每次5分钟，室温放置，待抗原片凉干后采用倒置荧光显微镜观察拍照。结果显示，重组病毒可诱导小鼠产生针对CA16的IgG抗体，而亲本病毒免疫组未诱导产生抗CA16抗体(图7)。

(3)血清中和抗体分析

免疫血清对EV71病毒和CA16病毒的中和抗体滴度用TCID₅₀测定。用2％细胞维持液将加热灭活的小鼠血清2倍倍比稀释(1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:521)，将EV71病毒和CA16病毒分别稀释成1000TCID50/ml，随后将100μl稀释好的病毒悬液分别与等量的不同稀释度的小鼠血清(2％细胞维持液)混均，37℃孵育1.5h，然后每个混合液均接种4个孔，200μl/孔，37℃吸附1.5h，弃混合液，每孔补加200μl 2％细胞维持液，37℃5％CO₂孵箱继续培养，每日观察CPE，持续观察7天，并计算结果。结果显示，重组病毒可诱导小鼠产生针对EV71的中和抗体，抗体效价与亲本病毒免疫组无明显差异；同时，仅重组病毒rEV71-CNE21可诱导产生抗CA16的中和抗体，其他重组病毒和亲本病毒则不能诱导小鼠产生针对CA16的中和抗体(图8)。

(4)血清中细胞因子分析

用Coating Buffer稀释捕获抗体IFN-Y、IL-2、IL-4、IL-6(按1:200稀释)，100μl/孔，4℃过夜。弃包被液，加入完全1640培养液漂洗1次，200μl/孔，弃漂洗液加入完全1640培养液封闭，200μl/孔，室温孵育2小时。弃封闭液，加入用完全1640培养液稀释好的抗原刺激物(EV71灭活病毒)和有丝分裂原(ConA，2.5μg/ml)，100μl/孔。解剖小鼠，制备细胞悬液，将其稀释成1×10⁷/ml，100μl/孔，37℃5％CO₂条件孵育48h。弃细胞悬液，去离子水洗2次， 放置3-5分钟/次，Wash Buffer I(含0.05％Tween-20的PBS)洗3次，200μl/孔，稀释检测抗体(PBS 10％FBS)100μl/孔，室温放置2小时。弃检测抗体，Wash Buffer I洗3次，200μl/孔，置1-2分钟。稀释酶交联物(PBS 10％FBS)100μl/孔，室温放置1小时。弃酶交联物，Wash Buffer I洗4次，200μl/孔，置1-2分钟，Wash BufferⅡ(PBS)洗2次，200μl/孔。最后加入显色底物，100μl/孔，显色5-60分钟。待斑点出现后用去离子水洗孔，终止显色。去掉塑料托盘，空气中放置晾干板子用塑料袋封存板子置于暗处，直到分析。通过计算产生斑点的细胞数(spot-forming cells，SFC)，评价重组病毒诱导产生的细胞免疫水平。结果显示，重组病毒主要诱导产生IL-6和IFN-γ，重组病毒与亲本病毒组之间无显著差别(图9)。

(5)体内保护实验

用PBS将EV71(或CA16)病毒10倍倍比稀释，稀释度为10^-1～10^-4，分别颅内接种1日龄BALB/c乳鼠，20μl/只，对照组接种PBS，每日观察并记录动物的死亡情况，注射24小时内死亡者为非特异性死亡，持续观察15天。

取1日龄的BALB/c乳鼠(n≥5)，按照上一步计算的LD₅₀值，用PBS对EV71(或CA16)病毒进行稀释，然后颅内注射100LD₅₀的EV71病毒(或20LD₅₀的CA16病毒)，4小时后腹腔注射各组免疫血清40μl，PBS为对照组，每日观察并记录动物的死亡情况，持续观察15天。结果显示，四种重组病毒免疫组血清均可保护小鼠免受致死剂量的EV71的攻击；同时，仅重组病毒rEV71-CNE21免疫血清可保护小鼠免受致死剂量的CA16的攻击(图10)。

实施例6

本实施例用来说明本发明的重组病毒的神经毒力。

取1日龄的BALB/c乳鼠(n≥5)6窝，分别用5×10³PFU的强毒株(EV71H株，购自ATCC，VR-1432)、EV71骨架病毒以及重组病毒颅内接种，20μl/只，每日观察并记录动物的死亡情况，持续观察15天。结果显示，接种重组病毒的乳鼠均未死亡，接种相同剂量的EV71H株的乳鼠则100％死亡。上述结果表明，重组病毒不具有乳鼠神经毒力，具有明显的减毒特征(参见图11)。

从以上实施例可以看出，本发明方法获得的重组病毒可以用来预防EV71感染和CA16感染。而且，只有使用特定的短肽的编码序列制备重组病毒才能够获得有效针对EV71和CA16的双价疫苗。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。