本发明涉及一种PVA接枝键合聚苯乙烯-二乙烯基苯交联微球(PS-DVB微球)亲水改性方法，是通过在PS-DVB微球表面引入的具有高反应活性的环氧基团与PVA中羟基反应，其键合的PVA通过交联剂的后交联反应，得到PVA包覆紧凑的亲水性PS-DVB微球，消除了PS-DVB微球表面因残留的苯环及悬挂双键造成的疏水性；且PVA经后交联反应，避免此亲水PS-DVB微球表面的PVA长链在生物分离领域中高盐情况下发生的相塌陷现象，且PVA中大量的羟基可便于进一步衍生化，可制备成满足不同需求的色谱分离介质，属于功能高分子微球改性领域。
技术背景
不同交联度的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球(PS-DVB微球)因其良好的物理、化学稳定性(Chromatographi，1985：20(12)，735-738)，高机械强度及高比表面积(Monatshefte fur Chemie/Chemical Monthly.1998，129(6)：597-605)等优点，在固相萃取色谱(Monatshefte fur Chemie/Chemical Monthly.1998，129(6)：597-605)，体积排阻色谱(Journal ofPolymer Science Part A：General Papers，1964，2(2)：835-843)及高效液相色谱(Chemical Engineering&Technogly，2005，28(12)：1457-1472)领域均有较广应用，但因PS-DVB微球表面存在大量的苯环及悬挂双键(Spectroscopy letters，36(6)，867-874(2000))而存在疏水性会对生物大分子如蛋白质等产生非特异性吸附，限制其在生物领域应用，为克服这一缺点，需对PS-DVB微球表面进行亲水修饰以消除其表面疏水区域。
目前，常用的对PS-DVB微球表面亲水改性方法有2种：物理吸附与化学键合。物理吸附即在PS-DVB微球表面“涂敷”一层或多层同时含有疏水区/亲水区的“两亲性”聚合物，然后对其进行后交联以得到稳定的亲水微球(Langmuir，2001，17，4386-4391；Covalently bonded coatings，US 5,503,933(1996))；化学键合则常需要在PS-DVB微球表面先键合上活性基团，然后在利用其基团活性与亲水性聚合物发生反应，以达到消除疏水目的。常见的可用来键合的高分子有PVA，PEG，以及β-环糊精等，主要是通过功能化PS-DVB微球表面的苄氯或乙酰氯(溴)与PVA(ZL200710177704.6，2009)，PEG(Journal of biomedical materials research，1992，26，779-790)及β-环糊精(功能高分子学报，1997，10，，25-212)在碱性条件下反应，但苄氯或乙酰氯(溴)其距离PS-DVB微球表面苯环仅有1-2个C原子，其与大分子量聚合物反应，其苄氯或乙酰氯(溴)自由度较低，且反应需要在强碱条件下才能反应，反应条件苛刻，活性较低；此外，马光辉等人在中国专利ZL 200710177704.6中通过醚化反应将PVA接枝到氯甲基化PS-DVB微球表面，但此法有诸多问题，如：氯甲基化PS-DVB微球制备过程需要使用强致癌物氯甲醚试剂；此外PVA接枝PS-DVB微球表面后，PVA链太长，容易在PS-DVB微球表面“缠结”，且亲水PVA链太长未经进一步处理后，在生物分离过程中，若流动相盐浓度较高时容易发生相塌陷(Egbert Muller，Chemical Engineering&Technology，2005，28，1292-1305)，不利于生物蛋白分离，从而限制其应用范围。
本发明提供一种PVA接枝键合聚苯乙烯-二乙烯基苯交联微球亲水改性方法，即将不同分子量大小的亲水性聚合物聚乙烯醇(PVA)通过环氧开环方式将不同分子量大小的PVA键合于PS-DVB微球表面(包括PS-DVB内部孔道表面)并进行后交联，以在其表面引入大量羟基，以达到优化PS-DVB微球亲水目的，且表面大量羟基便于进一步衍生化反应，为制备带有多种功能基团的分离介质提供便利。
技术实现要素：
本发明主要涉及一种PVA接枝键合聚苯乙烯-二乙烯基苯交联微球亲水改性方法；合成的亲水性PS-DVB微球表面具有大量残留的羟基，可消除PS-DVB微球表面因苯环及悬挂双键存在造成的疏水性，且残留的羟基为进一步制备带有其他功能基团的分离介质提供结合位点，可进一步扩大PS-DVB微球在生物分离领域的应用。
本发明的一种PVA接枝键合聚苯乙烯-二乙烯基苯交联微球亲水改性方法主要可以通过以下几个步骤合成：
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入：
将干燥的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球与丙酮及去离子水加入到圆底烧瓶中，加入N-溴代丁二酰亚胺或N-氯代丁二酰亚胺，搅拌均匀后，加入醋酸钠或醋酸铵，室温下反应2-10h；反应结束收，砂芯抽干，分别用去离子水，乙醇，去离子水清洗；抽干后将此微球转移至圆底烧瓶中，加入一定量NaOH溶液或KOH溶液，室温下反应2-8h，反应结束后，用大量去离子水清洗至滤液呈中性，得到环氧化的微球A。
其所述的微球A具有以下结构：
本发明所述的步骤(a)中的微球A也可以按以下方法制备：
将干燥的PS-DVB微球与一定量试剂I，过氧化试剂II加入到圆底烧瓶中，在一定温度下反应适0.5-20h，反应结束后，砂芯抽干，分别用乙醇，去离子水清洗，得到环氧化PS-DVB微球。
本方法所述的一定量试剂I为乙腈，或硝基苯，或三氯乙腈，或二氯甲烷，或甲苯，或水，或DMF，或乙醇，或二氧六环，或氯仿，或丙酮，或是其中任意一种于其他溶剂的混合物；
其所述的环氧试剂II为H2O2，或过氧乙酸，或三氯乙酸，或单过氧化邻苯二甲酸镁，间氯过氧化苯甲酸，或二甲基二氧杂环丙烷。
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
将步骤(a)中所得的微球A在相转移催化剂及碱性条件下与一定浓度的PVA的有机溶液III反应，使得PVA通过羟基键合于PS-DVB微球表面，后经交联剂IV后交联后，得亲水性PS-DVB微球，化学反应式如下：
本发明所述的步骤(b)中相转移催化剂为苄基三乙基氯化铵，或四丁基溴化铵，或四丁基硫酸氢铵，或三辛基甲基氯化铵，或十二烷基三甲基氯化铵，或十四烷基三甲基氯化铵；
本发明所述的步骤(b)中碱为NaOH，或KOH，或叔丁醇钠，或丁基锂，或甲醇钠，或二异丙基胺基锂。
本发明所述的步骤(b)中PVA分子量为200-210000，醇解度60-89％，或96-98％；
本发明所述的步骤(b)中有机溶液III为DMF，或DMSO，或DMSO与水的混合溶液；
本发明所述的步骤(b)中交联剂IV为环氧氯丙烷，或二缩水甘油醚，或乙二醇二缩水甘油醚，或1，4-丁二醇二缩水甘油醚，或丙三醇三缩水甘油醚。
本发明的优点：
本发明所述的一种PVA接枝键合聚苯乙烯-二乙烯基苯交联微球是利用PS-DVB微球表面高反应活性环氧基与PVA的羟基经开环反应，避免制备氯甲基化PS-DVB微球过程中使用的强致癌物氯甲醚，后经进一步用交联剂后交联得到的一种亲水微球。首先PVA覆盖于PS-DVB微球表面，消除了PS-DVB微球表面因残留的苯环及悬挂双键造成的疏水性；其次PVA经过后交联反应，是的PVA在PS-DVB微球表面形成紧凑型亲水层，避免此亲水球在生物分离领域中高盐情况下造成的相塌陷而影响分离效果。
具体实施方案
实施例1
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取0.5g的N-溴代丁二酰亚胺于50mL的烧杯中，分别用量筒量取20mL的丙酮及4mL的去离子水于上述烧杯中，搅拌至N-溴代丁二酰亚胺完全溶解；将此溶液加入到带有1.0g干燥PS-DVB微球(交联度1％，无孔)的50mL的圆底烧瓶中，搅拌均匀后，加入0.2g的醋酸铵，室温下反应3h，反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇、去离子水清洗，抽干；将此微球转移至50mL的圆底烧瓶中，加入15mL的去离子水及3mL的NaOH(3mol/L)溶液，40℃下反应6h；反应结束后，砂芯过滤，10倍量的去离子水清洗，抽干备用。
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的40mg/mL的PVA(Mn＝200，醇解度60％)的DMSO溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.2g的四丁基溴化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、2mL的丙三醇三缩水甘油醚及5mL NaOH(3mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至50℃，保温反应5h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例2
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1g的N-氯代丁二酰亚胺于50mL的烧杯中，分别用量筒量取15mL的丙酮及4mL的去离子水于上述烧杯中，搅拌至N-氯代丁二酰亚胺完全溶解；将此溶液加入到带有1.0g干燥PS-DVB微球(交联度30％，有孔)的50mL的圆底烧瓶中，搅拌均匀后，加入0.3g的醋酸钠，室温下反应3h，反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇、去离子水清洗，抽干；将此微球转移至50mL的圆底烧瓶中，加入15mL的去离子水及3mL的NaOH(3mol/L)溶液，40℃下反应6h；反应结束后，砂芯过滤，10倍量的去离子水清洗，抽干备用。
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的40mg/mL的PVA(Mn＝6000，醇解度88％)的DMSO溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.2g的苄基三乙基氯化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、2mL的二缩水甘油醚及10mL NaOH(2mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至50℃，保温反应5h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例3
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1g的N-溴代丁二酰亚胺于50mL的烧杯中，分别用量筒量取15mL的丙酮及4mL的去离子水于上述烧杯中，搅拌至N-溴代丁二酰亚胺完全溶解；将此溶液加入到带有1.0g干燥PS-DVB微球(交联度30％，有孔)的50mL的圆底烧瓶中，搅拌均匀后，加入0.3g的醋酸钠，室温下反应3h，反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇、去离子水清洗，抽干；将此微球转移至50mL的圆底烧瓶中，加入15mL的去离子水及3mL的NaOH(3mol/L)溶液，40℃下反应6h；反应结束后，砂芯过滤，10倍量的去离子水清洗，抽干备用。
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的20mg/mL的PVA(Mn＝145000，醇解度88％)的DMF溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.2g的四丁基溴化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、2mL的环氧氯丙烷及10mL KOH(2mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至50℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例4
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1g的N-氯代丁二酰亚胺于50mL的烧杯中，分别用量筒量取15mL的丙酮及4mL的去离子水于上述烧杯中，搅拌至N-氯代丁二酰亚胺完全溶解；将此溶液加入到带有1.0g干燥PS-DVB微球(交联度60％，有孔)的50mL的圆底烧瓶中，搅拌均匀后，加入0.3g的醋酸铵，室温下反应2h，反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇、去离子水清洗，抽干；将此微球转移至50mL的圆底烧瓶中，加入15mL的去离子水及5mL的NaOH(2mol/L)溶液，40℃下反应5h；反应结束后，砂芯过滤，10倍量的去离子水清洗，抽干备用。
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的20mg/mL的PVA(Mn＝145000，醇解度88％)的DMF溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.2g的四丁基溴化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、2mL的环氧氯丙烷及10mL KOH(2mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至50℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例5
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1.0g干燥PS-DVB微球(交联度50％，无孔)于100mL的圆底烧瓶中，加入15mL的甲醇，3mL的30％H2O2及3mL的乙腈，搅拌均匀后升至65℃，继续反应3h；反应结束后，砂芯抽干，分别用10倍量的甲醇、去离子水清洗，抽干备用；
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的30mg/mL的PVA(Mn＝13000，醇解度88％)的DMF溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.3g的三辛基甲基氯化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0gPVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、4mL的环氧氯丙烷及10mL KOH(2mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至50℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例6
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1.0g干燥PS-DVB微球(交联度60％，有孔)于100mL的圆底烧瓶中，加入20mL的二氯甲烷及0.5g的间氯过氧化苯甲酸，搅拌均匀后，室温下继续反应3h；反应结束后，砂芯抽干，分别用10倍量的二氯甲烷、甲醇、去离子水清洗，抽干备用；
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的60mg/mL的PVA(Mn＝2000，醇解度88％)的DMF溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.2g的四丁基溴化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、4mL的丙三醇三缩水甘油醚及4mL KOH(4mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至60℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例7
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1.0g干燥PS-DVB微球(交联度50％，有孔)于100mL的圆底烧瓶中，加入80mL的甲醇-水溶液(甲醇/水＝1/8，mL/mL)及5.5g的80％的单过氧化邻苯二甲酸镁，搅拌均匀后，升温至60℃下继续反应30h；反应结束后，砂芯抽干，分别用10倍量的甲醇-水混合溶液、去离子水清洗，抽干备用；
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的40mg/mL的PVA(Mn＝47000，醇解度80％)的DMSO溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.2g的四丁基溴化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、4mL的1，4-丁二醇二缩水甘油醚及4mL KOH(4mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至60℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例8
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1.0g干燥PS-DVB微球(交联度40％，有孔)于250mL的圆底烧瓶中，加入80mL的二氧六环/氯仿溶液(二氧六环/氯仿＝1/2，mL/mL)及5.5g的80％的单过氧化邻苯二甲酸镁，搅拌均匀后，升温至80℃下继续反应20h；反应结束后，砂芯抽干，分别用10倍量的二氧六环/氯仿溶液、乙醇、去离子水清洗，抽干备用；
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的40mg/mL的PVA(Mn＝19500，醇解度88％)的DMSO溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.15g的十二烷基三甲基氯化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、4mL的二缩水甘油醚及4mL KOH(4mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至60℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例9
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1.0g干燥PS-DVB微球(交联度70％，有孔)于100mL的圆底烧瓶中，在0℃下加入20mL的二氯甲烷及3.0ml 32％的过氧乙酸，搅拌均匀后，保温继续反应6h；反应结束后，砂芯抽干，分别用10倍量的乙醇、去离子水清洗，抽干备用；
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的40mg/mL的PVA(Mn＝20500，醇解度88％)的DMSO溶液，搅拌均匀，升至70℃，加入0.1g的三辛基甲基氯化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0gPVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMF、4mL的环氧氯丙烷及4mL KOH(4mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至60℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。
实施例10
步骤(a)PS-DVB微球表面环氧基团的引入
称取1.0g干燥PS-DVB微球(交联度30％，有孔)于100mL的圆底烧瓶中，在-20℃下加入二甲基二氧杂环丙烷溶液，搅拌均匀后，保温继续反应20h后，升至室温继续反应8h；反应结束后，砂芯抽干，分别用10倍量的丙酮，乙醇、去离子水清洗，抽干备用；
步骤(b)PS-DVB微球表面PVA的键合及后交联
称取1.0g上述得到的环氧化PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，量筒量取10mL的DMSO于上述圆底烧瓶中，溶胀过夜，加入20mL的40mg/mL的PVA(Mn＝6700，醇解度80％)的DMSO溶液，搅拌均匀，升至80℃，加入0.1g的十四烷基三甲基氯化铵，保温反应20h；反应结束后，砂芯抽干，10倍量的热水清洗，抽干备用。
称取1.0g PVA接枝键合后的PS-DVB微球于100mL的圆底烧瓶中，分别加入20mL的DMSO、4mL的二缩水甘油醚及4mL KOH(4mol/mL)溶液，搅拌均匀后，升温至60℃，保温反应4h；反应结束后，砂芯过滤，分别用10倍量的乙醇及去离子水清洗，真空干燥至恒重，得亲水性PS-DVB微球。