本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种绝对定量检测副溶血性弧菌的引物/探针和试剂盒，更具体地，涉及一种绝对定量检测副溶血性弧菌的微滴式数字聚合酶链式反应(dropletdigitalpolymerasechainreaction,ddpcr)试剂盒和检测方法。
背景技术：
副溶血性弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，广泛存在于海水和海产品中，是中国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。其致病性跟食物中的带菌量密切相关，总副溶血性弧菌的数量是经常被用来评价食物污染程度的一个重要指标。如中国“食品安全国家标准食品中致病菌限量(gb29921-2013)”中明确提出水产制品及水产调味品中副溶血性弧菌的最低限量为100mpn/g；日本也要求生食的鱼片和贝类中副溶血性弧菌的总数不得超过100cfu/g。因此，为保障食品卫生质量和食用安全，有必要对食品中副溶血性弧菌进行定量检测。
当前副溶血性弧菌定量检测的主要手段仍是以传统的mpn法为主，如中国食品安全国家标准“食品微生物学检验副溶血性弧菌检验(gb4789.7-2013)”即采用该方法。然而mnp法是一种概率估算细菌浓度的方法，在实际应用中存在着诸多缺点：1)需要对样品进行复杂的梯度稀释和检测重复，稀释的精确性会直接影响定量结果；2)需要进行增菌培养，不仅费时，而且样品中潜在的其他杂菌有可能会因过度增殖而给目标菌鉴定造成干扰；3)仍需要经过选择性平板分离、生化鉴定等复杂的过程，检测时间一般需要3～5天；4)食品中的副溶血性弧菌经常以“活的不可培养状态(vbnc)”存在，mpn法无法有效检测到这部分细菌，从而影响检测结果的准确性。
近年来，以实时荧光pcr(qpcr)为代表的分子生物学技术也逐渐被广泛应用到副溶血性弧菌的定量检测中去。相比较于传统培养法，qpcr快速，简便，灵敏、特异，但该方法属于相对定量，结果的准确性和重复性在很大程度上依赖于所绘制的标准曲线质量及扩增效率，并且需要具备已知浓度的核酸标准品。目前尚没有一个官方权威机构可以提供这种具有明确量值(即核酸拷贝数或质量浓度)的副溶血性弧菌核酸标准品。在实际检测中对自行构建的核酸标准分子的定量分析多采用紫外分光光度法，得到的是260nm处所有核酸分子的吸光度值，标准品中其他dna或rna分子以及蛋白等杂质成分均会影响测定结果的准确性。正是由于qpcr定量检测中缺乏统一的核酸标准品，加上样品中存在不同程度的核酸扩增抑制成分干扰导致扩增效率的差异，因此，不同实验室间qpcr的定量检测结果往往缺少可比性。
新兴的微滴式数字pcr(ddpcr)被认为是第三代核酸扩增技术，通过把稀释到一定浓度的dna分子分布到10000～20000个微滴中，使大部分微滴中dna分子的数量为1或0，然后通过pcr扩增和阳性信号的累积来读取阳性反应单元数，再根据泊松分布计算出样本中的dna分子数，从而实现对dna分子的绝对定量。目前该技术用于微生物的定量分析尚处于起步阶段，相关的研究如临床样本中人疱疹病毒、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、沙眼衣原体、寄生虫隐孢子虫，牛粪便样本中产志贺毒素的大肠埃希氏菌，以及导致梨火疫病和马铃薯褐腐菌病的植物病原菌等，尚未见到可用于食品中副溶血性弧菌定量检测的相关报道。由于食品基质多富含蛋白、脂肪、果胶等核酸扩增抑制成分，背景菌构成复杂且浓度较高，因此，ddpcr对食品中副溶血性弧菌定量分析的有效性和实用性尚未可知，开发空间和应用前景广阔。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一组特异性强、灵敏度高、重复性好的用于检测副溶血性弧菌的ddpcr引物和探针；
本发明的第二个目的在于提供一种操作简单、精确度高的绝对定量检测副溶血性弧菌的ddpcr试剂盒；
本发明的第三个目的在于提供一种绝对定量检测副溶血性弧菌的ddpcr方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明通过选取副溶血性弧菌具有种属特异性且高度保守的单拷贝β-内酰胺酶编码基因blacarb作为靶序列，设计出4对引物和探针组合，具体序列见表1，经过筛选最终获得特异性强、适用于ddpcr扩增条件的引物/探针1套(blacarb-f3/r3/p3)，其中，探针5’端标记fam，3’端标记bhq。
表1ddpcr引物和探针序列
a)引物/探针位置参考genbankno.ng_048735.1序列信息。
本发明绝对定量检测副溶血性弧菌的ddpcr试剂盒，该试剂盒包含上述ddpcr引物和探针序列。进一步，试剂盒还包括完成ddpcr反应所需材料和试剂，如副溶血性弧菌阳性对照dna、ddpcrmastermix、微滴生成油、微滴生成卡、twintecsemi-skirted96孔板、铝箔热封膜。
本发明还提供了绝对定量检测副溶血性弧菌的ddpcr检测方法，包括：
(1)提取待测样品基因组的dna；
(2)配置ddpcr反应体系：具体见表2，包括序列表中seqidno.1至seqidno.3所示的引物和探针；
表2ddpcr反应体系
(3)微滴生成：将ddpcr反应体系和微滴生成油加入到微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴。
(4)扩增反应：将生成的微滴转移到96孔板中，封膜后置于pcr仪(geneamp9700,appliedbiosystems,fostercity,ca)上进行扩增反应，具体条件见表3；
表3ddpcr反应条件
注：升降温速度应≤2.5℃/s
(5)结果判定
将扩增后的96孔板置于微滴读取仪(qx100,bio-rad,pleasanton,ca)中，利用quantasoft软件进行结果读取和分析。含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴会呈现出荧光信号强度的差异，以阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线。按照泊松分布原理计算获得副溶血性弧菌blacarb基因的拷贝数。
本发明的有益效果如下：
本发明针对副溶血性弧菌的ddpcr定量检测方法和试剂盒不仅适用于粪便等临床样本，更适于对水产等食品样品的检测，为水产等高风险食品提供了一种新的副溶血性弧菌定量检测方法，为保障食品安全、开展风险评估等工作提供了有力的武器。具体而言，该ddpcr定量检测技术较传统mpn法和qpcr法具有以下优势：1)ddpcr针对副溶血性弧菌单拷贝基因blaacarb-17进行直接绝对定量，检测灵敏度可以达到40拷贝(cfu)/g，满足国内外对食品中副溶血性弧菌污染最低控制水平的要求；2)无需进行增菌培养及后续的特征性菌落鉴定、生化分析等步骤，大幅缩短检测时间，简化操作流程；3)直接提取水产等样品匀浆dna，无需对样品进行复杂的稀释和检测重复，减少了稀释偏差对定值结果的影响；4)ddpcr针对细菌基因组的检测，能有效检测到活的不可培养状态(vbnc)的细菌，从而弥补mpn和平板计数等培养法在vbnc细菌检测中的欠缺；5)无需依赖任何核酸标准品，不需要绘制标准曲线，避免了由pcr扩增效率差异所导致的偏差；6)由于ddpcr是终点检测，对样品中抑制剂的耐受度更高；7)特别适于低污染水平样品的定量分析，具有更高的精确度和重复性，易于标准化。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示qpcr对引物探针的筛选(a)与特异性验证(b)；
图2示ddpcr对引物探针的筛选(a)与特异性验证(b)；
图3示出梯度稀释的副溶血性弧菌纯菌液的qpcr扩增图谱(a)与标准曲线(b)；
图4示出梯度稀释的副溶血性弧菌纯菌液的ddpcr扩增微滴分布图；
图5示出副溶血性弧菌纯菌液中基因组浓度定值结果比较：x轴代表ddpcr定值检测时对纯菌液的稀释倍数，实线代表各稀释度菌液ddpcr定值结果的对数平均值(9.06)，虚线代表利用核酸分析仪测得结果的对数平均值(9.59)，点线代表平板计数测得的结果的对数平均值(9.95，按照1cfu菌落含1拷贝基因组计算)；
图6示出人工污染牡蛎样品qpcr检测扩增曲线图；
图7示出人工污染牡蛎样品的ddpcr扩增微滴分布图；
图8示出qpcr(a)和ddpcr(b)对人工污染牡蛎样品中副溶血性弧菌含量的测定结果同平板计数预计值间的相关性分析；
图9示出ddpcr与qpcr对人工污染牡蛎样品中副溶血性弧菌含量测定结果的比较。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1试验菌株及培养条件
共使用210株菌(表4)，其中包括副溶血性弧菌标准菌株2株、自分离株132株，其他弧菌标准/参照/自分离菌株56株，以及其他常见的食源性致病菌标准菌株20株。
所有弧菌和非弧菌菌株分别在t1n1琼脂平板和bhi琼脂平板上活化3代后，挑取单菌落分别接种于5ml3％氯化钠碱性蛋白胨水和5mlbhi液体培养基中，37℃110r/min震荡培养18h，取1ml菌液根据需要进行10倍梯度稀释，用于细菌基因组dna的提取。
表4实验用菌株列表
注：atcc：美国典型培养物保藏中心；cmcc：医学微生物菌种保藏管理中心；cgmcc：中国一般微生物典藏中心；bjciq：北京出入境检验检疫局；gdciq：广东出入境检验检疫局。
实施例2ddpcr引物、探针设计、筛选与特异性验证
为实现对副溶血性弧菌的特异性检测和绝对定量分析，我们选取副溶血性弧菌具有种属特异性且高度保守的单拷贝β-内酰胺酶编码基因blacarb(genbankno.ng_048735.1)作为靶序列，通过ncbi在线工具进行序列分析和比对，利用primeexpress软件v3.0(abi,fostercity,ca,usa)设计出4对引物和探针组合，序列见表1。探针5’端标记fam，3’端标记bhq。引物/探针均由北京六合通经贸有限公司合成。
首先，采用qpcr方法对已设计合成的4对引物探针进行筛选。通过对副溶血性弧菌(atcc17802)基因组dna的检测，发现所有引物探针均能有效扩增出靶基因，但引物探针组blacarb-f3/r3/p3的荧光信号最强，出现时间最早，扩增效果最好(图1a)。为保证扩增反应的特异性，选取blacarb-f3/r3/p3引物探针组，对表1中所列2株副溶血性弧菌标准菌株(atcc17802与cgmcc1.1997)、1株副溶血性弧菌自分离株(no.75)以及其他常见弧菌和食源性致病菌dna进行检测，结果发现只有3株副溶血性弧菌出现阳性扩增信号，而其他常见弧菌及食源性致病菌检测均呈阴性(图1b)。表明blacarb-f3/r3/p3引物探针组具有良好的特异性。
继而采用ddpcr对副溶血性弧菌(atcc17802)基因组dna进行检测，进一步验证上述引物、探针的有效性。结果发现所有引物、探针扩增后均能出现明显的阳性微滴簇和阴性微滴簇，且同qpcr检测结果一样，blacarb-f3/r3/p3引物探针组的荧光信号最强，基线最平直，阴/阳性微滴的区分度最好(图2a)。利用常见弧菌对ddpcr检测体系中blacarb-f3/r3/p3引物探针的特异性进行验证，发现只有3株副溶血性弧菌出现阳性微滴簇，霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌ddpcr检测均呈阴性(图2b)。综上可见，blacarb-f3/r3/p3灵敏、特异，且同时满足qpcr和ddpcr的扩增条件，将其用于后续的定量分析试验和试剂盒的组装。
实施例3检测副溶血性弧菌的ddpcr试剂盒
试剂盒主要包括：
(1)用于检测副溶血性弧菌的引物和探针(所述引物和探针的序列如seqidno.1-3所示)，由北京六合通经贸有限公司合成；
(2)阳性对照：副溶血性弧菌atcc17802基因组dna，1000拷贝/μl；
(3)ddpcrmastermix，购自美国biorad公司；
(4)微滴生成油，购自美国biorad公司；
(5))微滴生成卡，购自美国biorad公司；
(6)twintecsemi-skirted96孔板，购自德国eppendorf公司；
(7)铝箔热封膜，购自美国biorad公司。
实施例4检测方法的建立
(1)提取待测样品基因组的dna：采用细菌基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：dp302)提取各稀释度菌液dna，提取步骤按照试剂盒说明书进行，最终将核酸溶解在50μlte缓冲液中；
(2)配置ddpcr反应体系，具体见表2；
(3)微滴生成：将20μl的ddpcr反应预混液和70μl微滴生成油分别加入到8孔微滴生成卡中，置于微滴生成仪(qx100,bio-rad,pleasanton,ca)中生成微滴；
(4)扩增反应：将生成的油包水的微滴(40μl)缓慢转移至96孔板中，封膜后置于pcr仪(geneamp9700,appliedbiosystems,fostercity,ca)上进行扩增反应，扩增条件如表3所示；
(5)结果判定：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪(qx100,bio-rad,pleasanton,ca)中，利用quantasoft软件进行结果读取和分析。含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴会呈现出荧光信号强度的差异，以阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线。按照泊松分布原理计算获得副溶血性弧菌blacarb基因的拷贝数。
实施例5副溶血性弧菌纯菌液的检测
1、基因组dna提取与核酸蛋白分析仪测定
利用3％氯化钠碱性蛋白胨水对副溶血性弧菌(atcc17802)的过夜培养物进行10倍梯度稀释。采用细菌基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：dp302)提取各稀释度菌液dna，提取步骤按照试剂盒说明书进行，最终将核酸溶解在50μlte缓冲液中。对提取的核酸用核酸蛋白分析仪(beckmancoulter,du800)进行浓度和纯度的测定，确保提取核酸的a260/a280在1.8-2.0之间，并按下列公式计算提取副溶血性弧菌基因组dna的拷贝浓度：
其中m代表核酸蛋白分析仪测得的核酸浓度(ng/μl)；n代表细菌基因组的长度(bp)，根据ncbi上已经发布的副溶血性弧菌基因组的测序数据，其平均长度为5.3×106bp。
副溶血性弧菌(atcc17802)在3％氯化钠碱性蛋白胨水中的过夜培养物1ml，提取的基因组dna(共50μl)浓度为447ng/μl，代入上述公式算得提取到的基因组dna浓度为7.7×107拷贝/μl，按照1拷贝基因组对应1个cfu菌落，则原始菌液浓度为3.85×109cfu/ml，其对数值为9.59。
2、平板计数
同时对10倍梯度稀释的副溶血性弧菌(atcc17802)纯菌液，分别吸取1ml菌悬液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。及时将15～20ml冷却至46℃的平板计数t1n1琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，36℃倒置培养24h±2h。选取菌落数在30～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，每个稀释度菌落数应取两个平板的平均数。结果测得原始菌液浓度为9.2×109cfu/ml，其对数值为9.95。
3、qpcr和ddpcr检测
各稀释度菌液提取到的dna同时进行qpcr和ddpcr检测，结果发现两者均可检测到10-7稀释度(图3a，图4)，具有相同的检测灵敏度。qpcr在10-1至10-7范围内检测结果呈良好的线性关系(r2＝0.999)，标准曲线斜率-3.54，扩增效率达91.7％(图3b)。ddpcr在10-2稀释度达到检测上限，阳性微滴的比率达100％，自10-3至10-7稀释度菌液测得的基因组浓度也呈现出良好的线性关系，最低定量限为122拷贝/ml(相当于4.9拷贝/反应)(图4，表5)。在定值范围内ddpcr测定结果具有高度一致性，由不同稀释度菌液计算出原菌液中副溶血性弧菌基因组含量的对数值在8.92～9.11范围内，变异系数(cv)仅0.8％，其平均值为9.06，比核酸蛋白分析仪和平板计数法测得值分别低0.53和0.89个log值(图5)。
表5梯度稀释的副溶血性弧菌纯菌液ddpcr定量检测结果
实施例6人工污染牡蛎样品的检测
选择经传统方法验证无副溶血性弧菌的牡蛎样品作为添加基质。对副溶血性弧菌(atcc17802)过夜培养菌悬液进行10倍梯度稀释并平板计数，同时取10-5、10-6、10-7、10-8稀释度菌液各25ml分别添加到盛有25g牡蛎样品的均质袋中，各添加浓度分别设5个样品重复，另取1份25g牡蛎样品加入3％氯化钠碱性蛋白胨水代替添加菌液作为阴性对照，上述样品用拍击式均质器拍击2min，制成系列1:1含有不同浓度副溶血性弧菌的污染样品。取各样品匀液2ml分别利用试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：dp302)法提取细菌基因组dna，最终将核酸溶解在50μlte缓冲液中，进行ddpcr和qpcr检测，比较两者的定值效果。
根据添加菌液的平板计数结果，估计10-8至10-5菌液污染样品中副溶血性弧菌含量为2.2×101～2.2×104cfu/g。在进行qpcr时，以10倍梯度稀释的副溶血性弧菌基因组dna(经核酸蛋白分析仪测定其原液浓度为3.96×107拷贝/μl)作为标准品，同人工污染样品中提取的dna一起进行扩增检测。结果发现4个不同污染水平的牡蛎样品均呈阳性扩增，qpcr扩增曲线如图6所示，根据检测ct值和得到的标准曲线计算污染样品中副溶血性弧菌平均含量分别是25584、3465、360、127拷贝/g(表6)。而ddpcr检测结果显示，随着污染水平的下降，出现的阳性微滴数量逐渐减少(图7)，根据阳性微滴数量和泊松分布原理，由quantasoft软件计算直接测定的副溶血性弧菌含量分别为25100、3800、365、40拷贝/g(表6)。总体而言，qpcr和ddpcr的定量结果同平板计数的预计值间均存在良好的相关性(r2均大于0.99，图8)。配对t检验结果表明qpcr和ddpcr两种方法对10-5至10-7菌液污染样品的定量结果无显著性差异(p＞0.005，表5、图8)；而对10-8菌液污染样品，qpcr的测定结果明显偏高，同ddpcr测定结果存在显著性差异(p＜0.005，表6、图9)，ddpcr对于低污染水平样品的测定结果更加准确，在不经增菌培养的条件下，其最低定量限即可达40拷贝/g，具有较高的灵敏性，满足国内外对食品中副溶血性弧菌污染最低控制水平的要求。
表6ddpcr与qpcr对人工污染牡蛎样品中副溶血性弧菌的定量检测结果
实施例7ddpcr检测副溶血性弧菌的重复性分析
上述针对副溶血性弧菌纯菌液和人工污染牡蛎的检测结果皆可用来评估整体检测的重复性。由表5和表6可见，在整个定量检测动态范围内，针对副溶血性弧菌blacarb基因的测定结果变异系数cv均小于20％，满足国际上对核酸定量方法的验证要求，证明该方法用于副溶血性弧菌定量检测时具有良好的重复性。而且在对人工污染牡蛎样品的检测中，ddpcr的定量结果的cv普遍小于qpcr，说明ddpcr具有更好的定量重复性，特别是对于低污染水平样品(10-7和10-8)这种优势更加明显(表6，图9)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110>北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>一种绝对定量检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法
<130>jlc16i0435e
<160>12
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-f3
<400>1
gtgaagccgccatgttgat19
<210>2
<211>26
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-r3
<400>2
gaccaccaatttcatttagcactaag26
<210>3
<211>19
<212>dna
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<400>3
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<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-f1
<400>4
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<210>5
<211>20
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<213>人工合成引物blacarb-r1
<400>5
cgattttcgctgtggcattt20
<210>6
<211>24
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-p1
<400>6
cgacatggacagcggcaaactcaa24
<210>7
<211>21
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-f2
<400>7
cgaacgtttcccattaatgag21
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-r2
<400>8
gctgtccatgtcgcttagca20
<210>9
<211>27
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-p2
<400>9
acatttaaaacgttagcgtgtgccacc27
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-f4
<400>10
ccccgtttgaatgaagcaaa20
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<400>11
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<211>23
<212>dna
<213>人工合成引物blacarb-p4
<400>12
ccgggcgacaagcgagacaccac23