本发明涉及一种高含量甘露聚糖酵母培养物的生产方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
酵母培养物通常是指酿酒酵母菌在特定工艺和营养条件下经过充分发酵获得的复合培养物，该培养物主要有三部分组成：酵母菌体、酵母代谢产物、变性的营养基质，这些组分中富含甘露聚糖、葡聚糖、氨基酸、B族维生素、核酸等有效成分和部分未知功能因子。作为功能型饲料原料，酵母培养物具有显著的抗病、增产的功效，可以向动物消化道内微生物提供营养物质，从而激发它们的代谢活性和稳定体内微生态环境，与抗生素类添加剂相比，具有绿色天然、无毒副作用以及适口性好、营养丰富等优点，因此被广泛应用于畜禽养殖领域。
酵母培养物的功能及其机制主要为：改善胃肠道菌群落结构，提高动物生产性能；补充营养，改善消化功能，提高机体免疫力及抗病力。
甘露聚糖是酵母培养物的关键功能因子，它能显著增加动物体液免疫和细胞免疫能力，调节肠道菌群平衡，结合吸附外源性病原菌，选择性吸附细菌毒素，并具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤等活性功能。鉴于此，2013年12月19日农业部发布第2038号公告，将“酿酒酵母培养物”从《饲料添加剂品种目录》转入《饲料原料目录》，并将甘露聚糖作为该产品强制性标识要求指标，甘露聚糖对酿酒酵母培养物的重要性可见一斑。
甘露聚糖位于酵母细胞壁外侧，酵母细胞壁是典型的三明治结构，中间夹层是由蛋白质组成，两侧分别是由甘露聚糖和β-葡聚糖以及小部分几丁质、磷脂和纤维类物质致密缔结成立体空间网状结构，酵母甘露聚糖约占酵母干重的10-20％。酵母甘露聚糖的含量受外部环境的显著影响，刘红芝等在研究中发现甘露聚糖含量受到酵母培养营养因素的制约；倪靖岳等在研究中发现培养条件显著影响甘露聚糖的含量。
虽然甘露聚糖是酵母培养物的关键功能因子，但是酵母培养物生产技术相关文献中却鲜有报道，当前酵母培养物的技术研发主要集中于廉价底物的选择上，归根结底主要是为了降低成本、变废为宝，如中国专利(申请号：201410076270.0)报道了以黄酒糟为基质进行酵母培养物的制备；而中国专利(申请号：201510319359.X)报道了以白酒糟为基质进行湿态酵母培养物的移动发酵；此外，中国专利(申请号：201510578518.8)报道了以混合糟渣为原料进行酵母培养物的发酵生产。
酿酒酵母是兼性菌，可适应各种培养环境，但在不同环境中其底物转化和产物代谢途径不尽相同，为了使酵母培养物经过充分发酵，发酵过程通常融合液态-固态发酵、好氧-厌氧发酵等多种培养模式。如何在多种培养模式融合的发酵过程中，通过调控工艺参数来提高甘露聚糖含量对于酵母培养物的生产技术创新具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明需要解决的技术问题是提供一种高含量甘露聚糖酵母培养物的生产方法，使用该工艺生产的酵母培养物中甘露聚糖含量达到4.0～4.5％，水溶性蛋白达到7％～9％。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种高含量甘露聚糖酵母培养物的生产方法，包括以下步骤：
步骤a、酿酒酵母种子液的制备：挑取斜面保藏的酿酒酵母菌种1～2环，接种至种子培养基中，于摇床振荡培养，得到酿酒酵母种子液；
步骤b、酿酒酵母液态高密度培养：将酿酒酵母种子液接种至装有液态发酵培养基的反应罐中于中温、弱酸环境下培养；
步骤c、高含量甘露聚糖酿酒酵母低温和双氧水胁迫培养：降低反应罐的反应温度，同时将15％～25％质量浓度的双氧水匀速流加至反应罐内，至反应罐内双氧水的终浓度达到6～10mmol/L，然后继续培养若干小时，得到发酵培养液；
步骤d、酿酒酵母固态厌氧培养：将发酵培养液与固态培养基按照一定重量比混合，得到混合物，然后将混合物转移至固态发酵箱于密闭不通气状态下厌氧培养，得到培养物；
步骤e、低温烘干：将培养物转移至干燥装置中，采用低温热风将培养物进行烘干，得到干燥酵母培养物；
步骤f、粉碎及包装：将干燥酵母培养物粉碎、封装成袋，避光存放于阴凉干燥处。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤a中酿酒酵母菌种为CICC1355，酿酒酵母菌种的种子培养基各组份及其重量百分比为：0.5～1％酵母浸膏、0.5～1％蛋白胨、0.5～1％豆粕粉、蔗糖1～2％，其余为纯化水。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤a中摇床振荡培养的温度为30～32℃、振荡转速为200～250rpm、振荡培养时间为16～18h。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤b中酿酒酵母的液态发酵培养基各组份及其重量百分比为：0.5～1％蛋白胨，1.5～2％豆粕粉、1～1.5％玉米粉、糖蜜2～4％，其余为纯化水。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤b中反应罐内反应温度为30～32℃、pH为5.0～6.0、搅拌转速为150～250rpm、通气速率为0.5～1.0vvm、培养时间为18～20h。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤c中将反应罐内反应温度降低至24～26℃，同时通过蠕动泵将双氧水匀速流加至反应罐内；继续培养时间为4～6小时。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤d中发酵培养液与固态培养基的重量混合比为3:6～3:8，固态培养基的各组份及其重量百分比为：15～35％豆粕粉、5～10％玉米粉、55～80％小麦麸皮。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤d中固态发酵箱厌氧培养时间为24～28小时，固态发酵箱中固态发酵室的温度为30～32℃。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤e中低温热风的温度为50℃～70℃，干燥酵母培养物的含水量为13％以下，干燥酵母培养物甘露聚糖含量达到4～4.5％，水溶性蛋白达到7％～9％。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤f中使用粉碎机将干燥酵母培养物粉碎成40～60目粒度，包装机进行封装成袋，包装量为10～50Kg/袋。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明的目的是提供一种高含量甘露聚糖酵母培养物的生产方法。整个生产过程采用了液态好氧-固态厌氧分阶段培养的方式；在液态好氧发酵阶段后期采用的低温和双氧水氧化胁迫培养有利于高含量甘露聚糖酿酒酵母的形成，使用该工艺生产的酵母培养物中甘露聚糖含量达到4.0～4.5％，水溶性蛋白达到7％～9％。其中的CICC1355购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，属于《中国微生物菌种总目录》中的工业微生物菌种，菌号CICC 1355中文名称：酿酒酵母，种名：Saccharomyces，属名cerevisiae，用途：饲料酵母。
本发明的原理：首先，前期采用的液态好氧高密度发酵方式为后续阶段提供了足够数量的微生物细胞；接着采用的低温和双氧水氧化胁迫培养有利于高含量甘露聚糖酿酒酵母的形成；最后阶段的固态厌氧发酵有利于酵母充分发酵合成更为丰富的功能性成分。发酵结束后，将固态发酵培养物进行低温干燥、粉碎，即获得成品。
步骤a中酿酒酵母菌种的种子培养基各组份及其重量百分比为：0.5～1％酵母浸膏、0.5～1％蛋白胨、0.5～1％豆粕粉、蔗糖1～2％，其余为纯化水。配置简易，营养价值高；步骤b中酿酒酵母的液态发酵培养基各组份及其重量百分比为：0.5～1％蛋白胨，1.5～2％豆粕粉、1～1.5％玉米粉、糖蜜2～4％，其余为纯化水，配置简易，营养丰富，其中选用的糖蜜，是一种粘稠、黑褐色、呈半流动的物体，主要含有蔗糖，蔗糖蜜中泛酸含量较高，达37mg/kg，此外生物素含量也很可观。糖蜜是制糖工业的副产品，组成因制糖原料、加工条件的不同而有差异，其中主要含有大量可发酵糖(主要是蔗糖)，因而是很好的发酵原料，可用作酵母、味精、有机酸等发酵制品的底物或基料，可用作某些食品的原料和动物饲料。
低温和双氧水氧化胁迫培养有利于高含量甘露聚糖酿酒酵母的形成，液态好氧-固态厌氧分阶段多模式培养的方式有利于酵母充分发酵合成更为丰富的功能性成分。本发明的工艺稳定性好，无霉菌污染，产品安全；营养价值高；工艺简单、成本低、易于操作、质量稳定，生产过程环保，无环境污染，参数易于控制，发酵效率和发酵质量高。
具体实施方式
一种高含量甘露聚糖酵母培养物的生产方法，包括以下步骤：
步骤a、酿酒酵母种子液的制备：挑取斜面保藏的酿酒酵母菌种1～2环，接种至种子培养基中，于摇床振荡培养，得到酿酒酵母种子液；
步骤b、酿酒酵母液态高密度培养：将酿酒酵母种子液接种至装有液态发酵培养基的反应罐中于中温、弱酸环境下培养；
步骤c、高含量甘露聚糖酿酒酵母低温和双氧水胁迫培养：降低反应罐的反应温度，同时将15％～25％质量浓度的双氧水匀速流加至反应罐内，至反应罐内双氧水的终浓度达到6～10mmol/L，然后继续培养若干小时，得到发酵培养液；
步骤d、酿酒酵母固态厌氧培养：将发酵培养液与固态培养基按照一定重量比混合，得到混合物，然后将混合物转移至固态发酵箱于密闭不通气状态下厌氧培养，得到培养物；
步骤e、低温烘干：将培养物转移至干燥装置中，采用低温热风将培养物进行烘干，得到干燥酵母培养物；
步骤f、粉碎及包装：将干燥酵母培养物粉碎、封装成袋，避光存放于阴凉干燥处。
步骤a中酿酒酵母菌种为CICC1355，酿酒酵母菌种的种子培养基各组份及其重量百分比为：0.5～1％酵母浸膏、0.5～1％蛋白胨、0.5～1％豆粕粉、蔗糖1～2％，其余为纯化水。
步骤a中摇床振荡培养的温度为30～32℃、振荡转速为200～250rpm、振荡培养时间为16～18h。
所述步骤b中酿酒酵母的液态发酵培养基各组份及其重量百分比为：0.5～1％蛋白胨，1.5～2％豆粕粉、1～1.5％玉米粉、糖蜜2～4％，其余为纯化水。
步骤b中反应罐内反应温度为30～32℃、pH为5.0～6.0、搅拌转速为150～250rpm、通气速率为0.5～1.0vvm、培养时间为18～20h。
步骤c中将反应罐内反应温度降低至24～26℃，同时通过蠕动泵将双氧水匀速流加至反应罐内；继续培养时间为4～6小时。
步骤d中发酵培养液与固态培养基的重量混合比为3:6～3:8，固态培养基的各组份及其重量百分比为：15～35％豆粕粉、5～10％玉米粉、55～80％小麦麸皮。
步骤d中固态发酵箱厌氧培养时间为24～28小时，固态发酵箱中固态发酵室的温度为30～32℃。
步骤e中低温热风的温度为50℃～70℃，干燥酵母培养物的含水量为13％以下，干燥酵母培养物甘露聚糖含量达到4～4.5％，水溶性蛋白达到7％～9％。
步骤f中使用粉碎机将干燥酵母培养物粉碎成40～60目粒度，包装机进行封装成袋，包装量为10～50Kg/袋。
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
实施例一：
一种高含量甘露聚糖酵母培养物的生产方法，包括以下步骤：
步骤a、酵母种子液的制备：挑取斜面保藏的酿酒酵母(CICC1355)菌种2环，接种至种子培养基中，30℃、200rpm摇床振荡培养18h。
步骤b、酿酒酵母液态高密度培养：将种子培养液接种至装有液态发酵培养基的1000升反应罐中，罐内温度30℃、控制pH在5.0～6.0范围内，搅拌转速200rpm，通气速率1.0vvm培养20h。
步骤c、高含量甘露聚糖酿酒酵母低温和双氧水胁迫培养：将步骤b发酵系统的温度降低至24℃，同时通过蠕动泵将20％质量浓度的双氧水匀速流加至反应罐内，至双氧水终浓度达到8mmol/L，继续培养6小时。
步骤d、酿酒酵母固态厌氧培养：步骤c完成后的发酵培养液与以豆粕和麸皮为主的固态发酵培养基以3:7重量比混合，转移至固态发酵箱，固态发酵室温控制在30℃，发酵箱密闭不通气状态下厌氧培养28小时。
步骤e、低温烘干：步骤d获得的培养物转移至干燥装置中，采用50℃热风将培养物含水量降至13％以下。
步骤f、粉碎及包装：使用粉碎机将步骤e获得干燥酵母培养物粉碎成40目粒度，包装机封装成袋，包装量为10～50Kg/袋，避光存放于阴凉干燥处。
步骤a中酿酒酵母的种子培养基成分以重量百分比计为：0.5％酵母浸膏，0.5％蛋白胨，1％豆粕粉、蔗糖2％，其余为纯化水。
步骤b中酿酒酵母的液态发酵培养基成分以重量百分比计为：0.5％蛋白胨，1.5％豆粕粉，1～1.5％玉米粉、糖蜜4％，其余为纯化水。
步骤d中固态发酵培养基成分以重量百分比为：15％豆粕粉、10％玉米粉、75％小麦麸皮。
干燥酵母培养物甘露聚糖含量达到4％，水溶性蛋白达到7％。
实施例二
步骤a、酿酒酵母种子液的制备：挑取斜面保藏的酿酒酵母菌种2环，接种至种子培养基中，32℃、250rpm摇床振荡培养16h；
步骤b、酿酒酵母液态高密度培养：将种子培养液接种至装有液态发酵培养基的反应罐中，罐内温度32℃、控制pH在5.0～6.0范围内，搅拌转速150rpm，通气速率0.75vvm培养18h。
步骤c、高含量甘露聚糖酿酒酵母低温和双氧水胁迫培养：将步骤b发酵系统的温度降低至26℃，同时通过蠕动泵将15％浓度的双氧水匀速流加至反应罐内，至终浓度达到8mmol/L，继续培养4小时。
步骤d、酿酒酵母固态厌氧培养：步骤c完成后的发酵培养液与以豆粕和麸皮为主的固态培养基以3:7重量比混合，转移至固态发酵箱，固态发酵室温控制在32℃，发酵箱密闭不通气状态下厌氧培养24小时。
步骤e、低温烘干：步骤d获得的培养物转移至干燥装置中，采用70℃热风将培养物含水量降至13％以下。
步骤f、粉碎及包装：使用粉碎机将步骤e获得干燥酵母培养物粉碎成60目粒度，包装机封装成袋，包装量为10～50Kg/袋，避光存放于阴凉干燥处。
步骤a中酿酒酵母的种子培养基成分以重量百分比比为：1％酵母浸膏，0.5％蛋白胨，0.5％豆粕粉、蔗糖2％，其余为纯化水。
步骤b中酿酒酵母的液态发酵培养基成分以重量百分比比为：1％蛋白胨，2％豆粕粉、1％玉米粉、糖蜜4％，其余为纯化水。
步骤d中固态发酵培养基成分以重量百分比为：20％豆粕粉、10％玉米粉、70％小麦麸皮。
干燥酵母培养物甘露聚糖含量达到4.2％，水溶性蛋白达到9％。
实施例三
步骤a、酿酒酵母种子液的制备：挑取斜面保藏的酿酒酵母菌种2环，接种至种子培养基中，31℃、230rpm摇床振荡培养17h；
步骤b、酿酒酵母液态高密度培养：将种子培养液接种至装有液态发酵培养基的反应罐中，罐内温度31℃、控制pH在5.5，搅拌转速220rpm，通气速率1.0vvm培养19h。
步骤c、高含量甘露聚糖酿酒酵母低温和双氧水胁迫培养：将反应罐内反应温度降低至25℃，同时通过蠕动泵将20％浓度的双氧水匀速流加至反应罐内，至反应罐内双氧水的终浓度达到7.5mmol/L，继续培养5小时。
步骤d、酿酒酵母固态厌氧培养：步骤c完成后的发酵培养液与以豆粕和麸皮为主的固态培养基以3:8重量比混合，转移至固态发酵箱，固态发酵室温控制在31℃，发酵箱密闭不通气状态下厌氧培养26小时。
步骤e、低温烘干：步骤d获得的培养物转移至干燥装置中，采用60℃热风将培养物含水量降至12％以下。
步骤f、粉碎及包装：使用粉碎机将步骤e获得干燥酵母培养物粉碎成50目粒度，包装机封装成袋，避光存放于阴凉干燥处。
步骤a中酿酒酵母的种子培养基成分以重量百分比为：0.75％酵母浸膏，0.1％蛋白胨，0.75％豆粕粉、蔗糖1％，其余为纯化水。
步骤b中酿酒酵母的液态发酵培养基成分以重量百分比为：0.75％蛋白胨，1.75％豆粕粉、1.25％玉米粉、糖蜜3％，其余为纯化水。
步骤d中固态发酵培养基成分以重量百分比为：30％豆粕粉、5％玉米粉、65％小麦麸皮。
干燥酵母培养物甘露聚糖含量达到4.3％，水溶性蛋白达到8％。
分别取实施例一、实施例二、实施例三所制备的干燥酵母培养物，按照对照组和实验组的原则进行喂养试验。其中对照组和实验组采用配对实验设计，按照年龄、胎次、体型大小、采食量、产奶量和泌乳周期等体况相近的原则，选取泌乳期荷斯坦牛80头，分成实验组一、实验组二、实验组三和对照组(组间差异不显著)，每组20头进行饲喂对比实验，实验组一每天饲喂300克实施例一所制备干燥酵母培养物，实验组二每天饲喂300克实施例二所制备干燥酵母培养物，实验组三每天饲喂300克实施例三所制备干燥酵母培养物，对照组不喂食酵母培养物，其余条件相同。喂养一个月后，进行产奶量比较。
由表1可知，实验前各组平均产奶量无显著差异。实验后期，实验组一、实验组二和实验组三产奶量高于对照组1.12～1.14kg/头﹒天。酵母培养物导致采食量增加，从而提高日产奶量。
表1产奶量比较
表2体细胞比较
牛奶中的体细胞不仅能反映出乳的品质，还直接反映出奶牛乳房的健康状况等，如表2所示，通过饲喂高含量甘露聚糖酵母培养物可以有效的减少体细胞，提高了奶牛机体免疫力，乳房炎病例发生率显著下降，有效降低了牧场因乳房炎和抗生素使用带来的负面影响和损失。
通过上述奶牛高含量甘露聚糖酵母培养物饲喂实验可以看出，最为明显的改善主要体现在两方面：第一，泌乳量显著增加，每头奶牛每天平均产奶量增加1.14公斤(1～2公斤)，经济效益显著；第二，体细胞显著下降，乳房炎病例发生率明显减少，有效降低了牧场因乳房炎和抗生素使用带来的负面影响和损失，奶质得以提升，利于饮用者健康。