一株库德毕赤酵母诱变菌株及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及到一株库德毕赤酵母诱变菌株及其应用。

背景技术：

工业发展导致水域污染逐年加重，重金属污染由于其强蓄积性、难降解、沿食物链富集等特点，成为威胁人类健康的重要污染物之一。镉污染是典型的重金属污染，长期食用遭到镉污染的食品，可能导致“痛痛病”，身体积聚过量的镉损坏肾小管功能，造成体内蛋白质从尿中流失，久而久之形成软骨症和自发性骨折。水域污染使得水产品、农产品中重金属污染严重，威胁着人类的健康。

微生物吸附技术作为一种新兴的重金属处理技术，因其来源丰富、成本低、安全无毒、选择性好、可再生等优势，备受研究者青睐。

库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，又称东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，是食品中较为常见的酵母菌，已在红酒、中国白酒、酸奶、开菲尔、雪莲菌、腌制冬瓜等多种发酵食品中分离鉴定。库德毕赤酵母具有抗高温、高渗透压、高浓度盐、强酸等多种优良性能，有利于其工业化应用。目前对库德毕赤酵母的研究，主要集中在乙醇、木糖酸、琥珀酸的生产，植酸盐、有机酸、醛类的降解以及生物脱色等领域。本研究小组的初期研究发现，其在重金属脱除方面表现出比现有研究的酿酒酵母、鲁氏酵母更为出色的性能，可应用于重金属污染的脱除。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株库德毕赤酵母诱变菌株，具有重金属高吸附性和高抗性的特性，能够广泛应用于重金属的高效脱除。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案是：

一株库德毕赤酵母诱变株YB5(Pichia Kudriavzevii)，已于2016年的10月31号保藏于北京市朝阳区中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.13221。

库德毕赤酵母诱变株YB5(CGMCC NO.13221)的生长温度范围为28-30℃；生长PH范围为5-7，最适生长PH为6。

所述库德毕赤酵母诱变株YB5能够应用于重金属的脱除。

所述库德毕赤酵母诱变株YB5能够应用于水体、工厂排放污水、废水中的重金属脱除。

所述库德毕赤酵母诱变株YB5能够应用于液体物料中的重金属脱除。

所述库德毕赤酵母诱变株YB5能够应用于食品料液中的重金属脱除。

所述库德毕赤酵母诱变株YB5能够应用于海洋生物料液中的重金属脱除。

本发明的有益效果是：本发明诱变筛选得到的一株重金属抗性和重金属吸附性能提高的库德毕赤酵母，其在高重金属浓度条件下的抗性与吸附性均得到大幅提高，使得库德毕赤酵母在应用过程中的重金属适应浓度范围增大，吸附性能提高利于提高其重金属脱除过程中的脱除效率，抗性的提高有利于其工业化应用过程中的多次重复性利用；库德毕赤酵母诱变株YB5在Cd²⁺浓度为15mg/l的培养基中Cd²⁺脱除率是74.71％，相较于未诱变的库德毕赤酵母，脱除率提高了16.69％，在砷浓度为15mg/l的培养基中脱除率为58.42％，相较于未诱变的库德毕赤酵母，脱除率提高了19.20％，与此同时，诱变株YB5的生物量均高于未诱变的库德毕赤酵母，表明其重金属抗性获得提高。综上，本发明所提供的库德毕赤酵母诱变株YB5具有较好的重金属抗性及重金属吸附性能，工业化应用价值极大。

附图说明

图1为多株库德毕赤酵母诱变株的24h正常培养生长状况图；

图2为多株库德毕赤酵母诱变株在含Cd²⁺的培养基中培养24h的镉抗性结果图；

图3为多株库德毕赤酵母诱变株在含Cd²⁺的培养基中培养24h的镉吸附性结果图；

图4为库德毕赤酵母诱变株YB5(CGMCC NO.13221)的遗传稳定性结果图。

具体实施方式

以下实施例中所用YPD固体斜面培养基为：蛋白胨20g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L。

以下实施例中所用YPD液体培养基为：蛋白胨20g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1L。

以下实施例中的菌株生长状况以生物量为评价标准，生物量采用干重法：将在不同实验条件下取样后的酵母菌培养液4000r/min离心5min，菌体用超纯水洗涤两遍，将离心管置于80℃烘箱中烘干至恒重后称重，计算干重M(g/L)。

以下实施例中的重金属抗性以菌株在含重金属液体培养基中的生物量为评价标准，生物量采用干重法：将在不同实验条件下取样后的酵母菌培养液4000r/min离心5min，菌体用超纯水洗涤两遍，将离心管置于80℃烘箱中烘干至恒重后称重，计算干重M(g/L)。

以下实施例中的重金属吸附性以菌株在含重金属液体培养基中培养24h后，培养基中重金属的脱除率为评价标准：将在不同实验条件下取样后的酵母菌培养液4000r/min离心5min，取上清液，加入一定体积的混合酸(浓硝酸与高氯酸体积比为4：1)，加热使其充分消化，适当稀释后使用原子吸收分光光度计测量其中的重金属浓度，并计算脱除率R。

R＝(C₀-C_t)/C₀×100％

式中：R为重金属脱除率；

C₀为培养前YPD中重金属离子浓度；

C_t为培养后YPD中重金属离子浓度。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

以下实施例中所用的库德毕赤酵母出发菌株是实验室分离得到的菌株Y16。

实施例1：

利用紫外诱变产生一株高重金属抗性及吸附性的库德毕赤酵母诱变菌株，包括以下步骤：

步骤1

将出发菌株Y16进行紫外线诱变，包括以下步骤：

(1)制备菌悬液

斜面活化：将4℃保藏的菌株接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；

液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；

液体扩大培养及菌悬液的制备：取活化后的种子液，接种到液体培养基中，震荡培养10h，用生理盐水稀释至10^-5倍得到菌悬液。

(2)制备梯度平板及涂布

梯度平板制备：梯度平板由两层培养基构成，首先在灭菌平板上倒入10ml YPD固体培养基作为底层，将平板一端垫高约4mm，静置，待平板凝固后，放平，倒入第二层，第二层为浓度为25mg/l的含Cd²⁺的YPD固体培养基。

涂布：取0.2ml菌悬液，涂布在制备好的梯度平板上。

(3)诱变过程

打开涂布好的平板，置于紫外灯下垂直距离20cm处，照射时间50s进行紫外诱变。

(4)突变株的初次筛选

诱变结束后，盖好平皿，避光培养3d，于梯度平板中镉浓度较高的一侧挑去镉抗性较高的菌株接种到YPD斜面上保存为诱变菌株，进行后续的性能评价。图1，可以看到诱变菌株除8号外均生长良好。对获得的多株诱变菌株在固定浓度的含镉培养基中培养，考察其镉抗性及镉吸附性，综合结果显示，4、5、6、9、10号，共5株菌表现良好。因此，对这几株菌在10～20mg/l Cd²⁺浓度培养基中进一步考察不同Cd²⁺浓度下的抗性及吸附性，结果如图2-3所示，可以看到5号菌株在不同Cd²⁺浓度培养基均表现出优于出发菌株的抗性和吸附性，并且，从图4的遗传稳定性结果中，可以看出5号菌株的这种高重金属吸附性在传代过程中能稳定的遗传表达，因此选择5号菌株进行后续实验，并将其命名为YB5。

步骤2

诱变菌株库德毕赤酵母YB5(CGMCC NO.13221)的生长状况、镉抗性、镉吸附性、砷抗性、砷吸附性评价。

斜面活化：将4℃保藏的诱变菌株YB5接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；

液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；

种子液分别接种到含Cd²⁺、砷浓度为0、10、15、20mg/l的YPD培养基中，固定初始菌浓度为8×10⁶个/ml(取活化好的种子液，稀释40倍，血球计数法进行计数。根据计数结果，取一定体积种子液进行接种)，于28℃、180r/min下振荡培养，24h时测定其生物量及镉脱除率。

对比例1：

出发菌株库德毕赤酵母Y16的生长状况、镉抗性、镉吸附性、砷抗性、砷吸附性评价。

斜面活化：将4℃保藏的出发菌株库德毕赤酵母Y16接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；

液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；

种子液分别接种到含Cd²⁺、砷浓度为0、10、15、20mg/l的YPD培养基中，固定初始菌浓度为8×10⁶个/ml(取活化好的种子液，稀释40倍，血球计数法进行计数。根据计数结果，取一定体积种子液进行接种)，于28℃、180r/min下振荡培养，24h时测定其生物量及镉脱除率。

实施例1与对比例1的结果如表1、表2所示，结果当Cd²⁺浓度为15mg/l时，诱变菌株YB5较出发菌株Y16优势明显，YB5镉抗性为1.27±0.0627g/l而出发菌株Y16镉抗性仅为0.69±0.1272g/l，同时YB5的镉脱除率为74.71±0.0088％，相较于Y16的镉脱除率58.02±0.0097％，提高了16.69％；诱变菌株YB5对于砷的抗性和吸附性也有优于出发菌株Y16的效果，在砷浓度为15mg/l时，YB5镉抗性为2.91±0.0416g/l而出发菌株Y16镉抗性仅为1.82±0.0291g/l，同时YB5的镉脱除率为58.42±0.0169％，相较于Y16的镉脱除率39.22±0.0085％，提高了19.20％。

表1诱变菌株与出发菌株的生长状况、镉抗性、镉吸附性能对比

表2诱变菌与出发菌的生长状况、砷抗性、砷吸附性能对比

实施例2

诱变菌株库德毕赤酵母YB5脱海参肠酶解液中的重金属

1)诱变库德毕赤酵母YB5的培养及酵母菌泥的制备

斜面活化：将4℃保藏的诱变菌株接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；

液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；

扩大培养：取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到YPD液体培养基中28℃、180r/min培养20h。

收集菌泥：扩大培养20h后，使用血球计数板定量。取一定体积的酵母菌悬液离心，弃上清液，用无菌水清洗两次，得到菌泥备用。

2)固定化酵母凝胶球的制备

将步骤1)得到的酵母菌泥与1％海藻酸钠溶液和明胶溶液混合均匀，滴加到2.5％氯化钙 溶液中。静置20min固定后，无菌水清洗2～3遍，得到固定化酵母凝胶球。

3)海参肠酶解液的制备

海参肠去沙洗净，加入质量分数为3‰的木瓜蛋白酶，料液比为1:5，55℃下酶解5h。酶解完后煮沸3～5min，灭酶。得到海参肠酶解液。

4)酶解液中重金属的脱除

将步骤2)得到的固定化诱变库德毕赤酵母凝胶球加入到步骤3)中得到的海参肠酶解液中，每30ml酶解液中加入10ml酵母菌悬液制成的固定化诱变库德毕赤酵母凝胶球。28℃，150rpm吸附2h。吸附结束后，采用过滤的方法将固定化诱变库德毕赤酵母凝胶球与物料分离，并对其进行湿法消解，测重金属含量。

取一定体积的海参肠酶解液进行湿法消解，测重金属含量，从而算出脱除率。

结果如下表3所示：

表3海参肠酶解液经过诱导库德毕赤酵母吸附脱除重金属前后对比

对比例2

出发菌株库德毕赤酵母脱海参肠酶解液中的重金属

1)出发菌株库德毕赤酵母Y16的培养及酵母菌泥的制备

斜面活化：将4℃保藏的出发菌株接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；

液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；

扩大培养：取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到YPD液体培养基中28℃、180r/min培养20h。

收集菌泥：扩大培养20h后，使用血球计数板定量。取一定体积的酵母菌悬液离心，弃上清液，用无菌水清洗两次，得到菌泥备用。

2)固定化酵母凝胶球的制备

将步骤1)得到的酵母菌泥与1％海藻酸钠溶液和明胶溶液混合均匀，滴加到2.5％氯化钙 溶液中。静置20min固定后，无菌水清洗2～3遍，得到固定化酵母凝胶球。

3)海参肠酶解液的制备

海参肠去沙洗净，加入质量分数为3‰的木瓜蛋白酶，料液比为1:5,55℃下酶解5h。酶解完后煮沸3～5min，灭酶。得到海参肠酶解液。

4)酶解液中重金属的脱除

将步骤2)得到的固定化出发库德毕赤酵母凝胶球加入到步骤3)中得到的海参肠酶解液中，每30ml酶解液中加入10ml酵母菌悬液制成的固定化出发库德毕赤酵母凝胶球。28℃，150rpm吸附2h。吸附结束后，采用过滤的方法将固定化出发库德毕赤酵母凝胶球与物料分离，并对其进行湿法消解，测重金属含量。

取一定体积的海参肠酶解液进行湿法消解，测定重金属含量，从而算出脱除率。

结果如下表4所示：

表4海参肠酶解液经过出发菌株库德毕赤酵母Y16吸附脱除重金属前后对比

从上述实施例和对比例中可以看出，经过紫外诱变的库德毕赤酵母，无论是在水环境中还是在食物物料中，都呈现出较出发库德毕赤酵母更高的重金属脱除率，库德毕赤酵母诱变株YB5在Cd²⁺浓度为15mg/l的培养基中Cd²⁺脱除率是74.71％，相较于未诱变的库德毕赤酵母，脱除率提高了16.69％，在砷浓度为15mg/l的培养基中脱除率为58.42％，相较于未诱变的库德毕赤酵母，脱除率提高了19.20％，与此同时，诱变株YB5的生物量均高于未诱变的库德毕赤酵母，表明其重金属抗性获得提高；可见本发明提供的诱导库德毕赤酵母能显著提高重金属的脱除率，并适合应用到复杂的食品环境中脱除重金属。