与中国山羊产奶性状相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与中国山羊产奶性状相关的SNP分子标记、以及检测中国山羊产奶性状的方法。

背景技术：

单核苷酸多态性标记(SNP)主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、插入和缺失等。SNP的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA芯片、飞行时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。

山羊是一种很早就被驯化的家畜，为人类文明的发展作出了重大贡献，在驯化过程中，形成了多种多样的品种，且表型差异很大，如毛色、体型、繁殖力、泌乳能力等。借助高通量技术寻找影响表型性状的特定的基因组区域已成为动物遗传学领域研究的热点。虽然我国的羊奶产量逐年增长，但是羊奶在奶类中所占的比例反而处于下降趋势，说明奶山羊育种工作力度有待加强。

真核翻译起始因子4γ1(eukaryotic translation initiation factor 4gamma 1，EIF4G1)，主要参与RNA的转运过程，可与真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，EIF4E)互作，影响mTORC1介导的mRNA翻译的起始，而翻译的起始是对于乳蛋白合成至关重要的mTOR信号通路的核心部分，因此该基因的突变可能会影响山羊的产奶性状。

鉴于此，本发明利用奶山羊引进品种和中国奶山羊培育品种进行全基因组扫描和产奶性状关键基因的定位，发现EIF4G1基因座位的多态性变异对奶山羊引进品种和中国奶山羊培育品种产奶性状的影响达到全基因组显著水平，为培育具有强泌乳能力的专门化奶山羊品种提供理论基础。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种辅助鉴定中国山羊产奶性状的SNP标记及其应用。

本发明的另一个目的是提供用于检测与中国山羊产奶性状相关的SNP标记的引物及含有该引物的试剂盒。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种与中国山羊产奶性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于山羊第1号染色体第81243942bp处，该SNP分子标记的多态性为A/G。

发明人对引进奶山羊和中国培育奶山羊品种及来自不同地区和品种的中国非奶用山羊进行了大量的基因型与产奶性状相关性研究，发现本发明所提供的SNP位点在不同泌乳能力的山羊群体中基因频率差异显著。等位基因A在奶山羊中的频率均在72％以上，而在非奶用山羊中该等位基因频率均在8％以下，在非奶用山羊品种之一的辽宁绒山羊中最低，为0％，这对于通过基因型区分和筛选不同泌乳能力的中国山羊具有较大的指导意义。当中国山羊的基因型为AA时该山羊泌乳能力较强，当中国山羊的基因型为GG时可以判定山羊泌乳能力差，不适于作为奶用山羊进行早期选育，可以加速奶用山羊的育种进程。

本发明还提供了用于检测本发明所述SNP分子标记的特异性引物，包括：

正向引物：5’-CTCAGTTCCATCACGGGGTC-3’；(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-CTGCGAAAGGTGTGTGTTCC-3’(SEQ IDNO.3)。

本发明提供了所述SNP分子标记在中国山羊育种中的应用。

本发明提供的与中国山羊产奶性状相关的SNP分子标记在中国山羊分子标记辅助育种中的应用属于本发明的保护范围。

本发明提供了所述SNP分子标记在鉴定中国山羊产奶性状中的应用。

本发明提供一种检测中国山羊产奶性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测山羊基因组DNA，以其为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；

(2)检测扩增产物片段的第219bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则待测山羊泌乳能力较强，其为奶用山羊，若碱基种类为G，则判定待测山羊泌乳能力差，为非奶用山羊；

所述特异性引物包括：

正向引物：5’-CTCAGTTCCATCACGGGGTC-3’；

反向引物：5’-CTGCGAAAGGTGTGTGTTCC-3’。

其中，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA 2μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，余量为双蒸水。

其中，步骤(1)中PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃保温10分钟。

本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行，优选的，可以利用Sanger测序或飞行质谱分型等方法来检测待测中国山羊品种的基因型。

本发明还提供了含有本发明所述特异性引物的辅助鉴定中国奶用山羊的试剂盒。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

进一步，本发明提供了上述试剂盒在中国山羊育种中的应用。

本发明提供了上述试剂盒在鉴定中国奶用山羊中的应用。

本发明所述的特异性引物还可以与其他用于中国山羊产奶性状检测的特异性引物相结合用于中国山羊分类和育种研究。

本发明的与中国山羊产奶性状相关的SNP标记及其应用具有如下优点：

(1)本发明提供的分子标记不受中国山羊品种、年龄等限制，可用于中国山羊产奶性状的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国奶用山羊品种的育种进程。

(2)检出中国山羊品种EIF4G1基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便。

(3)中国山羊品种EIF4G1基因的SNP位点的检出，为中国山羊产奶性状的标记辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1为三种基因型测序峰图；其中，(a)为AA型；(b)为GG型；(c)为AG型。

图2为崂山奶山羊EIF4G1基因座位的SNP位点分型结果与日均产奶量进行差异显著性检验结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1山羊不同基因型与产奶性状的全基因组分析

对引进和中国培育品种共17份奶山羊以及中国59份非奶用山羊的全基因组重测序数据进行奶山羊-非奶用山羊的全基因组扫描分析，发现位于绵羊第1号染色体第81243942碱基对的SNP与产奶性状最为密切相关(费雪检验P<0.001)。

实施例2中国山羊EIF4G1基因多态性位点的鉴定

1、提取待测山羊品种的基因组DNA

采集来自中国各地方62只奶山羊(包括20只来自黑龙江绥棱县的吐根堡奶山羊，42只来自山东青岛的崂山奶山羊)和70只非奶用山羊(包括18只来自辽宁的辽宁绒山羊，14只来自新疆的南疆绒山羊，19只来自西藏的班戈白绒山羊，19只来自西藏的日土白绒山羊)的血样，采用常规的方法提取血液中的基因组DNA。

2、扩增含SNP位点的核苷酸片段

针对实施例1中筛选到的EIF4G1基因座位的SNP位点，根据NCBI数据库收录的EIF4G1基因座位(Gene ID:102183267)的序列设计引物，包括正向引物F：5’-CTCAGTTCCATCACGGGGTC-3’和反向引物R：5’-CTGCGAAAGGTGTGTGTTCC-3’，以1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示。该SNP位点位于PCR扩增片段的219bp处，此处碱基为A或G。

其中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA 2μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各0.5μl，2×Taq PCRMasterMix 12.5μl，余量为双蒸水。

其中PCR反应的条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃保温10分钟。3、检测PCR扩增片段，获得SNP标记

对2中的PCR扩增产物进行Sanger测序检测，如果扩增产物序列中第219bp处的碱基为A，则待测中国山羊泌乳能力较强，属于奶用山羊。山羊DNA样品三种基因型的Sanger测序峰图如图1所示。个体基因型可分为AA型，GG型和AG型。三种基因型的分型结果如图1所示。

实施例3对132只引进及中国山羊的EIF4G1基因座位的多态性位点进行扩大群体分析

按照实施例2提取62份奶山羊和70只非奶用山羊的基因组DNA样品采用实施例2的特异性引物进行PCR检测，再进行基于Sanger测序的基因型分型检测。70只非奶用山羊分别是辽宁绒山羊，南疆绒山羊，班戈白绒山羊，日土白绒山羊；62只奶山羊分别是吐根堡奶山羊，崂山奶山羊。EIF4G1基因如SEQ ID NO.1所示序列的219bp位点的基因型分型结果如表1所示。该SNP位点在奶山羊中的等位基因A的频率均高达72％以上。非奶用山羊中该等位基因A的频率均低于8％，在非奶用山羊品种之一的辽宁绒山羊中为0％(如表1所示)。运用Fisher exact test在线软件进行的费雪精确检验显示，等位基因A在奶山羊中的频率极显著高于在非奶用山羊中的频率(p＝4.44e-29)。表明了该SNP位点的等位基因A与中国山羊产奶性状的相关性。

表1 EIF4G1基因的SNP位点在山羊品种中的基因型频率

实施例4对42只中国崂山奶山羊的日均产奶量与EIF4G1基因座位的多态性位点关联分析

按照实施例3对42只中国崂山奶山羊EIF4G1基因座位的SNP位点分型结果与日均产奶量进行差异显著性检验，结果见图2。根据42只中国崂山奶山羊对该SNP位点的分型结果，26只为AA基因型，16只为AG基因型。该SNP位点AA基因型个体的日均产奶量显著高于AG基因型个体(P＝0.021)，平均增高(0.465±0.194)kg/d。

上述来源于不同地方的引进及中国山羊品种产奶性状鉴定结果表明，山羊产奶性状基因型判定可以通过chr1：81243942bp位点的多态性判定实现。利用分子标记检测确定山羊产奶性状可以加快选育具有较强泌乳能力的山羊，节省了育种时间，使得快速获得具有纯合强泌乳能力基因型的优良山羊种质资源成为可能。

上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>与中国山羊产奶性状相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP161117119.4

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213>山羊

<400> 1

ctcagttcca tcacggggtc tcagtggccc agacacgtgg cactaataag aagtcatcat 60

tggaaagcat aacccctcac actgtccccc ccctcagtcc cagcctcaaa ctcactgatg 120

ggtgggcctg gagggccacc tcgacgcttg tcactgccct tggccattag ctgctgcact 180

tttatgtgct cccgatgctc ctccatctca gcttccttrt ggatttggtc aattgtcttg 240

ggaccctggt cccctcggcg tggcacccag ttgctctgtg ggacaagcca gtcacagggt 300

aattacatca gagaagacca gaccagtgtc aggaagtggg ggctgtgggg tcagaggcag 360

cagactgaca gtggaaaaga gggaacacac acctttcgca g 401

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ctcagttcca tcacggggtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

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