本发明涉及分子遗传学技术领域，具体而言，涉及一种鸽性别分子鉴定方法及所用引物对。
背景技术：
随着国内人民生活水平，消费水平的提高，鸽肉的营养、药用价值越来越被人所认知。所以近年来，对于投资少，周期短，见效快，效益高的养殖肉鸽产业在全国已经悄然兴起。这其中以体型硕大，生长发育快，繁殖力强的美国王鸽最为养殖者青睐。美国白羽王鸽又叫皇鸽或者k鸽，原产地美国新泽西州，于19世纪培养的优良肉用品种。该品种在较好的管理情况下，一对种鸽年产蛋约9窝，约8对的雏鸽。但初生雏鸽不能独立生活，体型很小，与其他家禽不同，无法进行早期性别鉴定，而成年白羽王鸽胴体全身毛羽纯白，雄鸽和雌鸽体态特征差别甚微，无法通过体型自鉴。并且鸽属于晚成鸟，没有外生殖器，即使是专业的技术人员通过翻肛鉴别性别，不仅对雏鸽产生伤害，而且识别率不高，鉴定异常困难。在蛋鸽的养殖业中，随着双母拼对技术的产生，公雏作用不大，只需作为乳鸽上市，既可以趁早进行性别分群，区别饲养，减少饲料浪费，节约养殖成本，还可提高经济效益，这种生产模式已得到大规模运用。因此，通过分子生物学方法准确，可靠地鉴定早期雏鸽性别已迫在眉睫，并且具有十分重要的意义。王嘉力等人在家鸡CHD1基因PCR快速性别鉴定方面取得了很大进展。其实验结果显示CHD1基因PCR法可稳定、准确地用于鉴定家鸡性别，该体系经改进和优化后，缩短了鉴定时间，提高了鉴定的稳定性和准确性。在此基础上利用12.5日龄鸡胚羊水和尿囊液建立了早期胚胎的性别鉴定体系，该方法为家鸡早期胚胎性别鉴定批量化的快速操作提供了可行的依据，同时也为鸟类性别决定机制的研究奠定了基础。胡艳等在中国地方家鸭ZW性染色体上CHD1基因序列差异的检测，旨在发掘一种能高效和快速检测鸭ZW性染色体上CHD1基因序列差异的方法，以解决鸭产业中胚胎期无损伤性别鉴定、胚胎期性别人工鉴定误判和新生期翻肛鉴别损伤等技术问题，检测中国地方家鸭ZW性染色体上CHD1基因序列差异的方法直观可靠，同时也为中国地方家鸭的性别分子生物学鉴定提供了一个高效准确的分子遗传标记。然而目前本领域关于鸽子性别的分子鉴定的相关研究还很少。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种鸽性别分子鉴定方法及所用引物对，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于鸽性别分子鉴定的引物对，其上游引物和下游引物的碱基序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
由于初生雏鸽不能独立生活，体型很小，与其他家禽不同，无法进行早期性别鉴定，而成年白羽王鸽胴体全身毛羽纯白，雄鸽和雌鸽体态特征差别甚微，无法通过体型自鉴。并且鸽属于晚成鸟，没有外生殖器，即使是专业的技术人员通过翻肛鉴别性别，不仅对雏鸽产生伤害，而且识别率不高，鉴定异常困难。因此，提供一种行之有效的鸽性别的分子鉴定方法就显得尤为重要。
本发明提供的引物对特异性好，扩增效率高，可很好的用于鸽子性别的分子鉴定。DNA分子鉴定方法不受发育时间及组织特异性的影响，用于鸽子的性别鉴定可以得到常用方法无法获得的可靠的鉴定信息。且具有快速、高通量、准确的优点。
一种鸽性别的分子鉴定方法，包括以下步骤：
1)、提取待测对象的DNA作为模板并用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物进行PCR扩增；
2)、将步骤1)中PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳并通过电泳结果鉴定鸽性别。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，所述步骤1)中，DNA提取自待测对象的羽毛的毛囊。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，毛囊DNA的提取步骤包括：
采集羽毛，取羽根部位并剪碎，经裂解缓冲液和蛋白酶K预处理后，用苯酚氯仿法抽取DNA。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，采集得到的羽毛放入生理盐水或无水乙醇中冷藏保存。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，当羽毛样品量较少时，将裂解缓冲液和蛋白酶K预处理后得到的含DNA的混合液直接用于后续的PCR反应；
或将裂解缓冲液和蛋白酶K预处理步骤替换为用Chelex 100作为介质溶解消化毛囊DNA。
本发明采用羽毛非损伤法提取DNA而没有提取组织DNA，有效减少了对雏鸽的应激、损伤，但羽毛提取DNA法应注意以下问题：第一，采样时应避免高温下进行，否则毛根处容易失去水分凝固，导致DNA降解，提取难度加大，影响后续试验，所以采样后应及时放入生理盐水或者无水乙醇中冷藏保存；第二，消化羽毛时，将羽毛剪碎有助于消化效果，因由于羽毛中85％～90％为角蛋白，其中含有难以被蛋白酶K破坏的二硫键，故可以适当加入DTT于消化液中破坏二硫键，使其蛋白酶K发挥更好的作用，但本发明中没有加入DTT仍然获得了较好的PCR产物，所以雏鸽羽毛提取DNA不需要加入DTT；第三，在羽毛较少时，可以用Chelex 100作为介质溶解消化毛囊DNA或者裂解后含DNA的混合液直接用于PCR反应，这样就减少反复抽提和沉淀中DNA的损失过多。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，在步骤1)所述PCR扩增的反应体系中，上游引物和下游引物的浓度为7～13μM，DNA模板的浓度≥100ng/μl。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，在步骤1)所述PCR扩增的反应程序中，退火温度为50℃～58℃，反应循环次数为30～40个循环。
通常PCR扩增时的退火温度为40℃～60℃。退火温度是由引物的Tm值来决定的，在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。本发明所采用的引物退火温度为50℃～58℃，具有较高的特异性。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，在步骤2)中，所述琼脂糖凝胶电泳采用的为1.5％～2.5％的琼脂糖凝胶。
优选的，如上所述的鸽性别的分子鉴定方法，在步骤2)的电泳结果中，同时扩增出482bp和380bp目的条带的模板对应的为雌性鸽子；只扩增出482bp目的条带的模板对应的为雄性鸽子。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明根据鸡性染色体W和Z上CHD1基因的同源序列先后设计多对引物，通过摸索成功获得1对引物。对其99只待定白鸽雏鸽进行性别鉴定，结果与生理解剖后比对，正确率为94％。为今后摸索准确率更高的位点提供试验参考依据，意在为养殖场进行分群，淘汰雄鸽提供了稳定可靠的科学鉴定方法，同时也对鸟类性别决定机制研究进一步探索提供依据，扩大PCR法鉴定鸟类性别的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为10只雏鸽CHD1样本基因PCR扩增结果；1、2、6、8、10泳道为雌性；3、4、5、7、9为雄性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、材料与方法
1.1供试材料
本发明所用雏鸽样本均采自湖南岳阳全民鸽业有限公司，随机抽取待测性别的117只白羽王鸽雏鸽的带毛囊的羽毛。为了不使毛囊干燥，保证DNA的提取质量，我们采取了在放置羽毛的离心管中预先加入生理盐水的办法，然后将采集的羽毛放置到离心管中，使毛囊与生理盐水接触，保持湿润。采集羽毛样品后，给每一个鸽子带上脚环，做好记录，然后将采样的117只雏鸽屠宰，其中99只能鉴定出性别，另外18只未能获得准确的性别记录，为使实验准确，决定弃用这18只。
1.2主要仪器与设备
PCR仪(PTC-100)、制冰机(SIM-F124)、超纯水器(MAXIMA SC)、无菌操净台(AIRTECH)、高速冷冻离心机(eppendorf-5417R)、各式规格移液枪、分析天平(GB303)、格兰仕微波炉(WD800B)、恒温干燥箱(101A-2)、稳压稳流电泳仪(DYY-III-6B)、各式电泳槽、凝胶成像系统(PlandCA91786)、紫外可见分光光度计(UV-1200)、脱色摇床(WD-9405A)、真空冷冻干燥仪。
1.3主要药品和试剂
苯酚、氯仿、Tris碱、SDS、异戊醇、无水乙醇、EDTA、EB、琼脂糖、硝酸、溴酚蓝、乙酸、NaCl、硫代硫酸钠、NaOH、KC1、盐酸、DNAMarkers及载样液、蛋白酶K、dNTPs。
1.4主要分子生物学分析工具
软件引物设计软件:Premier 5.0，Oligo 6.0；序列分析软件:DNAStar6.0；NCBI Blast：登录GenBank：http://www.ncbi.nlm.nih.gov，应用BLAST工具将获得的序列与GeneBank数据库中的已有序列进行比对；序列比对分析:ClustalWl.7；数据统计分析软件:SAS 9.0。
1.5试验方法
1.5.1毛囊基因组DNA的提取
①取3-5根雏鸽羽毛，用双蒸水冲洗后，无水乙醇浸洗，室温干燥，剪取羽根剪碎约0.5cm，置于12.5mL灭菌离心管中；
②加入0.5-lmL裂解缓冲液和蛋白酶K(10mg/mL)10-20μL，使细胞破裂，释放出DNA；
③55℃空气浴振荡过夜消化至含白色飘絮沉淀的透明液体；
④加入等体积(0.5-1mL)饱和酚，萃取溶液中的有机物，充分摇匀后静置5min，1.2万r/min离心10min，重复1-2次，以界限处看见白色蛋白质为准，取上清液待用；
⑤根据取得的上清液体积加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)0.5mL抽提，分离DNA和蛋白质，将溶液充分摇匀后静置5min，1.2万r/min离心10min，取上清液，若还有蛋白质，可重复，一般抽提两次；
⑥将上清液加两倍体积的冰预冷的无水乙醇约l-2mL，使DNA析出，约lmL，轻轻颠倒混匀至出现白色絮状沉淀，即为DNA；
⑦1.2万r/min离心5min，轻倒掉乙醇后倒置挥发，自然干燥或置于4℃冰箱；
⑧待乙醇挥发完后加入TE缓冲液200uL或双蒸水，置于55℃水浴3～4h溶解DNA，-20℃保存；
⑨用Genova紫外分光光度计测定DNA样品在260nm和280nm时的光密度，计算其浓度和纯度。纯DNA的OD260/OD280比值为1.8-2.0，1OD260值相当于50ug/mL双链DNA；
⑩取部分母液，用TE或双蒸水稀释成100ng/uL工作液，备用。
1.5.2引物的设计与合成
因为鉴定性别，所以首先考虑到性染色体上的基因。CHD1基因是已知的值得关注的研究对象。但NCBI－GenBank中没有鸽子的CHD1基因序列，故通过NCBI在线BLAST序列比对，所以根据鸽子与鸡的亲缘关系较近，在Genbank中选取鸡CHD1Z(AC186875.2)和CHD1W(AC177807.2)基因的序列，并进行了Blast同源性比对，目的是为了选取这两个基因在动物物种中的保守区段，提高在鸽子DNA中基因扩增的成功率。对获得的保守序列使用Primer 5.0，Oligo 6.0软件共设计了6条引物，交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。对于这6对引物将逐一进行条件优化和DNA扩增，以筛选合适的引物进行研究。引物序列如表1。
表1试验中选用的引物信息
2结果与分析
2.1羽毛提取DNA的浓度及纯度鉴定
从117个DNA样品中随机抽取5个样本进行DNA琼脂糖电泳检测，由表2可以看出从羽毛中提取的DNA的样本OD260/OD280都约为2，说明DNA纯度很好，可以用于PCR扩增试验。
表2样本DNA浓度和纯度
2.2 PCR扩增结果筛选引物
用设计的6条引物对鸽DNA进行PCR扩增，通过对PCR条件的优化，将PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，最终筛选出一条最理想的引物，为引物A，其上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.2.1 PCR反应体系
总体积20uL，其中Mix 10uL，ddH2O 8uL，上下游引物各0.5ul(浓度为10μM)，DNA模板(100ng/ul)1ul。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃-58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延伸10min后4℃保存。
2.2.2 PCR电泳检测
用移液器吸取每个待检PCR产物约10uL，混匀后在2％的琼脂糖凝胶上点样，点5uL l000bpDNA Markers作为参照。将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果如图1所示。雌性有2条带，为ZW型，雄性只有一条带，为ZZ型，与已知鸽性别相符合。
2.3雏鸽PCR方法性别鉴定结果
应用引物A对99只已知性别的雏鸽进行PCR扩增，比较结果如表3。结果发现该方法正确率为94％，没有达到预期100％。说明该方法还可作进一步研究。
表3屠宰鉴定法与分子鉴定法对鸽性别进行判定结果的比较
3分析与讨论
3.1样本消化
本发明采用羽毛非损伤法提取DNA而没有提取组织DNA，有效减少了对雏鸽的应激、损伤，但羽毛提取DNA法应注意以下问题：第一，采样时应避免高温下进行，否则毛根处容易失去水分凝固，导致DNA降解，提取难度加大，影响后续试验，所以采样后应及时放入生理盐水或者无水乙醇中冷藏保存；第二，消化羽毛时，将羽毛剪碎有助于消化效果，因由于羽毛中85％～90％为角蛋白，其中含有难以被蛋白酶K破坏的二硫键，故可以适当加入DTT于消化液中破坏二硫键，使其蛋白酶K发挥更好的作用，但本发明中没有加入DTT仍然获得了较好的PCR产物，所以雏鸽羽毛提取DNA不需要加入DTT；第三，在羽毛较少时，可以用Chelex 100作为介质溶解消化毛囊DNA或者裂解后含DNA的混合液直接用于PCR反应，这样就减少反复抽提和沉淀中DNA的损失过多。
3.2引物特异性分析
由于鸽子CHD基因完整序列的研究在目前为止还没有见报道，所以本发明前期参照经典的P2/8和P2550F/2718R CHD1特异性引物进行PCR扩增。结果发现经典引物所获得的产物正确率不高难以鉴定或者只有一条带，与之前研究报道相符，用聚丙烯酰胺凝胶电泳也不能分离出带型，因此无法判定性别。因为性染色体W比较保守，而Z染色体具有较高的突变性，所以在没有预测物种的完整的基因序列而以某种特定的物种设计的引物对另一物种CHD1-Z基因扩增很可能无用，或者扩增条带长度接近以致不能通过琼脂凝胶电泳区分，即使可以通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能区分出来也失去了其简便性，因此目前报道中通用引物也不能完全通用，需要重新摸索。但对于引物P2/8，平胸鸟类性染色体W上CHD基因存在Asp700I酶切位点，而CHD-Z上没有此位点，可以通过酶切分型进行性别鉴定，Sacchi等在2004年就通过此方法成功利用P8/P2组合引物PCR扩增然后用Asp700I酶切位点酶切，成功鉴别短趾雕性别。但是此方法操作繁琐、成本高，脱离了生产上要求快速、简便、低成本的目的。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 一种鸽性别分子鉴定方法及所用引物对
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcagaagca atattacaag t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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