一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的引物、试剂盒、检测方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的引物、试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术：

随着我国小麦产量的不断提高，人们对优质小麦的需求日益增大，依据小麦品质，我国将小麦分为强筋小麦、中筋小麦和弱筋小麦，弱筋小麦主要用于生产饼干、糕点和南方馒头等面制品，小麦籽粒蛋白质含量(GPC)是品质的重要指标，籽粒蛋白含量较低的小麦品种可以作为生产优质弱筋小麦制品的原料，我国优质弱筋小麦国家标准(GB/T17893-1999)规定小麦籽粒粗蛋白含量不超过11.5％。

由于籽粒蛋白质含量必须在收获后才能进行品质测试，且易受环境条件影响，因此选择效率较低，分子标记辅助选择可在DNA水平针对低蛋白质含量基因或QTL对育种材料进行选择，因而可以在苗期进行选择，并且可以克服籽粒蛋白质含量鉴定的不稳定性，降低表型评价的成本，提高弱筋小麦品质育种效率。Blanco等(2002)发现了7个控制籽粒蛋白质含量的QTL位点，分别位于4B、5A、6A、6B、7A和7B染色体上；Prasad等(1999)把控制籽粒蛋白质含量的QTL位点定位在2D染色体上；Huang(2006)等利用加倍单倍体群体，在4B和4D染色体上发现控制籽粒蛋白质含量的QTL；Li等(2007)利用含有229个和485个家系的两个重组自交系群体分别检测到3个和10个影响籽粒蛋白质含量的QTL，分别定位于2B、3A、4A、4D、5B、7A、7B和1A、1B、2A、2D、3A、4B、5A、5D、6B、7D染色体上，以目前公开的文献资料来看，控制籽粒蛋白质含量的基因或QTL较多，但单效应值不高，且常规方法只能在杂交第4代之后才能对籽粒蛋白质含量进行检查，因此增加了育种家对该性状选择的工作量，准确性和育种效率低。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的引物；

本发明的另一目的在于提供检测小麦低籽粒蛋白质含量的试剂盒；

本发明的第三目的在于提供一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的检测方法及其应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的引物，所述引物的上游引物序列如SEQ ID NO：Ⅰ所示，下游引物序列如SEQ ID NO：Ⅱ所示。

一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的检测小麦低籽粒蛋白质含量的引物。

进一步地，它还包括：10×PCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、Mg²⁺和电泳常规试剂。

一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的方法，它包括以下步骤：

S1.PCR扩增：以待测小麦的基因组DNA为模板，以上述引物进行PCR扩增，获得PCR产物；

S2.结果判断：检测步骤S1所得PCR产物的大小，按如下方法确定所述待测小麦是否为低籽粒蛋白质含量：

A.所述PCR产物中含有大小为2013bp的DNA片段，则所述待测小麦为低籽粒蛋白质含量的小麦；

B.所述PCR产物中不含有大小为2013的DNA片段，则所述待测小麦为非低籽粒蛋白质含量的小麦。

进一步地，所述大小为2013bp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：Ⅲ所示。

进一步地，所述PCR扩增的退火温度为54℃。

如上述的方法在筛选和培育低含量小麦籽粒蛋白质小麦中的应用。具体为筛选低含量小麦籽粒蛋白质的小麦品种；培育低小麦籽粒蛋白质的小麦品种。

在实际应用中，判断PCR产物中是否含有目的DNA片段时，可通过将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度具体可为1％)，看电泳图谱上是否含有目的条带，电泳图谱上含有目的条带，则PCR产物中含有目的DNA片段。

本发明具有以下优点：本发明提供了一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的引物、检测小麦低籽粒蛋白质含量的试剂盒、检测小麦低籽粒蛋白质含量的检测方法及其应用。通过对80份小麦品种的统计实验结果表明，采用引物扩增出2013bp目的条带的38份小麦品种GPC变幅为10.2％-15.2％，均值为12.6％，未扩增出2013bp的42份小麦品种GPC变幅为15.0％-19.2％，均值为16.4％，方差分析结果显示，两者达到极显著水平。可见，本发明所提供的检测小麦低GPC的方法可靠、简便、实用，在小麦种质资源评价和分子标记辅助育种中具有重要应用前景，同时为培育小麦低籽粒蛋白质含量的小麦品种提供了参考依据。本发明在育种杂交第2代即可对低籽粒蛋白质含量进行筛选，克服了常规育种只能在杂交第4代之后才能对籽粒蛋白质含量进行检查，因此减少了育种家对该性状选择的工作量，提高选择的准确性和育种效率，是一种高育效、快速的种新技术。

附图说明

图1为本发明引物分别对不同GPC含量的小麦品种进行PCR扩增的结果。其中，泳道M为DNA分子量标准，各条带由大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp；编号为1的泳道是使用本发明引物在低GPC品种川育12中扩增出2013bp的DNA片段；编号为2的泳道是使用本发明引物在非低GPC品种ZM7186中未扩增出2013bp的DNA片段。

图2为本发明引物分别对16个不同GPC高低的小麦品种进行PCR扩增的结果。其中，泳道M为DNA分子量标准，各条带由大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp；编号为泳道1-泳道20的品种分别为：ZM6352，ZM5723，ZM12064，ZM6333，藏春6号，加查帮达冬麦，白朗麦，ZM3489，W5293，川麦41，川育12，绵45，绵28白，川育20，川麦51，绵20。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：小麦籽粒GPC的测定

以表1中80份小麦品种作为实验材料，采用GB 50095-2010中所示的方法测定小麦籽粒的GPC。该GPC数据为80份小麦品种种植在两年三点间的均值，种植地力一致。

表1：小麦GPC的测定结果及PCR扩增条带

注：表中PCR扩增产物一栏中“+”表示扩增出相应的目的条带，“-”表示未扩增出相应的目的条带。

实施例2：小麦籽粒GPC相关分子标记的合成及检测方法

1、小麦GPC相关分子标记的合成

合成由序列表中序列Ⅰ和序列Ⅱ组成的引物，简称GPC-B。

引物GPC-B中上下游引物如下：

GPC-B-F(序列Ⅰ)：5’-CTACCGTACTCTCTCTGATT-3’(序列Ⅲ的第1-20位)；

GPC-B-R(序列Ⅱ)：5’-TGGATCTCGCAGCAAGTTCT-3’(序列Ⅲ的第1992-2013位的反向互补序列)。

2、利用步骤1的分子标记检测小麦GPC含量的方法

(1)PCR扩增

以小麦基因组DNA为模板，采用引物GPC-B分别进行PCR。

反应体系(20μl)：2.0μL 10×PCR buffer、50ng/μL DNA 1.0μL、2.5mmol/L总dNTPs 2.0μL、浓度为10μmol/L的上游引物(GPC-B-F)0.20μL、浓度为10μmol/L的下游引物(GPC-B-R)0.20μL、5U/μL高保真酶0.4μL、ddH₂O 13.2μL。

采用引物GPC-B进行扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性35s；54℃退火35s，72℃延伸1min30s，共循环34次；最后72℃延伸10min。

反应结束后，PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳分离，缓冲体系为1×TAE溶液，200V电压电泳25min，EB染色显影后照相统计并保存。

(2)目标条带的测序与分析

(3)根据结果判定待测小麦是否为低GPC

用引物对GPC-B检测小麦是否为低GPC：若所述PCR产物中含有大小为2013bp的DNA片段(序列Ⅲ)，则所述待测小麦为低GPC小麦；若所述PCR产物中不含有大小为2013bp的DNA片段(序列Ⅲ)，则所述待测小麦为非低GPC小麦。

实施例3：引物GPC-B用于检测小麦低GPC的有效性验证

用引物GPC-B对表1中共80份小麦品种进行了PCR分析，操作方法同实施例2中步骤二。根据PCR扩增产物的电泳结果，参照实施例2步骤二2(3)中的结果判断标准对结果进行判断。

结果如表1所示，部分小麦品种的琼脂糖凝胶检测结果如图2所示，从结果中可以看出：在这80份小麦品种中，利用引物GPC-B进行PCR扩增时均得到了大小为2013bp的目的条带(序列Ⅲ)的小麦品种有38份，GPC变幅和均值如表1所示在(10.2％-15.2％)之间均值为12.6％；有42份小麦品种未扩增出均大小为2013bp的目的条带，GPC变幅和均值如表1所示在(15.0％-19.2％)之间均值为16.4％，方差分析结果显示，两者达到极显著水品(P<0.01)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种检测小麦低籽粒蛋白质含量的引物、试剂盒、检测方法及其应用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<210> 3

<211> 2013

<212> DNA

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ctaccgtact ctctctgatt ctaaatataa gtctttttag agattccaat atggacgttg 60

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cccgtttccc ttccgcgatt acgcttcact tatggttttt ccgttctcgg ttcagcgttc 480

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gccagaagag gagtctgccg gaaatttagc tcggcattca ctcgtttcct tggcgaagct 600

ggcaagcagc cgccacttac catagatgat ctgctttgac tcgcggcgga aatgtttccc 660

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